Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie

Dit protocol biedt een algemene methode om de endocytosesnelheid van de meeste plasmamembraanproteïnen te meten door gebruik te maken van reduceerbare membraanpermeabilisatie-reagentia. In deze procedure worden celoppervlakteproteïnen die extracellulaire lysines bevatten of covalent zijn gelabeld bij 4 °C met sulfo-NHS-SS-biotine, hier in het groen weergegeven. Vervolgens worden de cellen opgewarmd tot 37 °C om endocytose van oppervlakteproteïnen mogelijk te maken. De cellen worden daarna teruggebracht naar 4 °C om membraantransport te stoppen, waarna resterende oppervlaktebiotine wordt verwijderd met behulp van een reduceermiddel dat de disulfidebinding verbreekt.

Zo blijven alleen de gebiotineerde eiwitten over die afkomstig waren van het celoppervlak, geïnternaliseerd werden en beschermd bleven tegen de stripping-procedure. Tot slot worden de cellen gesolubiliseerd en worden de gebiotineerde eiwitten geïsoleerd via strep-avidine en affiniteitschromatografie. Hallo, ik ben Luke Gabriel van het lab van Heli Milk Ian in de afdeling Psychiatrie van de University of Massachusetts Medical School.

Vandaag laten we u een procedure zien over hoe u endocytische snelheden of internalisatiesnelheden kunt meten met behulp van een reversibele biotine-elutietechniek. Wij gebruiken deze procedure om de internalisatiesnelheid van de dopaminetransporteur te meten. Laten we beginnen.

Bereid één dag voor het experiment de cellen en substraten voor gebruik voor de volgende dag. Celtypen en media zullen variëren, maar als de experimentele cellen niet sterk adherent zijn, gebruik dan een geschikt celadhesiesubstraat, zoals met polylysine gecoate weefselkweekplaten op elke zes. Label in totaal vier putjes met behulp van twee aparte platen.

Voor elk getest eiwit worden twee wells op de controleplaat gebruikt voor het totale oppervlakte-eiwit en de strippingcontroles. Bereid op de experimentele plaat een well voor voor elke internalisatieconditie die wordt getest. Zaai 1 × 10⁶ cellen in 2 mL celkweekmedium, zodanig dat de cellen de volgende dag ongeveer 80% confluent zijn.

Bereid na het kweken van de cellen de volgende oplossingen en bewaar deze bij vier graden Celsius voor gebruik op dag twee. PBS 2+ wordt bereid uit fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7.4 en aangevuld met 1.5 millimol magnesiumchloride en 0.2 millimol calciumchloride. De tonatie-quenchoplossing wordt bereid met PBS 2+ aangevuld met 100 millimol glycine. NT-buffer wordt gemaakt met 150 millimol natriumchloride, 1 millimol EDTA, 0.2% BSA en 20 millimol tris bij een pH van 8.6. RIPA-buffer wordt bereid met 10 millimol tris bij een pH van 7.4, 150 millimol natriumchloride, 1 millimol EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X-100 en 0.1% natriumdeoxycholaat.

Bereid vervolgens een voorraadoplossing van SULF N-H-S-S-S biotine door deze op te lossen in SULFOXIDE of DMSO tot een concentratie van 200 mg/mL. Bereid aliquoten van 500 µL en bewaar deze bij -20 °C. Aliquoten kunnen na deze stap meerdere vries-dooi-cycli ondergaan.

Een voorraadoplossing van tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride of TCEP wordt bereid in een concentratie van 500 millimolair, opgelost in 50 millimolair tris, waarbij de pH wordt ingesteld op 7,4. Omdat TCEP sterk zuur is, moet de pH van de oplossing worden aangepast naar 7,4; bedek de TCEP met folie voordat het wordt bewaard bij -20 °C. Bereid op de tweede dag PBS 2+ aangevuld met 0,18% glucose en 0,2% IgG protease-vrij runder serumalbumine, of PBS 2+ GBSA, en verwarm dit voor tot 37 °C in een waterbad.

Ontdooi de SFO N-H-S-S-S biotine-stamsoplossing bij kamertemperatuur. Bereid vlak voor gebruik een verse sulfur N-H-S-S-S biotine-oplossing. Vortex de oplossing krachtig om de DMSO op te lossen.

Plaats beide platen in een ijsbad in een koelkamer en spoel elke well drie keer met twee milliliters ijskoude PBS 2+, waarbij de platen onder een lichte hoek worden gehouden voor een volledige afvoer van de buffer. Voeg na de laatste wasbeurt 0,75 milliliters van de verse sulfo-NHS-SS-biotineoplossing toe aan elke well. Incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in het ijsbad onder krachtige schudding op een platformschudmachine vlak voor het einde van de incubatie.

Bereid een nieuwe verse SUHO N-H-S-S-S biotine-oplossing en vervang na 15 minuten de oude oplossing door de verse oplossing. Incubeer na de tweede incubatie nog eens 15 minuten bij vier graden Celsius onder krachtig schudden op een platformschudder, was de cellen vervolgens drie keer snel met twee milliliters blusoplossing om alle niet-reagerende NHS-biotine-moleculen te blussen. Incubeer daarna gedurende 15 minuten in twee milliliters blusoplossing.

Vervang na 15 minuten door verse quenching-oplossing en incubeer nogmaals 15 minuten. Houd de platen tijdens elke incubatie op vier graden Celsius met rustig schudden op een platformschudder, terwijl de controleplaat in de quenching-oplossing op het werkblad in de koelruimte blijft. Haal de experimentele plaat op dit punt uit de koelruimte op het ijsbad.

Indien er geneesmiddelen worden getest, voeg dan de juiste concentraties van het geneesmiddel toe aan voorverwarmde PBS twee plus GBSA. Hier gebruiken we ofwel een ethanol-voertuig of één MICROMOLAR vier ball Myra state acetate of PMA om de PKC-route te activeren. Was elke put van de experimentele plaat drie keer met twee milliliters voorverwarmde PBS twee plus GBSA, waarbij de betreffende geneesmiddelen na de laatste wasbeurt worden toegevoegd.

Voeg twee milliliter van de overeenkomstige PBS twee plus GBSA-oplossingen toe en vul eventuele lege wells met voorverwarmd medium om een gelijkmatige temperatuur over de plaat te garanderen. Plaats de cellen direct voorafgaand aan het einde van de incubatie gedurende 10 minuten in een incubator van 37 °C. Bereid een verse stripping-oplossing met 50 millimolair TCEP-oplossing in NT-buffer en bewaar deze op ijs.

Bereid een voldoende hoeveelheid voor voor één milliliter per well. Na de incubatie van 10 minuten wordt de experimentele plaat snel overgebracht naar een ijsbad en teruggebracht naar de koelruimte. Was de experimentele wells snel drie keer met twee milliliter per well ijskoud NT-buffer om endocytose te stoppen.

Was vervolgens de stripping-controleput drie keer met twee milliliter ijskoud NT-buffer. Laat de totale controleputten in de quench-oplossing staan. Voeg één milliliter stripping-oplossing toe aan elke experimentele put en stripping-controleput en incubeer dit 15 minuten op ijs.

Vier graden Celsius met zacht schudden voorafgaand aan het einde van de incubatie. Bereid opnieuw hetzelfde volume verse stripping-oplossing voor als voorheen. Vervang na 15 minuten de oude stripping-oplossing door een verse oplossing en incubeer nog eens 15 minuten bij vier graden Celsius met zacht schudden om de cellen eerst te lyseren.

Was alle wells die zijn blootgesteld aan de stripping-oplossing drie keer met twee milliliters NT-buffer. Was vervolgens alle wells, inclusief de totale controles, drie keer met twee milliliters koude pbs. Voeg na de laatste wasbeurt 300 microliters RIPPA-buffer met verse protease-remmers toe aan elke well; lyseer de cellen door 20 minuten te schudden bij vier graden Celsius.

Breng het lysaat over naar 1,5 milliliter microbuisjes en verwijder celresten door 10 minuten te centrifugeren bij 18, 000 GS op vier graden Celsius. Gebruik een proteïne-assay die compatibel is met uw lysiscondities, bijvoorbeeld de BCA-proteïne-assay van Pierce, om de proteïneconcentratie van het lysaat te bepalen ten opzichte van een standaardcurve van runder-serumalbumine. Bereid vervolgens de lysaten voor op strep- en affiniteitschromatografie.

Vul 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes met gelijke hoeveelheden eiwit van elk monster. In dit experiment isoleren we gebiotineerde eiwitten uit 50 microgram cellysaten. Voeg RIPA-buffer met proteaseremmers toe tot een eindvolume van 200 microliter voor elk monster.

Vortex vervolgens de strep avid en agro beads krachtig voor gebruik. Pipetteer met een 200 µL pipet en een afgesneden tip 20 µL gestripte avid en beads in elke buis. Vortex de buisjes en incubeer deze de volgende dag overnacht bij 4 °C op een buizenrotator. Verzamel de beads door de monsters twee minuten te centrifugeren bij 18.000 ×g bij kamertemperatuur. Aspireer het lysaat weg, waarbij u er zorg voor draagt dat u met de aspirator het bead-pellet niet nadert. Voeg 0,75 mL bij kamertemperatuur toe.

Voeg Rip-buffer toe aan elke buis en vortex op topsnelheid om de beads te wassen. Centrifugeer 2 minuten bij 18,000 GS. Verwijder het supernatant bij kamertemperatuur om de beads te verzamelen en herhaal deze cyclus van wassen, vortexen en centrifugeren nog twee keer, voor een totaal van drie wasbeurten na de laatste wasstap.

Zuig zoveel mogelijk van de buffer af zonder het pellet met beads te verstoren. Voeg vervolgens 20 tot 25 µL twee x reducerende Laemmli-buffer toe aan elke buis. Het reducerende middel zal de N-H-S-S-S biotine-disulfidebinding verbreken, waardoor de geïsoleerde eiwitten in oplossing komen.

Aangezien de meeste membraaneiwitten niet tegen koken kunnen, worden de buisjes na reductie en denaturatie 30 minuten op een rotator geïncubeerd bij kamertemperatuur om de eiwitten te scheiden. Met behulp van een standaard SDS-PAGE worden de eiwitten overgebracht op een membraan voor immunoblottings, waarna ze worden geblot met een passend antilichaam. In dit experiment gebruiken we rat anti-DAT antilichaam van Checon (nummer 360 9) in een verdunning van 1:2000. Leg de immunoreactieve banden vast met een CCD-camera geldocumentatiesysteem en zorg ervoor dat er geen verzadigde pixels aanwezig zijn. In dit experiment gebruiken we een BioRad VersaDoc imaging system met Quantity One software om de dichtheid van elke band te kwantificeren.

Hier wordt een representatief immunoblok getoond van de reversibele blokkeringsprocedure van de dopaminetransporter. Het sterkste signaal is de totale hoeveelheid oppervlakte-eiwit vóór internalisatie, te zien in de totale baan of T. De stripcontrole of S moet idealiter bijna blanco zijn en een hoge stripefficiëntie vertonen. De stripefficiëntie wordt berekend met behulp van banddensiteitsmetingen in de volgende formule.

De strip in dit experiment had een efficiëntie van 99,8%. Strips met een efficiëntie groter dan of gelijk aan 90% zijn optimaal en resultaten onder dit niveau moeten worden weggegooid. Dit voorbeeld van een pore-strip vertoont een zichtbare band in de stripbaan met een stripefficiëntie van 34%. Hier zijn de banden met een lagere intensiteit de internalisatielanes van de experimentele plaat. Cellen werden behandeld met ofwel een vehikeloplossing of één micromolair PMA gedurende een internalisatie van 10 minuten, waarna de internalisatiesnelheden van de dopaminetransporteur werden gemeten.

De internalisatiesnelheid wordt als volgt berekend op basis van banddichtheidsmetingen; zoals te zien is in deze grafiek, werd 10,4% van de oppervlakte-DAT geïnternaliseerd gedurende 10 minuten onder vehicle-behandelde condities. PMA-behandeling verhoogde de internalisatiesnelheid van DAT echter naar 23,2% van de totale oppervlakte-DAT. U heeft nu gezien hoe de internalisatiesnelheden van plasmamembraaneiwitten kunnen worden gemeten met behulp van een reversibele biotinyleringstechniek.

Het is belangrijk om te onthouden dat zowel het bio-tonatie-reagens als het TCP vers moeten worden bereid vlak voor gebruik. Als u merkt dat er tijdens het protocol veel cellen verloren gaan, gebruik dan een celadhesiesubstraat op uw platen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.