Name: Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-18T17:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Leer fluorescerend geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten voor celtypspecifiek onderzoek met Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt isolatie van specifieke celtypen mogelijk voor transcriptoomanalyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (subsidie ​​niet. DBI 0.519.984) en de National Institutes of Health (subsidie ​​niet. 5R01GM078279) ..

1) Voorbereiding van het plantmateriaal <ol><li> Protoplasten kan worden afgeleid uit veel verschillende plantensoorten en weefsels op voorwaarde dat de juiste mix van celwand enzymen wordt 1 gebruikt. Voordat een full-scale experiment is uitgevoerd, een kleinschalige vertering van het materiaal is het raadzaam om de protoplasting efficiëntie van het weefsel, enzymen, enz. te evalueren en om het percentage positieve cellen voor celsortering te schatten. Hier, protoplasten afgeleid van de wortels van Arabidopsis thaliana zaailingen dat celtype specifiek-express groen fluorescerend eiwit (GFP) worden gebruikt. De endodermis en quiescent center worden gekenmerkt door P SCR:: GFP en het quiescent center door P WOX5:: GFP 2,3 (figuur 1). </li><li> Zaailingen hydroponically gekweekt in phytatrays (Sigma, figuur 2a) op een nylon filter (250 micrometer mesh; NITEX), waarmee de wortels groeien door in het groeimedium (0,22% w / v Murashige en Skoog basismedium [Sigma], 1% w / v sucrose, 0,05% w / v MES [2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur], pH 5,7 met KOH). Als alternatief kunnen planten worden geteeld op de top van een nylon filter (100 um mesh) in verticaal geplaatst 1% agar platen (Figuur 2b). </li><li> Het gebruik van de bovengenoemde filters niet alleen helpt bij de oogst van de wortels, maar vergemakkelijkt ook eenvoudig extra behandeling van de zaailingen, indien gewenst. De filters kan de zaailingen te dragen massaal naar nieuwe phytatrays of agar platen aangevuld met een katalysator van belang. Bijvoorbeeld, de phytatray opgezet is gebruikt voor celtype-specifieke analyse van de transcriptionele respons op stikstof behandeling in Arabidopsis zaailingen 4. </li><li> Zorg ervoor dat uw microscopisch fluorescente marker correct wordt uitgedrukt (vooral bij gebruik van de behandeling optie, omdat het celtype-specifieke merkers zelf zou kunnen worden beïnvloed door de behandeling). In dit geval worden zaailingen geïnspecteerd onder een fluorescentie microscoop (Nikon, figuur 1). Merk op dat celtype-specifieke fluorescente marker lijnen moeten in eerste instantie worden gekarakteriseerd onder een confocale microscoop om precies welke celtypen zijn gemarkeerd te bepalen en te bepalen variabiliteit in expressie. </li></ol> 2) Voorbereiding van de protoplasting oplossing <ol><li> Los 1,25% w / v Cellulase (Yakult), 0,3% w / v Macerozyme (Yakult), 0,4 M D-mannitol, 20 mM MES en 20 mM KCl (van een 1 M stock) in gedemineraliseerd water en breng de pH op 5,7 met 1 M Tris / HCl pH 7,5. Deze oplossing zal enigszins worden troebel. </li><li> Verwarm de oplossing tot 55 ° C gedurende 10 minuten (de oplossing zal blijken helder) en laat hem afkoelen tot kamertemperatuur voor het toevoegen van 0,1% w / v BSA (bovine serum albumine), 10 mM CaCl 2, en 5 mM β-mercapto-ethanol . </li></ol> 3) Oogst en protoplasting van het plantmateriaal <ol><li> De wortels worden geoogst door schrapen ze af van de nylon mesh met een scalpel en gestort in een kolf met de protoplasting oplossing. Over het algemeen is 10 ml van de oplossing die wordt gebruikt protoplasting per 1500 zaailing wortels. </li><li> Schud de kolven zacht (75 rpm) bij kamertemperatuur gedurende een uur. Een langere incubatietijd kan het protoplast opbrengst, maar zal ook bijdragen aan het effect van protoplasting zich op genexpressie. </li><li> Filter de protoplast oplossing met een 40 um cel zeef (BD Falcon) en verdeel de oplossing over conische 15 ml buizen (BD Falcon). </li><li> Spin de buizen in een swing-emmer centrifuge gedurende 10 minuten op 500 G. Merk op dat dit centrifugeersnelheid zal afhangen van de aard van de protoplasten wordt gebruikt, hun kwetsbaarheid en de hoeveelheid celafval geproduceerd tijdens de enzymatische behandeling. </li><li> Verwijder het merendeel van het supernatans, resuspendeer de protoplasten in de resterende oplossing en microscopisch inspecteren (figuur 3). </li><li> Maak gebruik van een hemacytometer om het aantal en de dichtheid van protoplasten te schatten. De cel dichtheid bepaalt injecteren van een monster snelheid van de gebeurtenissen per seconde snelheid en dus de totale tijd die nodig is om de cellen op de FACS sort (zie ook rubriek 4.3). </li><li> 3.7) Ofwel direct doorgaan met FACS of wassen en de protoplasten resuspendeer in een incubatie-oplossing, zoals W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM MES, breng de pH op 5,7 met KOH) of protoplasting oplossing zonder de toegevoegde enzymen. Zeker als we kijken naar transcriptionele veranderingen, is het van belang om het minimaliseren van de blootstelling van de monsters naar voorwaarden die genexpressie kunnen beïnvloeden, zoals het veranderen van de buffer de protoplasten worden gehouden inch Het is daarom aanbevolen om de protoplasten te houden protoplasting oplossing en door te gaan naar FACS zo snel mogelijk. </li></ol> 4) Fluorescentie Activated Cell Sorting van protoplasten <ol><li> Schakel en de voorbereiding van de cel sorter. Hier is een FACSAria (BD) gebruikt. </li><li> Stel een stroom met een 100 &amp; mU; m nozzle en een 20 psi schede druk. </li><li> De cel dichtheid en injecteren van een monster snelheid kan worden aangepast aan de specifieke experiment op basis van de vraag of een zo goed mogelijke rendement of snelste haalbare snelheid gewenst is. We hebben met succes gesorteerd met dichtheden tot 10 miljoen cellen / ml. </li><li> Gebruik het monster agitatie optie op de FACS om sedimentatie van de protoplasten te voorkomen. Als verstopping van de FACS is een probleem, zijn er drie mogelijke stappen voor probleemoplossing: 1. Voer een sample-lijn backflush. 2. Verdun je protoplast vering om de dichtheid te verlagen. 3. Het schoonmaken van de protoplast oplossing door de filtratie stap (3.3) na het centrifugeren en resuspensie. </li><li> Bereid het apparaat naar voren te strooien (FSC), zijwaartse verstrooiing (SSC) en de emissie bij 530/30 nm voor GFP en 610/20 nm voor de rode spectrum autofluorescentie (RSA) na excitatie te meten door een 488 nm laser. Deze zijn in essentie de enige parameters die worden gebruikt om GFP-positieve protoplasten te isoleren. Hier, de spanning instellingen zijn als volgt: FSC - 60V, SSC 250V, 350V GFP en RSA 335V. Merk op dat de optimale voltage instellingen verschillend zijn voor elke FACS en zal zelfs moeten worden aangepast gedurende de hele levensduur van de cel sorter. </li><li> Begin met het opzetten van een dotplot voor voorwaartse verstrooiing versus zijwaartse verstrooiing. Breng de voltage-instellingen, zodat de gemeten gebeurtenissen in het midden van de plot. </li><li> Maak vervolgens een dot plot van groene versus rode fluorescentie signalen. Breng de voltage-instellingen, zodat de gemeten gebeurtenissen een gecentreerde diagonaal bevolking in de plot opbrengst bij het kijken naar een wild-type (niet-GFP) protoplast schorsing. Een protoplast schorsing afgeleid van een GFP-marker lijn zal een duidelijke populatie van groen fluorescent gebeurtenissen nooit gezien in wild-type monsters. </li><li> Stel vergoeding beperkingen aan te passen voor de spectrale overlap tussen de GFP en RSA. Een behoorlijke schadevergoeding beperking instellingen zorgen voor een betere scheiding van het GFP-positieve protoplasten van de niet-GFP protoplasten en puin. De beperkingen die hier gebruikt zijn als volgt: RSA, minus 17,91% GFP. </li><li> Stel een poort naar de GFP-positieve gebeurtenissen, een negatieve controle van niet-GFP protoplasten moet worden gebruikt om te helpen bij het definiëren van de poort grenzen (figuur 4) te identificeren. </li><li> Implementeer een voorwaartse verstrooiing cutoff om kleine brokstukken weglaten van de analyse. Visualiseer de GFP-positieve gebeurtenissen in de FSC vs SSC plot om de plaatsing van de cutoff te bepalen. Hier was de cutoff vastgesteld op 5000. Merk op dat de FACS zal puin tellen als een soort evenementen en een monster met een hoog niveau van puin kan een ander percentage GFP-positieve gebeurtenissen dan verwacht. Dit is niet noodzakelijk een probleem. Echter, de meer puin in de steekproef, hoe langer het soort zal duren. </li><li> Afhankelijk van het experiment en de overvloed van het celtype te analyseren, ofwel zet de FACS precisie-modus voor een optimale opbrengst of een optimale zuiverheid van de gesorteerde cellen. </li><li> Voor RNA-extractie, voor te bereiden verzameling buizen (1,5 ml microfugebuisje buizen) met de juiste hoeveelheid van de RNA-extractie buffer. Met deze opzet, zal 20.000 sorteren gebeurtenissen leveren een totaal volume van ongeveer 100 ul die werden ondergebracht in 350 ul extractiebuffer (RNeasy micro kit, QIAGEN). Meng monsters na afloop van de soort als celsuspensie kan zwembad aan de top. </li><li> Bewaar monsters of ga direct naar extractie RNA. Succesvolle microarray analyses zijn voorgevormd met de RNA geëxtraheerd uit zo weinig als 500 gesorteerd evenementen. Hier gebruikten we een RNeasy micro-extractie kit (Qiagen), de WT-Ovation Pico RNA Amplification System en FL-Ovation cDNA Biotine Module V2 (NuGEN). </li></ol> Representatieve resultaten Een phytatray van ongeveer 1.500 een-week-oud P SCR:: GFP zaailingen leverde ongeveer 60.000 protoplasten (zoals gemeten door hemacytometer). 2,6% van 65.000 FACS-verwerkt evenementen werden gedefinieerd als GFP-positieve en werden gesorteerd (figuur 4b). Acht platen van ongeveer 1.500 vier-dagen-oude P WOX5:: GFP zaailingen elk (12.000 totaal) leverde ongeveer 30 miljoen protoplasten (zoals gemeten door hemacytometer). 0,063% van 16 miljoen FACS-verwerkt evenementen werden gedefinieerd als GFP-positieve en werden gesorteerd (Figuur 4c). 10.000 gesorteerd evenementen worden doorgaans gebruikt voor RNA-extractie en kunnen opbrengst 20 tot 140 ng totaal RNA (figuur 5). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Celtype-specifieke marker GFP lijnen in de Arabidopsis wortel. Fluorescentie microscopie foto's zijn genomen met differentieel interferentie contrast (DIC) en een GFP filter op een Eclipse 90i microscoop (Nikon) draait op Metamorph software (Molecular Devices). Het DIC en GFP beelden werden overtrokken voor visualisatie doeleinden. De twee lijnen marker gebruikt in dit visuele experiment worden getoond;a) P SCR:: GFP en b) P WOX5:: GFP. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Plantengroei omstandigheden. Zaailingen werden gekweekt in een milieu-controller hydroponically in phytatrays (een) of op verticaal geplaatste agar platen (b). <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Plantenprotoplasten uiten van GFP. Fluorescentie microscopie foto's zijn genomen met differentieel interferentie contrast (DIC) en een GFP filter op een Eclipse 90i microscoop (Nikon) draait op Metamorph software (Molecular Devices). Het DIC en GFP beelden werden overtrokken voor visualisatie doeleinden. Pijlen geven een uitbarsting cel, puin en een GFP-positieve protoplast. De afstand tussen de twee witte lijnen is 50 micrometer. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Fluorescentie geactiveerde cel sortering van GFP-positieve protoplasten Protoplasten afgeleid van wild-type (a) P SCR:.: GFP (b) of P WOX5:: GFP (c) marker lijnen werden geanalyseerd en gesorteerd met een FACSAria (BD) met behulp van bepaalde poorten op een dotplot van groen (530/30 nm; x-as) versus rood (610/20 nm; y-as) fluorescentie. 100.000 evenementen worden gepresenteerd in elk perceel. De gebeurtenissen die binnen de GFP sorteren poort worden gemarkeerd groen. <img src="/files/ftp_upload/1673/1673fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Vertegenwoordiger RNA extracties van 10.000 gesorteerde cellen. Cellen werden direct gesorteerd in RNA-extractie buffer (QIAGEN), werd het RNA gezuiverd en gecontroleerd op de concentratie, zuiverheid en integriteit op een 2100 Bioanalyzer (Agilent). Triplo voor beide marker lijnen worden weergegeven.

<ol><li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127, 1466-1475 (2001).</li>
<li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127, 595-603 (2000).</li>
<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Bargmann, B. O. R., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+fluorescent+selection+permits+precise%2C+rapid%2C+and+in-depth+overexpression+analysis+in+plant+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts.</a> Plant Physiol. 149, 1231-1239 (2009).</li>
<li>Petersson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
</ol>

Protoplasten kunnen in principe worden afgeleid uit een verscheidenheid van plantaardige weefsels, het optimaliseren van gunstige voorwaarden zal sterk RNA kwaliteit en kwantiteit te verbeteren. Zowel de protoplasting oplossing en de electieve gebruikte incubatiebuffer invloed zal dit aspect. Veel verschillende fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de mogelijkheden van de gebruikte FACS, bijvoorbeeld GFP, RFP, YFP, GVB of hun vele varianten en derivaten. De...

<table><tbody><tr><td>250 &amp;mu;m nylon gaas</td><td>Sefar Filtration</td><td>NITEX 03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m nylon gaas</td><td>Sefar Filtration</td><td>NITEX 03-100/47</td><td></td></tr><tr><td>Vierkante petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-10k</td><td></td></tr><tr><td>Phytatrays</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1552</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>10 M stock</td></tr><tr><td>Eclipse 90i microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellulase R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041</td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2536</td><td> 1 M stock</td></tr><tr><td>orbital schudmachine</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m celzeef</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>conische 15 ml buisjes</td><td>BD Biosciences</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>tafelcentrifuge</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td>VWR international</td><td>20170-38</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>WT-Ovation Pico RNA Amplificatiesysteem</td><td>NuGEN</td><td>3300_12</td><td></td></tr><tr><td>FL-Ovation cDNA Biotine Module V2</td><td>NuGEN</td><td>4200_12</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Hoge-resolutie, celtype-specifieke analyse van genexpressie vergroot begrip van de ontwikkelings-regelgeving en reacties op prikkels uit de omgeving in een meercellig organisme. In situ hybridisatie en reportergen visualisatie kan in beperkte mate worden gebruikt voor dit doel, maar voor hoge resolutie kwantitatieve RT-PCR of high-throughput transcriptoom-brede analyse van de isolatie van RNA uit bepaalde celtypen is vereiste. Cellulaire dissociatie van weefsel expressie brengen van een fluorescerend eiwit marker in een bepaald celtype en de daaropvolgende Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) maakt het mogelijk om voldoende hoeveelheden materiaal te verzamelen voor RNA-extractie, cDNA synthese / versterking en microarray analyse. Een uitgebreide set van celtype-specifieke tl-reporter-lijnen is beschikbaar voor de plant onderzoeksgemeenschap. In dit geval worden twee marker lijnen van de Arabidopsis thaliana wortel gebruikt: P SCR:: GFP (endodermis en rust midden) en P WOX5:: GFP (quiescent center). Grote aantallen (duizenden) van zaailingen zijn hydroponically of op agarplaten geteeld en geoogst om voldoende wortel materiaal voor verdere analyse te verkrijgen. Cellulaire dissociatie van plantmateriaal wordt bereikt door enzymatische afbraak van de celwand. Deze procedure maakt gebruik van een hoge osmolariteit-geïnduceerde plasmolyse en commercieel beschikbaar cellulasen, om pectinasen en hemicellulasen vrijkomen protoplasten in de oplossing. FACS van GFP-positieve cellen maakt gebruik van de visualisatie van de groene versus de rode emissie spectra van protoplasten opgewekt door een 488 nm laser. GFP-positieve protoplasten kunnen worden onderscheiden door hun verhoogde ratio van groen naar rood emissie. Protoplasten worden meestal direct gesorteerd op RNA-extractie buffer en opgeslagen voor verdere verwerking op een later tijdstip. Deze techniek is geopenbaard worden eenvoudig en uitvoerbaar zijn. Verder wordt aangetoond dat het kan worden gebruikt zonder moeite om voldoende aantallen cellen te isoleren voor het transcriptoom analyse, zelfs voor zeer schaars celtypes (bv. quiescent center cellen). Ten slotte wordt een groei setup voor Arabidopsis zaailingen aangetoond dat in staat stelt eerdere ongecompliceerde behandeling van de planten naar cel sorteren (bijvoorbeeld voor het celtype-specifieke analyse van de biotische of abiotische stress-reacties). Mogelijke aanvullende toepassingen voor FACS van plantenprotoplasten worden besproken.

Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan ​​dat vergemakkelijkt de behandeling van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaailingen voorafgaand aan de cell sorting.

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

Hoge-resolutie, celtype-specifieke analyse van genexpressie verbetert het begrip van ontwikkelingsregulatie en reacties op omgevingsfactoren aanzienlijk...

Deze procedure is gebaseerd op planten die GFP tot expressie brengen in specifieke celtypen, die vervolgens met behulp van fluorescence-activated cell sorting of FACS kunnen worden geïsoleerd van de rest van de plantencellen. Dit voorbeeld maakt gebruik van twee markerlijnen die tot expressie komen in specifieke celtypen van Arabidopsis thaliana. Wortelkiemplanten worden gekweekt in fytotrays of op agarplaatjes.De wortels worden geoogst en behandeld met celwandverterende enzymen. Na één uur wordt de oplossing gefilterd om groot debris te verwijderen. Vervolgens wordt de oplossing gecentrifugeerd en wordt het supernatant verwijderd.GFP-positieve protoplasten worden vervolgens gescheiden via FACS. Het gesorteerde materiaal kan worden gebruikt voor celtypspecifieke analyses, zoals genoombrede transcriptionele profielen. Hallo, ik ben Basian Barman van het laboratorium van Ken Birnbaum van het Department of Biology aan de New York University.Vandaag laten we u een procedure zien voor fluorescentie-geactiveerde cel sortering van plantenprotoplasten. In dit voorbeeld zullen we twee specifieke celtypen in de wortel van Arabidopsis sorteren. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om celtype-specifieke transcriptionele profielen te bestuderen.Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, kweekt u wild-type zaailingen evenals zaailingen met celtype-specifieke expressie van GFP. De scarecrow-promoter die GFP aanstuurt, markeert de wortelendodermis en het rustcentrum in één groep zaailingen.En in een andere groep wordt het rustcentrum van de wortel gemarkeerd door de walks five-promotor die GFP aanstuurt. De zaailingen worden hydroponisch gekweekt in FIA-trays op een nylonfilter, waardoor de wortels door kunnen groeien in het groeimedium. Als alternatief kunnen planten worden gekweekt op een nylonmazig net en verticaal geplaatste 1% agarplaten.Naast het ondersteunen bij het oogsten van de wortels, maken de filters het mogelijk om de zaailingen massaal over te zetten naar nieuwe fytotrays of agarplaten, waar ze kunnen worden aangevuld met een katalysator van belang. Dit kan worden gedaan om celtype-specifieke transcriptionele reacties op nutriënten, hormonen of stressbehandelingen te bestuderen. Controleer onder de fluorescentiemicroscoop of de fluorescerende marker naar verwachting tot expressie komt.Zorg ervoor dat het expressiepatroon van de marker consistent is onder de toegepaste behandelingscondities, aangezien dit als gevolg van de behandeling kan veranderen. Ga over tot het oogsten en voorbereiden van protoplasten. Begin met het bereiden van de protoplastenoplossing.Combine 1,25% gewicht per volume cellulase 0,3% gewicht per volume, maser zyme 0,4 molar D mannitol 20 millimolar, MES en 20 millimolar KCL in gedemineraliseerd water en stel de pH in op 5,7 met één molar tris HCL bij pH 7,5. Deze oplossing zal licht troebel zijn. Verwarm vervolgens de oplossing gedurende 10 minuten tot 55 °C.De oplossing wordt helder; laat deze afkoelen tot kamertemperatuur en voeg vervolgens 0,1% gewicht per volume BSA, 10 millimolar calciumchloride en vijf millimolar beta me capto ethanol toe. Oogst één week oude zaailingen uit één phyto-tray. In het geval van de scarecrow GFP-lijn kunnen acht platen met vier dagen oude walks 5G FP-zaailingen worden gebruikt. Schraap de wortels met een scalpel van het nylon gaas en breng ze vervolgens over in een container met een protoplastenoplossing.Gebruik ongeveer 10 milliliter protoplastenoplossing per 1500 zaailingen. Schud de kolven voorzichtig bij 75 RPM op kamertemperatuur gedurende één uur. Een langere incubatietijd kan de opbrengst aan protoplasten verhogen, maar zal ook het effect van de protoplasten zelf op de genexpressie vergroten.Nu de protoplasten zijn vrijgekomen, gebruikt u een cellenzeef van 40 micrometer om de oplossing te filteren en verdeelt u de protoplastensuspensie over conische buisjes van 15 ml. Het is belangrijk om een schone protoplastensuspensie te verkrijgen zonder al te veel debris om verstopping van de nozzles te voorkomen en de tijd die nodig is voor het sorteren van de cellen te minimaliseren. Centrifugeer de buisjes in een centrifuge met swing-bucket rotor bij 500 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Houd er rekening mee dat de centrifugatiesnelheid afhankelijk is van de samenstelling van het plantengedeelte waaruit de protoplasten worden gewonnen en de hoeveelheid celresten die tijdens de enzymatische behandeling worden geproduceerd. Verwijder na centrifugatie het grootste deel van het supernatans en resuspendeer het pellet met de protoplasten voorzichtig in het kleine volume van de overgebleven protoplastenoplossing. Tel tot slot de protoplasten met een hemocytometer en bepaal hun dichtheid om de opbrengst te berekenen en de parameters voor de verdere stappen vast te stellen.Inspecteer de protoplasten na het tellen. Controleer hun integriteit, het niveau van GFP-expressie en de hoeveelheid contaminerende celresten. Ga vervolgens over tot faxen.Indien er niet direct wordt overgegaan tot fax. Protoplasten kunnen worden gewassen, geresuspendeerd en bewaard in een incubatieoplossing, zoals proto plating-oplossing zonder de toegevoegde enzymen of W five-oplossing. Zet de cel sorter en de computer van het werkstation aan.Hier gebruiken we een fria geproduceerd door Becton Dixon and Company. Gebruik XPBS als sheath-vloeistof en voer de procedure voor het opstarten van het vloeistofsysteem uit. Installeer een nozzle van 100 micrometer en stel een sheath-druk van 20 PSI in.Stel een stabiele flowstroom in en calibreer de druppelvertraging. Let op dat de calibratie in deze procedure niet wordt getoond. Protoplastensuspensies met een dichtheid tot 10 miljoen cellen per ml kunnen succesvol worden gesorteerd.Om sedimentatie van de protoplasten te voorkomen, dient de optie voor monsteragitatie op de facts te worden gebruikt. Als verstopping van de facts een probleem vormt, zijn er drie mogelijke stappen voor probleemoplossing. Voer eerst een backflush van de monsterlijn uit.Ten tweede dient u uw protoplastensuspensie te verdunnen om de dichtheid te verlagen. Ten derde reinigt u de protoplastenoplossing door de filtratiestap na centrifugatie en resuspensie te herhalen. Er worden slechts vier parameters gebruikt om GFP-positieve protoplasten te onderscheiden van GFP-negatieve protoplasten en celdebris; na excitatie door een 488 nanometer laser is forward scatter een indicator voor de partikelgrootte en side scatter een indicator voor de partikelgranulariteit.Emissie bij 530 nanometer als maat voor groene fluorescentie en emissie bij 610 nanometer als maat voor autofluorescentie in het rode spectrum. Begin met het instellen van een dotplot voor forward scatter versus side scatter. Pas de voltagespanning zo aan dat de gemeten gebeurtenissen in het midden van de plot gecentreerd zijn.GFP-positieve PROTOPLASTEN kunnen worden onderscheiden door hun verhoogde verhouding van groene ten opzichte van rode emissie in vergelijking met events met autofluorescentie. Stel uitsluitend een dot plot op met groene fluorescentie tegenover rode spectrum-autofluorescentie. Pas de spanningsinstellingen zodanig aan dat de gemeten events leiden tot een enkele diagonale populatie in de plot.Bij het bekijken van een suspensie van wild-type protoplasten zouden GFP-positieve PROTOPLASTEN een duidelijke populatie groene fluorescentie-events moeten produceren die nooit in wild-type monsters zijn waargenomen. Stel de compensatiebeperkingen in om te corrigeren voor spectrale overlap tussen groene fluorescentie en autofluorescence in het rode spectrum. Bij gebruik van een GFP-positieve PROTOPLASTEN-suspensie maken de juiste instellingen voor compensatiebeperkingen een betere scheiding mogelijk van de GFP-positieve protoplasten ten opzichte van de niet-GFP-protoplasten en debris; stel een gate in om GFP-positieve events te identificeren.Het is raadzaam om bij elke voorbereiding van een sorteerexperiment ook non-GFP PROTOPLASTEN mee te nemen om te helpen bij het definiëren van de gate-grenzen. Stel tenslotte een drempelwaarde voor forward scatter in om klein debris buiten de analyse te laten. De visualisatie van GFP-positieve events in de forward scatter versus side scatter plot helpt bij het bepalen waar deze drempelwaarde moet worden ingesteld.De parameters die in deze eerste facts-run zijn ingesteld, kunnen worden hergebruikt voor toekomstige sorteringen. Voor dagelijks gebruik van de facts zullen kleine aanpassingen nodig zijn. Bereid voor RNA-extractie opvangbuisjes voor die RNA-extractiebuffer bevatten; hanteer als richtlijn maximaal 100 µL sorteervolume op 350 µL extractiebuffer.20.000 sorteergebeurtenissen leveren een totaal sorteervolume op van ongeveer 100 microliter. Nu de fax-parameters en bedrijfsmodi zijn ingesteld en de opvangbuisjes gereed zijn, kan gestart worden met het sorteren van de protoplasten wanneer de sortering is voltooid. Meng de buisjes voor monsteropvang, aangezien de celsuspensie zich bovenin kan ophopen; reeds 500 gesorteerde gebeurtenissen kunnen worden gebruikt voor microarray-analyse na RNA-extractie en cDNA-amplificatie.Hier maken we gebruik van de RNEZ micro-extractieset, het WT ovation PICO RNA-amplificatiesysteem en de fl ovation CD NA biotin module V twee. Hier zijn typische fax-resultaten voor protoplasten afgeleid van non-GFP Scarecrow, GFP- en W 5G FP-zaailingen. In elke dotplot van groene fluorescentie op de x-as versus rode fluorescentie worden 100.000 events weergegeven. Op de y-as zijn de events die binnen de GFP-sorteerpoort vallen groen gemarkeerd.Dit is een samenvatting van de typische opbrengst aan protoplasten uit zaailingen die ofwel scarecrow GFP tot expressie brengen, wat de wortelendodermis en het rustcentrum markeert, of walks 5G FP, wat het rustcentrum van de wortel markeert. Er zijn minder cellen in het rustcentrum van de wortel vergeleken met de wortelendodermis. Daarom is de opbrengst aan GFP-expresserende cellen in de walks 5G FP-sortering kleiner dan in de scarecrow GFP-sortering, ondanks dat er met meer protoplasten werd gestart. Hier worden typische resultaten van RNA-extractie van monsters in triplikaat getoond.Elk monster komt overeen met het RNA dat is geëxtraheerd uit 10.000 events. Het geëxtraheerde RNA wordt geanalyseerd op een bioanalyzer, waarbij de ribosomale pieken voor de scarecrow GFP-monsters bovenaan en de walks 5G FP-monsters eronder worden weergegeven; het geëxtraheerde RNA kan vervolgens worden gebruikt voor microarray-analyse. Deze scatterplot van log2-expressieniveaus demonstreert de gelijkenis tussen twee replica's.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u fluorescentie-geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten uitvoert voor celtype-specifieke analyse. Deze techniek is toepasbaar op veel verschillende plantenweefsels en soorten. Goede opbrengsten met een laag gehalte aan debris en gezonde protoplasten zullen leiden tot betere resultaten in transcriptionele en andere downstream-analyses.Onthoud daarnaast dat het belangrijk is om de groeiomstandigheden van het plantmateriaal identiek te houden voor een vergelijking tussen de gesorteerde monsters. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

fluorescence-activated-cell-sorting-of-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Protocollen om de dynamica van chloroplast-stromules te onderzoeken, de stroma-gevulde buisjes die zich uitstrekken vanaf het oppervlak van chloroplasten, worden beschreven.

Visualiseren Stromule Frequency met fluorescentiemicroscopie

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.

Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

Koralen creëren biodiverse ecosystemen die belangrijk zijn voor zowel mensen als mariene organismen. We begrijpen echter nog steeds niet het volledige potentieel en de functie van veel koraalcellen. Hier presenteren we een protocol ontwikkeld voor de isolatie, etikettering en scheiding van steenachtige koraalcelpopulaties.

Fluorescentie-geactiveerde celsorde voor de isolatie van scleractinische celpopulaties

De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.

Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

Leer fluorescerend geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten voor celtypspecifiek onderzoek met Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt isolatie van specifieke celtypen mogelijk voor transcriptoomanalyse.

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

Meer video's verkennen