Presynaptically Silent Synapsen Studeerde met lichtmicroscopie

Sommige presynaptische terminals in het centrale zenuwstelsel lijken niet-functioneel of stil te zijn. Hier presenteren wij een protocol voor het identificeren van stille presynaptische terminals. Dit protocol kan worden toegepast om behandelingen en manipulaties te identificeren waarvan wordt vermoed dat ze terminals tot zwijgen brengen of activeren.

Het protocol combineert vitale kleuring van synaptische blaasjes tijdens neuronale depolarisatie met een daaropvolgende kleuring van gefixeerde cellen met een antilichaam dat alle presynaptische terminals markeert, zowel stille als actieve. Synapsen die zowel met kleurstof als met het antilichaam zijn gelabeld, zijn actief. Synapsen die alleen door het antilichaam zijn gelabeld, zijn stil.

Hallo, ik ben Amanda Taylor van het laboratorium van Dr. Steve Minick van de afdeling Psychiatrie aan de Washington University School of Medicine. Ik ben Shahin, ook van het Manic Lab. Vandaag willen we u de procedure laten zien voor het visualiseren van stille presynaptische terminals met behulp van gekweekte hippocampale neuronen.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe elektrische activiteit en andere signaleringspaden de afgifte van neurotransmitters moduleren. Laten we beginnen. Gebruik in een steriele laminaire flowkast hippocampusen van ratten of muizen van postnatale dag nul tot drie om gedissocieerde celculturen voor te bereiden.

Volgens ons gepubliceerde protocol zijn onze culturen gemengde gliaculturen afgeleid van dezelfde dissectie; cellen moeten worden uitgeplaat in steriele schalen van 35 millimeter. Elke schaal bevat een dekglasje nummer nul dat was gecoat met 5 mg/mL collageen. De neuronen worden uitgeplaat met een geschatte dichtheid van 500 cellen per cm².

12 rattenpupjes leveren doorgaans genoeg materiaal voor 30 schaaltjes van 35 millimeter. Laat de culturen 10 tot 14 dagen groeien in een incubator. Voeg op dag vier in vitro het antimitoticum ara-C toe om de gliale groei te stoppen, ten behoeve van de synaptische ontwikkeling en rijping.

Voer daarnaast op dag vijf in vitro een gedeeltelijke mediumverversing uit met neurobasaal medium plus B 27-supplement om de neuronale overleving tijdens deze rijpingsperiode te bevorderen. Introduceer behandelingen die het aantal presynaptisch stille synapsen beïnvloeden. Wij hebben vastgesteld dat een handige manier om een groot percentage glutamaatsynapsen stil te leggen, een behandeling van vier uur met 30 millimol kalium is.

Wanneer de culturen volgroeid zijn, moeten de neuronen een relatief lage dichtheid hebben met goed gescheiden en uitgebreide neuritische uitlopers. Haal de culturen uit de incubator en plaats ze op de werkbank. Vervang het cultuurmedium door een gebufferde zoutoplossing die 45 millimolar kaliumchloride en 10 micromolar FM 1 43 FX-kleurstof bevat.

Deze oplossing moet ook NBQX en APV bevatten om recurrente signalering te voorkomen. Het is belangrijk dat de FM 1 43 FX-stamoplossing en de experimenten in het donker worden bewaard om fotobleken te voorkomen. Dek daarom de kweekschalen met folie af voor alle volgende incubatiestappen.

Incubeer precies twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kleurstofoplossing en was slechts drie tot vijf seconden in HEPES-gebufferde zoutoplossing met 500 µM EDTA om aspecifieke kleuring te verwijderen; de timing in deze stap is cruciaal.

Aangezien langdurige blootstelling aan adv adverse F seven alle FM 43 FX-labeling zal verwijderen, worden de cellen vervolgens gewassen met heaps buffered saline zonder adv adverse Seven gedurende vijf intervallen van twee minuten in een chemische zuurkast.

Fixeer de culturen in 4%paraldehyde en 0,2%glutaraldehyde in PBS gedurende 10 minuten. Was de cellen kort met PBS. De cellen kunnen nu uit de zuurkast worden gehaald.

Voeg blokkeringsoplossing toe die 4% normaal geiten serum en 0,04% Triton X bevat om de achtergrondruis te verminderen en de cellen te permeabiliseren voor immunokleuring. Incubeer gedurende 15 minuten. Kleur de cellen met vlu T one-antilichaam, verdund tot 1:2000 in blokkeringsoplossing.

Incubeer de culturen in antilichaam gedurende drie uur onder zachte schudding. Was de cellen vier keer met PBS. Incubeer de cellen met Alexa.

6 47 geconjugeerd anti-cavia-antilichaam verdund tot 1:500 in blokkeringsoplossing. Bewaar de culturen in het secundaire antilichaam onder zachte schudding gedurende 30 minuten. Was de cellen nog vier keer met PBS.

Plaats met een pincet een kleine druppel van de vloerhoeveelheid op een schoon glazen objectglas. Pak een dekglas en laat dit voorzichtig op de druppel van de vloerhoeveelheid zakken, met de cellen naar het objectglas gericht. Laat het preparaat een nacht drogen.

Bereid een 60 x olie-objectief voor op een confocale laser-scanmicroscoop. Plaats een objectglas op de tafel zodat het dekglas naar het objectief is gericht. Zoek een gebied met neurieten dat niet te dicht is en dat zich op afstand van het soma bevindt, aangezien daar resterende kleurstof kan achterblijven.

Zoom in op een gezichtsveld van 51 bij 51 microns. Gebruik beeldbewerkingssoftware om een Z-stack op te nemen over een diepte van 7,8 microns, verdeeld over 27 stappen van 0,3 microns per stap.

Scan eerst voor het VLU T one-antilichaam om alle glutamaterge synapsen in het gezichtsveld te identificeren. Scan vervolgens opnieuw voor FM 1 43 FX-fluorescentie om de beelden na acquisitie te analyseren. Gebruik analyse-software om de Z-stack om te zetten in een samengestelde afbeelding van één enkel vlak, gebaseerd op de maximale intensiteitswaarde van elk vlak per pixel, en stel de drempelwaarde in.

Om de achtergrondruis te verminderen, worden de uiteinden van VG glu T one geïdentificeerd zonder referentie naar de FM 1 43 effects-kleuring. Markeer deze puncta als regio's van interesse. Gewoonlijk selecteren we 10 puncta per veld.

Herhaal de drempelwaardeinstelling en de selectie van puncta op de FM 1 43-effectenafbeelding en superponeer de afbeeldingen om stille synapsen te identificeren. Een absoluut pixelcriterium of een percentage-pixelcriterium kan worden gebruikt om actieve FM 1 43-positieve synapsen te onderscheiden van inactieve FM 1 43-negatieve synapsen. In onze culturen stellen we vast dat 70 tot 80% van de glutamaatsynapsen, gedefinieerd door V glut one-kleuring, detecteerbare FM 1 43-kleuring vertoont in overlappende afbeeldingen van groene FM 1 43-fluorescentie en rode V glut one-kleuring.

Dit is duidelijk zichtbaar als een overvloed aan gele puncta-synapsen met colokaliserende markers. Deze worden aangegeven door de pijlen. Ongeveer 20 tot 30% van de rode Vglut1-positieve puncta zullen geen groene FM 1-43-fluorescentie boven de baseline vertonen.

Dit zijn de inactieve presynaptische terminals en een voorbeeld wordt aangegeven door de pijlspunt. Er zal ook een derde populatie synapsen worden waargenomen. Deze zijn positief voor groene FM 1 43 fluorescentie, maar vertonen geen rode B glut one kleuring.

Dit zijn actieve GABAerge synapsen en een voorbeeld wordt aangegeven met het sterretje. Deze worden uitgesloten van de meeste van onze analyses, maar kunnen expliciet worden bestudeerd met een antilichaam tegen de vesiculaire GABA-transporter. In plaats van het VLU T one-antilichaam hebben we zojuist laten zien hoe presynaptisch stille synapsen gevisualiseerd kunnen worden met FM 1 43 en VLU one-immunokleuring.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat FM 1 43 FX gevoelig is voor zowel de tijd in de adver sub seven-was als de concentratie van de behandelende X 100 in de blokkeringsoplossing. Dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.