Presynaptically Silent Synapsen Studeerde met lichtmicroscopie
January 4th, 2010
Glutamaat synapsen kunnen overschakelen van een actieve modus naar een stille modus. We laten zien dat presynaptische activiteit status in gedissocieerde cultuur van knaagdieren neuronen wordt gevisualiseerd met behulp van een Muur vorm van de FM1-43 dye om actieve synapsen visualiseren en immunokleuring met vGluT-1 antilichaam op alle glutamaat synapsen te visualiseren.
Sommige presynaptische terminalen in het centrale zenuwstelsel lijken niet-functioneel of stil. Hier presenteren we een protocol voor het identificeren van stille presynaptische terminalen. Dit protocol kan worden toegepast om behandelingen en manipulaties te identificeren waarvan wordt vermoed dat ze terminalen tot zwijgen brengen of wekken.
Het protocol combineert vitale kleurstoflabeling van synaptische blaasjes tijdens neuronale depolarisatie met daaropvolgende labeling van gefixeerde cellen met een antilichaam dat alle presynaptische terminalen labelt, zowel stil als actief.Synapsis. Co gelabeld met kleurstof en antilichaam zijn actief. Synapsis alleen gelabeld door antilichaam zijn stil.
Hallo, ik ben Amanda Taylor van het laboratorium van Dr.Steve Minick in de afdeling Psychiatrie van de Washington University School of Medicine. Ik ben Shahin ook van het Manic Lab. Vandaag willen we uw procedure laten zien om stille presynaptische terminalen te visualiseren met behulp van gekweekte hippocampale neuronen.
We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe elektrische activiteit en de andere enkele noling-routes de neurotransmitter-afgifte moduleren. Dus laten we beginnen. Gebruik in een steriele laminare stromingskap HIPA kan niet worden gekocht van postnatale dag nul tot drie ratten of muizen om gedissocieerde celculturen te bereiden.
Volgens ons gepubliceerde protocol zijn onze culturen gemengde gliacellen Culturen afgeleid van dezelfde dissectiecellen moeten worden geplateerd in steriele 35 millimeter schaaltjes. Elk bevat een nummer nul dekglas dat was gecoat met vijf milligram per milliliter van collageenplaat. De neuronen op een geschatte dichtheid van 500 cellen per centimeter vierkant.
12 ratten zullen typisch 30 35 millimeter schaaltjes opleveren. Laat de culturen 10 tot 14 dagen groeien in een kweekincubator. Voor synaptische ontwikkeling en rijping, voeg de anti-mitotic a C toe om gliale groei te stoppen op dag in vitro vier.
Ook op dag in vitro vijf, voer een halve mediumuitwisseling uit met neuro basale medium plus B 27 supplement om de neuronale overleving tijdens deze rijpingsperiode te verbeteren. Introduceer behandelingen die het aantal presynaptisch stille synapsen veranderen. We vinden dat een handige manier om een groot percentage glutamaatsynapsen tot zwijgen te brengen een behandeling van vier uur met 30 millimolair kalium is.
Wanneer de culturen volwassen zijn, moeten neuronen een relatief lage dichtheid hebben met goed gescheiden en uitgebreide neurotische processen. Verwijder de culturen uit de incubator en breng ze naar de werkbank. Vervang het kweekmedium door een gebufferde zoutoplossing die 45 millimolair kaliumchloride en 10 micromolair FM 1 43 FX-kleurstof bevat.
Deze oplossing moet ook NBQX en A PV bevatten om terugkerende signalering te voorkomen. Het is belangrijk dat de FM 1 43 FX-voorraadoplossing en experimenten in het donker worden bewaard om fotobleken te voorkomen. Bedek dus de kweekschalen met folie voor alle volgende incubatiestappen.
Incubeer gedurende exact twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kleurstoffoplossing en spoel slechts drie tot vijf seconden af in stapelen gebufferde zoutoplossing met 500 micromolair adversieve.Zeven. Om niet-specifieke kleurstoffoplossing in deze stap te verwijderen is timing cruciaal.
Omdat langdurige blootstelling aan adversieve zeven alle FM 43 FX-labeling zal verwijderen. Was vervolgens de cellen en stapelen gebufferde zoutoplossing zonder adversieve. Zeven gedurende vijf twee minuten intervallen in een chemische rookafzuigingskast.
Fixeer de culturen in 4%paraldehyde en 0,2%glutaraldehyde in PBS gedurende 10 minuten. Was de cellen kort met PBS. De cellen kunnen nu uit de rookafzuigingskast worden verwijderd.
Voeg blokkeringsoplossing toe die 4% normaal geitenserum en 0,04%tritton X bevat om achtergrond te verminderen en de cellen te doorboren voor immunokleuring. Incubeer gedurende 15 minuten. Kleur de cellen met vlu T een antilichaam verdund tot een op 2000 in blokkeringsoplossing.
Incubeer de culturen in antilichaam met zacht schudden gedurende drie uur. Was de cellen vier keer met PBS. Incubeer de cellen met Alexa.
6 47 geconjugeerd anti Guineevarken antilichaam verdund tot een op 500 in blokkeringsoplossing. Houd de culturen in het secundaire antilichaam met zacht schudden gedurende 30 minuten. Was de cellen nog vier keer met PBS.
Plaats een kleine druppel vloer op een schone glazen dia met behulp van een pincet. Neem een dekglas op en laat het voorzichtig op de druppel vloer dalen met de zijde naar de dia. Laat de dia 's nachts drogen.
Bereid een 60 x olieobjectief voor op een confocale laserscanningmicroscoop. Plaats een dia op de standaard zodat het dekglas naar het objectief is gericht. Zoek een veld van neurites dat niet te dicht is en dat weg is van de soma die restant kleurstof kan behouden.
Zoom naar een veldgrootte van 51 bij 51 micrometer. Gebruik beeldverwervingssoftware. Verwerf een ZS-stack die een diepte van 7,8 micrometer bedekt over 27 stappen van 0,3 micrometer voor elke stap.
Scan eerst voor de VLU T een antilichaam om alle glutamaterge synapsen in het veld te identificeren. Scan vervolgens opnieuw voor FM 1 43 FX-fluorescentie om afbeeldingen na verwerving te analyseren. Gebruik analysesoftware om de Z tack om te zetten in een samengestelde enkele vlak afbeelding op basis van de maximale intensiteitsmeting van elk vlak bij elke pixel ingestelde drempel.
Om achtergrond te verminderen, identificeer VG glu T een terminalen zonder verwijzing naar de FM 1 43 effecten kleurstof. En markeer deze punten als interessegebieden. We selecteren doorgaans 10 PUNTA per veld.
Herhaal het drempelvaststellen en selectie van punten op de FM 1 43 effecten afbeelding en leg de afbeeldingen bovenop elkaar om stille synapsen te identificeren. Een absoluut pixelcriterium, of een percentage pixelcriterium kan worden gebruikt om actieve FM 1 43-positieve synapsen te onderscheiden van inactieve FM 1 43-negatieve synapsen. In onze culturen vinden
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het identificeren van stille presynaptische terminals in het centrale zenuwstelsel. Door vitale kleurstofmarkering te combineren met immunokleuring, kunnen onderzoekers onderscheid maken tussen actieve en stille synapsen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Synaptische functie
Achtergrond
- Sommige presynaptische terminals zijn niet-functioneel of stil.
- Begrip van synaptische activiteit is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het identificeren van stille terminals kan helpen bij het bestuderen van verschillende behandelingen.
- Het visualiseren van synaptische activiteit kan inzichten geven in neuronale communicatie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het identificeren van stille presynaptische terminals.
- Om de effecten van behandelingen op synaptische activiteit te onderzoeken.
- Om het begrip van synaptische dynamica in neuronale netwerken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Vitale kleurstofmarkering van synaptische vesicles tijdens neuronale depolarisatie.
- Immunokleuring met een antilichaam dat alle presynaptische terminals markeert.
- Co-markeringstechnieken om onderscheid te maken tussen actieve en stille synapsen.
- Gebruik van FM1-43 kleurstof om actieve synapsen te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Actieve synapsen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de FM1-43 kleurstof.
- Immunokleuring onthult alle presynaptische terminals, inclusief de stille.
- Het protocol onderscheidt effectief tussen actieve en stille synapsen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van synaptische plasticiteit en functie.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is een waardevol hulpmiddel voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het identificeren van stille terminals kan behandelstrategieën informeren.
- Deze methode verbetert het begrip van synaptisch gedrag.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Identifying presynaptically silent synapses enables mechanistic de-risking in target validation by revealing functional heterogeneity in neuronal networks. This method supports predictive confidence in screening assays by distinguishing active from inactive glutamate release sites. It informs portfolio triage by linking synaptic plasticity mechanisms to disease-relevant systems in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying presynaptic silencing or activation states.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct visualization of vesicle release competence.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating cAMP signaling or electrical silencing with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation using co-localization of FM1-43 FX and vGluT-1 signals.
- Quantitative Output: Enables standardized measurement of active synapse percentage via threshold-based image analysis.
- Reproducibility: Supports platform reuse through standardized fixation, staining, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects presynaptic plasticity to hippocampal-dependent learning and memory pathways.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by monitoring synaptic adaptation to treatments.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying silent synapse populations under baseline and modulated conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a functional readout of presynaptic terminal activity prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of treatments that alter presynaptic silencing via potassium depolarization or cAMP activation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantification of glutamate release competence in dissociated hippocampal cultures.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (e.g., % FM1-43+/vGluT-1+ puncta) enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling synaptic adaptation relevant to neuropsychiatric disorder mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening modulators of presynaptic function across neuronal models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of vesicle release probability.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via fixed-cell imaging and co-staining protocol.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in synaptic drug effects.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional synaptic modulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture, confocal microscopy, and fluorescence image analysis.
- Needs instrumentation including laser scanning microscope with 60x oil objective and Z-stack acquisition.
- Demands cross-team standardization of staining timing, dye concentration, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for non-hippocampal neuronal systems or alternative vesicle transporters.
- Includes practical limitations such as FM1-43 FX sensitivity to ascorbic acid wash duration and blocking solution composition.
