Presynaptically Silent Synapsen Studeerde met lichtmicroscopie
4 januari 2010
Glutamaat synapsen kunnen overschakelen van een actieve modus naar een stille modus. We laten zien dat presynaptische activiteit status in gedissocieerde cultuur van knaagdieren neuronen wordt gevisualiseerd met behulp van een Muur vorm van de FM1-43 dye om actieve synapsen visualiseren en immunokleuring met vGluT-1 antilichaam op alle glutamaat synapsen te visualiseren.
Sommige presynaptische terminals in het centrale zenuwstelsel lijken niet-functioneel of stil te zijn. Hier presenteren wij een protocol voor het identificeren van stille presynaptische terminals. Dit protocol kan worden toegepast om behandelingen en manipulaties te identificeren waarvan wordt vermoed dat ze terminals tot zwijgen brengen of activeren.
Het protocol combineert vitale kleuring van synaptische blaasjes tijdens neuronale depolarisatie met een daaropvolgende kleuring van gefixeerde cellen met een antilichaam dat alle presynaptische terminals markeert, zowel stille als actieve. Synapsen die zowel met kleurstof als met het antilichaam zijn gelabeld, zijn actief. Synapsen die alleen door het antilichaam zijn gelabeld, zijn stil.
Hallo, ik ben Amanda Taylor van het laboratorium van Dr. Steve Minick van de afdeling Psychiatrie aan de Washington University School of Medicine. Ik ben Shahin, ook van het Manic Lab. Vandaag willen we u de procedure laten zien voor het visualiseren van stille presynaptische terminals met behulp van gekweekte hippocampale neuronen.
Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe elektrische activiteit en andere signaleringspaden de afgifte van neurotransmitters moduleren. Laten we beginnen. Gebruik in een steriele laminaire flowkast hippocampusen van ratten of muizen van postnatale dag nul tot drie om gedissocieerde celculturen voor te bereiden.
Volgens ons gepubliceerde protocol zijn onze culturen gemengde gliaculturen afgeleid van dezelfde dissectie; cellen moeten worden uitgeplaat in steriele schalen van 35 millimeter. Elke schaal bevat een dekglasje nummer nul dat was gecoat met 5 mg/mL collageen. De neuronen worden uitgeplaat met een geschatte dichtheid van 500 cellen per cm².
12 rattenpupjes leveren doorgaans genoeg materiaal voor 30 schaaltjes van 35 millimeter. Laat de culturen 10 tot 14 dagen groeien in een incubator. Voeg op dag vier in vitro het antimitoticum ara-C toe om de gliale groei te stoppen, ten behoeve van de synaptische ontwikkeling en rijping.
Voer daarnaast op dag vijf in vitro een gedeeltelijke mediumverversing uit met neurobasaal medium plus B 27-supplement om de neuronale overleving tijdens deze rijpingsperiode te bevorderen. Introduceer behandelingen die het aantal presynaptisch stille synapsen beïnvloeden. Wij hebben vastgesteld dat een handige manier om een groot percentage glutamaatsynapsen stil te leggen, een behandeling van vier uur met 30 millimol kalium is.
Wanneer de culturen volgroeid zijn, moeten de neuronen een relatief lage dichtheid hebben met goed gescheiden en uitgebreide neuritische uitlopers. Haal de culturen uit de incubator en plaats ze op de werkbank. Vervang het cultuurmedium door een gebufferde zoutoplossing die 45 millimolar kaliumchloride en 10 micromolar FM 1 43 FX-kleurstof bevat.
Deze oplossing moet ook NBQX en APV bevatten om recurrente signalering te voorkomen. Het is belangrijk dat de FM 1 43 FX-stamoplossing en de experimenten in het donker worden bewaard om fotobleken te voorkomen. Dek daarom de kweekschalen met folie af voor alle volgende incubatiestappen.
Incubeer precies twee minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kleurstofoplossing en was slechts drie tot vijf seconden in HEPES-gebufferde zoutoplossing met 500 µM EDTA om aspecifieke kleuring te verwijderen; de timing in deze stap is cruciaal.
Aangezien langdurige blootstelling aan adv adverse F seven alle FM 43 FX-labeling zal verwijderen, worden de cellen vervolgens gewassen met heaps buffered saline zonder adv adverse Seven gedurende vijf intervallen van twee minuten in een chemische zuurkast.
Fixeer de culturen in 4%paraldehyde en 0,2%glutaraldehyde in PBS gedurende 10 minuten. Was de cellen kort met PBS. De cellen kunnen nu uit de zuurkast worden gehaald.
Voeg blokkeringsoplossing toe die 4% normaal geiten serum en 0,04% Triton X bevat om de achtergrondruis te verminderen en de cellen te permeabiliseren voor immunokleuring. Incubeer gedurende 15 minuten. Kleur de cellen met vlu T one-antilichaam, verdund tot 1:2000 in blokkeringsoplossing.
Incubeer de culturen in antilichaam gedurende drie uur onder zachte schudding. Was de cellen vier keer met PBS. Incubeer de cellen met Alexa.
6 47 geconjugeerd anti-cavia-antilichaam verdund tot 1:500 in blokkeringsoplossing. Bewaar de culturen in het secundaire antilichaam onder zachte schudding gedurende 30 minuten. Was de cellen nog vier keer met PBS.
Plaats met een pincet een kleine druppel van de vloerhoeveelheid op een schoon glazen objectglas. Pak een dekglas en laat dit voorzichtig op de druppel van de vloerhoeveelheid zakken, met de cellen naar het objectglas gericht. Laat het preparaat een nacht drogen.
Bereid een 60 x olie-objectief voor op een confocale laser-scanmicroscoop. Plaats een objectglas op de tafel zodat het dekglas naar het objectief is gericht. Zoek een gebied met neurieten dat niet te dicht is en dat zich op afstand van het soma bevindt, aangezien daar resterende kleurstof kan achterblijven.
Zoom in op een gezichtsveld van 51 bij 51 microns. Gebruik beeldbewerkingssoftware om een Z-stack op te nemen over een diepte van 7,8 microns, verdeeld over 27 stappen van 0,3 microns per stap.
Scan eerst voor het VLU T one-antilichaam om alle glutamaterge synapsen in het gezichtsveld te identificeren. Scan vervolgens opnieuw voor FM 1 43 FX-fluorescentie om de beelden na acquisitie te analyseren. Gebruik analyse-software om de Z-stack om te zetten in een samengestelde afbeelding van één enkel vlak, gebaseerd op de maximale intensiteitswaarde van elk vlak per pixel, en stel de drempelwaarde in.
Om de achtergrondruis te verminderen, worden de uiteinden van VG glu T one geïdentificeerd zonder referentie naar de FM 1 43 effects-kleuring. Markeer deze puncta als regio's van interesse. Gewoonlijk selecteren we 10 puncta per veld.
Herhaal de drempelwaardeinstelling en de selectie van puncta op de FM 1 43-effectenafbeelding en superponeer de afbeeldingen om stille synapsen te identificeren. Een absoluut pixelcriterium of een percentage-pixelcriterium kan worden gebruikt om actieve FM 1 43-positieve synapsen te onderscheiden van inactieve FM 1 43-negatieve synapsen. In onze culturen stellen we vast dat 70 tot 80% van de glutamaatsynapsen, gedefinieerd door V glut one-kleuring, detecteerbare FM 1 43-kleuring vertoont in overlappende afbeeldingen van groene FM 1 43-fluorescentie en rode V glut one-kleuring.
Dit is duidelijk zichtbaar als een overvloed aan gele puncta-synapsen met colokaliserende markers. Deze worden aangegeven door de pijlen. Ongeveer 20 tot 30% van de rode Vglut1-positieve puncta zullen geen groene FM 1-43-fluorescentie boven de baseline vertonen.
Dit zijn de inactieve presynaptische terminals en een voorbeeld wordt aangegeven door de pijlspunt. Er zal ook een derde populatie synapsen worden waargenomen. Deze zijn positief voor groene FM 1 43 fluorescentie, maar vertonen geen rode B glut one kleuring.
Dit zijn actieve GABAerge synapsen en een voorbeeld wordt aangegeven met het sterretje. Deze worden uitgesloten van de meeste van onze analyses, maar kunnen expliciet worden bestudeerd met een antilichaam tegen de vesiculaire GABA-transporter. In plaats van het VLU T one-antilichaam hebben we zojuist laten zien hoe presynaptisch stille synapsen gevisualiseerd kunnen worden met FM 1 43 en VLU one-immunokleuring.
Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat FM 1 43 FX gevoelig is voor zowel de tijd in de adver sub seven-was als de concentratie van de behandelende X 100 in de blokkeringsoplossing. Dat was het. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het identificeren van stille presynaptische terminalen in het centrale zenuwstelsel. Door vitale kleuring te combineren met immunokleuring, kunnen onderzoekers onderscheid maken tussen actieve en stille synapsen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Synaptische functie
Achtergrond
- Sommige presynaptische terminals zijn niet-functioneel of stil.
- Het begrijpen van synaptische activiteit is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het identificeren van stille terminals kan helpen bij het bestuderen van verschillende behandelingen.
- Het visualiseren van synaptische activiteit kan inzicht bieden in neuronale communicatie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het identificeren van stille presynaptische terminalen.
- Om de effecten van behandelingen op de synaptische activiteit te onderzoeken.
- Om het begrip van de synaptische dynamiek in neurale netwerken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Labeling van synaptische blaasjes met vitale kleurstoffen tijdens neuronale depolarisatie.
- Immunokleuring met een antilichaam dat alle presynaptische terminals labelt.
- Co-labelingstechnieken om onderscheid te maken tussen actieve en stille synapsen.
- Gebruik van FM1-43 kleurstof om actieve synapsen te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Actieve synapsen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de FM1-43 kleurstof.
- Immunokleuring brengt alle presynaptische terminals in beeld, inclusief de stille terminals.
- Het protocol maakt effectief onderscheid tussen actieve en stille synapsen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van synaptische plasticiteit en functie.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is een waardevolle tool voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Het identificeren van stille terminals kan inzicht geven in behandelstrategieën.
- Deze methode verbetert het begrip van synaptisch gedrag.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het identificeren van presynaptisch stille synapsen maakt mechanische risicoreductie bij targetvalidatie mogelijk door functionele heterogeniteit in neuronale netwerken te onthullen. Deze methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in screeningsassays door actieve van inactieve glutamaatafgiftestplaatsen te onderscheiden. Het ondersteunt de triage van portfolio's door mechanismen van synaptische plasticiteit te koppelen aan ziekterelevante systemen in preklinische modellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door presynaptische silencing- of activatietoestanden te kwantificeren.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk via directe visualisatie van de capaciteit tot vesikelafgifte.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het vertrouwen in het target door cAMP-signalering of elektrische silencing te correleren met functionele uitkomsten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op de evaluatie van verbindingen door middel van co-lokalisatie van FM1-43 FX- en vGluT-1-signalen.
- Kwantitatieve output: Maakt gestandaardiseerde meting van het percentage actieve synapsen mogelijk via drempelwaarde-gebaseerde beeldanalyse.
- Reproduceerbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform via gestandaardiseerde protocollen voor fixatie, kleuring en beeldvorming.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Verbindt presynaptische plasticiteit met hippocampale leer- en geheugenpaden.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug van ontdekking naar preklinische validatie door synaptische adaptatie aan behandelingen te monitoren.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door populaties van stille synapsen onder baseline- en gemoduleerde condities te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door een functionele uitlezing van de presynaptische terminalactiviteit te bieden voorafgaand aan de identificatie van leadverbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van behandelingen die presynaptische silencing beïnvloeden via kaliumdepolarisatie of cAMP-activatie.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare kwantificering van de capaciteit voor glutamaatvrijgave in gedissocieerde hippocampale culturen.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. % FM1-43+/vGluT-1+ puncta), waardoor vergelijking van condities mogelijk wordt.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met preklinische continuïteit door synaptische adaptatie te modelleren die relevant is voor mechanismen van neuropsychiatrische stoornissen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het screenen van modulatoren van de presynaptische functie in verschillende neuronale modellen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door directe beoordeling van de waarschijnlijkheid van vesikelvrijgave.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via een protocol voor fixed-cell imaging en co-kleuring.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit bij synaptische drug-effecten.
- Portfolio-impact: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van functionele gegevens over synaptische modulatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in neuronale kweek, confocale microscopie en fluorescentiebeeldanalyse.
- Vereist instrumentatie, waaronder een laser-scanning microscoop met een 60x olie-objectief en Z-stack acquisitie.
- Vereist standaardisatie tussen teams wat betreft de timing van de kleuring, de kleurstofconcentratie en de strengheid van het wassen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie naar niet-hippocampale neuronale systemen of alternatieve blaasjestransporteurs.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de gevoeligheid van FM1-43 FX voor de duur van de ascorbinezuurwassing en de samenstelling van de blokkeringsoplossing.
