Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

Deze video demonstreert een protocol voor het visualiseren van DNA-replicatie door brede veld optische microscopie gelineariseerd en chemisch gemodificeerd lambda. DNA is bevestigd aan een functioneel glasdeksel. Het vrije uiteinde van het DNA is kralengelabeld en het DNA wordt uitgerekt door laminaire stroming.

Wanneer de replicatie wordt geïnitieerd, begint de leidende streng te verlengen en wordt de achterblijvende streng korter vanwege oprolling. Het grote verschil in lengte tussen dubbelstrengs en enkelstrengs DNA bij lage krachten maakt een directe waarneming van DNA-conversies mogelijk tijdens de replicatie. De lengte van de DNA-constructie wordt gemonitord door de positie van de kraal te volgen, wat een nauwkeurige bepaling van de snelheid en het proces van DNA-replicatie mogelijk maakt.

Hallo, ik ben Ari Ulrich van de Laboratoria van Anto one Vanian en Charles Richardson in het Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology aan de Harvard Medical School. Vandaag gaan we u een procedure laten zien voor het beeldvormen van DNA-replicatie op moleculair niveau. We gebruiken deze procedure in onze laboratoria om enzymatische activiteiten te bestuderen die plaatsvinden tijdens DNA-synthese.

Laten we beginnen. Bij het begin van deze procedure wordt lineair bacteriofagen Lambda DNA gemodificeerd door een knielende oligonucleotide om een replicatievork, een lambda complementaire vorkarm, gebiotinileerd vorkarm en een vorkpriem te vormen. De gebiotinileerd voorkarm bevat een biotin t verbonden aan zijn vijf prime einde, wat het mogelijk maakt om het DNA-sjabloon aan het oppervlak van de flowcel te verankeren.

Het lambda DNA wordt verder gemodificeerd door annealing, een andere oligonucleotide die een diggen en moeilijkheidsgraad bevat die dient als een hoog affiniteit immuno tag voor bevestiging van een kraal. Om de replicatievork te genereren, verkrijg lambda DNA naast verschillende oligonucleotiden waarvan de sequenties in het geschreven protocol bij deze video te vinden zijn. Deze oligonucleotiden omvatten een gebiotinileerd vorkarm, een lambda complementaire vorkarm, een vorkpriem en een lambda complementaire diggen en eind fosforyleer de vijf prime einden van de lambda complementaire vorkarm en de lambda complementaire digo genin eind met behulp van T vier polynucleotidekinase.

Meng vervolgens de gefosforyleerde lambda complementaire vorkarm, de gebiotinileerd voorkarm, de vorkpriem en het lambda DNA in de molaire verhouding van 10 tot 10 tot 100 tot een. In T vier DNA Ligase buffer verwarm het mengsel gedurende vijf minuten op 65 graden Celsius en koel langzaam af tot kamertemperatuur door de hitteblok uit te schakelen om een ​​goede annealing van de oligonucleotiden en T vier DNA ligase in het mengsel mogelijk te maken en incubeer gedurende twee uur. Bij kamertemperatuur zal T vier DNA Ligase het verzegelen van de spleten tussen de oligonucleotiden en de lambda katalyseren.

DNA eindelijk anil de lambda complementaire diggen en eind aan het DNA-replicatiesjabloon door de gefosforyleerde lambda complementaire diggen en eind in T vier Ligase buffer toe te voegen, incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 45 graden Celsius en koel opnieuw langzaam af tot kamertemperatuur door de hitteblok uit te schakelen. Verbind de gefosforyleerde Lambda complementaire dig oxygen en eind aan het DNA-replicatiesjabloon door T vier DNA ligase aan het mengsel toe te voegen en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Het uiteindelijke DNA-replicatiesjabloon is nu klaar voor gebruik. Om de touwspits geactiveerde magnetische kralen aan het DNA-replicatiesjabloon te bevestigen, moeten ze worden gefunctionaliseerd met een FAB-fragment specifiek voor digo genin.

Om dit proces te beginnen, resuspendeer de stockoplossing van kralen en breng 400 microliter over in een einorbuis. Plaats de buis in een magnetische scheider en incubeer tot de oplossing helder is. Verwijder vervolgens het supernatant door te pipetteren. Om de toal groepen voor antilichaamkoppeling te activeren, voeg je een milliliter boid buffer toe en meng voorzichtig door te pipetteren.

Verwijder opnieuw het supernatant met behulp van een magnetische scheider. Voeg vervolgens 240 microliter FAB-fragment toe en resuspendeer de kralen in 400 microliter boraatbuffer. Meng grondig en laat incuberen op een rotator gedurende 16 tot 24 uur bij 37 graden Celsius.

Na incubatie worden de kralen gescheiden met behulp van de magnetische scheider en wordt het supernatant verwijderd. Was de kralen met een milliliter wasbuffer en incubeer gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, verwijder de buffer met behulp van de magnetische scheider. Deze was wordt twee keer herhaald.

Om de vrije tosilgroepen te blokkeren, voeg je een milliliter BSA-bevattende trisbuffer toe en incubeer gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Na incubatie verwijder je de buffer van de kralen met behulp van een magnetische scheider, was twee keer met buffer en aliquot. Voor gebruik wordt het te repliceren DNA aan glasdeksels bevestigd die gefunctionaliseerd zijn met Amil lane.

De oxygroep van de Amil lane bindt aan het glas en laat een amin beschikbaar voor binding aan gebiotinileerde peg-moleculen. Deze coating helpt bij het verminderen van niet-specifieke binding aan het oppervlak. Om de glasdeksels grondig te reinigen, plaats je ze in kleuringsvaten en vul de vaten met ethanol soniceren.

Gedurende 30 minuten, spoel de vaten uit en vul met één molair kaliumhydroxide soniceren gedurende 30 minuten en herhaal beide wasbeurten. Voor de eerste functionaliseringsreactie moeten alle sporen van water worden verwijderd. Vul de kleuringsvaten met aceton en soniceer gedurende 10 minuten.

Leeg de vaten en vul opnieuw met aceton. Ga verder met het toevoegen van het sine-reagens aan de vaten en schud gedurende twee minuten. Kwets vervolgens met een grote overmaat aan water.

Droog vervolgens de deksels door ze gedurende 30 minuten in de oven op 110 graden Celsius te bakken. Bereid vervolgens het peg-mengsel voor op ongeveer 0,2% gewicht per volume. Gebiotinileerd peg, inclusief een glasdeksel ruimtegever, zal de scheiding van de deksels mogelijk maken, pipetteer 100 microliter op een droge siloized deksel.

Plaats een tweede deksel erop. Incubeer de deksels in de PEG-oplossing gedurende drie uur. Scheid vervol