Name: Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Leer een gestandaardiseerd protocol voor eiwitextractie uit Fusarium spp. voor proteoomanalyses volgens MIAPE-richtlijnen. Deze methode minimaliseert experimentele bias tijdens toxine-inductie en verbetert de reproduceerbaarheid van resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Servane Contal en Boris Untereiner voor hun technische bijdrage. Wij erkennen de steun van FNR &quot;FUTOX&quot; project.

Het protocol vereist dat 16 dagen voor de voltooiing ervan. De termijn is gedetailleerd in figuur 1. Details voor buffer voorbereiding <ul><li> Voorbereiding van de lysis buffer (3 ml per monster). </li><li> Voorbereiding van de was-buffer (50 ml per monster). Deze buffer dient vooraf gekoeld en opgeslagen bij -20 ° C in de diepvries tot verdere analyse en op ijs bewaard gedurende de gehele procedure. </li><li> Voorbereiding van de neerslag buffer (20 ml per monster). Deze buffer dient vooraf gekoeld en opgeslagen bij -20 ° C in de vriezer totdat het nodig is en op ijs bewaard gedurende de gehele procedure. </li><li> Het werk moet bij voorkeur worden uitgevoerd in de koude kamer bij 4 ° C. </li></ul> Schimmelspecies Drie stammen gebruikt voor proteomics analyses werden ingedeeld Fusarium graminearum op basis van hun morfologische kenmerken en Vertaling-elongatiefactor Alpha-1 analyse (O'Donnell et al.., 1998) Deze stammen behoorden tot de CRP-Gabriel Lippmann collectie en werden onderhouden en opgeslagen bij - 80 ° C in 15% glycerol. Voorbereiding van de mycelia Schimmels werden gekweekt op V8 gedurende 4 dagen bij 25 ° C afwisselend lichte en donkere periode per 12 uur. Culturen werden gefragmenteerd met behulp van een steriel mes en stukjes van deze culturen werden gebruikt om 250 ml Erlenmeyer kolven met 100 ml van toxine-inducerende media inoculeren. Mycelia werden geoogst na 10 dagen en werden gescheiden van medium door het filteren van de cultuur met een steriele filter. Mycelia werden 3 maal gewassen met steriel water om residuen van het medium en andere verbindingen te verwijderen. Vervolgens hebben we meteen bevroor de cellen door toevoeging van vloeibare stikstof en de monsters bewaard bij -80 ° C. Algemene beschrijving van het eiwit-extractie Eiwit monsters werden geëxtraheerd met behulp van de methode beschreven in de figuur 3A en 3B. De Fusarium monsters werden gemalen in vloeibare stikstof en het poeder werd verzameld in 10 ml Teflon buizen. De monsters werden vervolgens geïncubeerd 30 minuten met de lysis buffer, gekookt gedurende 10 minuten, en 2 maal gecentrifugeerd bij kamertemperatuur (12000g gedurende 15 minuten). De supernatanten werden verzameld en geïncubeerd bij -20 ° C met neerslag buffer 's nachts. Na centrifugeren bij 4 ° C 30000g gedurende 45 minuten, de pellets van de neergeslagen eiwitten werden 3 maal gewassen met koude aceton met DTT. Ten slotte is de pellets werden lucht gedroogd en de eiwitten werden resolubilized in de etikettering buffer, het aanpassen van pH op 8. Een sub-steekproef van 30 ml werd verwijderd voor totaal eiwit kwantificering en de overige supernatant werd opgeslagen bij -20 ° C tot eiwit elektroforese. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Tijdlijn van de procedure. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schema voor meerdere operators sample-verwerking. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="Figuur 3a" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3a"> Figuur 3a. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Figuur 3b" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3b"> Figuur 3b. Alstublieft <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">Klik hier</a> om een grotere versie van figuur 3a, of zie <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">hier</a> voor een grotere versie van figuur 3b. Figuren 3a-b Flow kaarten voor het eiwit extractieprocedure (A: de eerste dag, B: tweede dag).. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Figuur 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. 1D beeld van de proteïne-extracten. Eiwitten werden uitgevoerd tot volledige migratie van blauw tot het einde van de gel die werd gekleurd met lava Purple. Gelieve <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 4 te zien.

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

De recente interesse in proteomische benaderingen binnen de schimmel biologie domeinnaam heeft geleid tot een toename van het aantal publicaties met behulp van deze techniek (zoals besproken in Kim et al., 2007).. Methoden voor eiwitextractie rekenen op een combinatie van extractie procedures, ze zijn vaak nauwelijks beschreven in de methodologische secties en vereisen expertise in het omgaan met de mogelijke methoden voor probleemoplossing. Net als voor andere &quot;omics&quot;-benaderingen, het vaststellen van normen voor het monster en verwerking van gegevens is essentieel om betrouwbare wetenschappelijke informatie te genereren. Bovendien monsters en procedures van manipulatie moeten adequaat worden omschreven, teneinde een gemeenschappelijk resultaat interpretatie tussen de verschillende &quot;omics&quot; experimenten toe te staan. Dit zou essentieel zijn voor het volledig benutten van potentieel van cross-data mining in genomics, proteomics, metabolomics, ... (Morrison et al., 2006).. Minimale informatie over een proteomics experiment is opgesteld en de werkgroepen zijn ingesteld om alle aspecten van een experiment (gel electroforese, massaspectrometrie, moleculaire interacties, eiwitmodificaties, Proteomics Informatica, Sample Processing) aan te pakken. Op dit moment geen gebruik van informatie zijn beschikbaar op monster verwerking procedures. Gezien het belang van eiwit-extractie procedures in het bepalen van de uiteindelijke kwaliteit van proteoomanalyse studies, om procedures die standaardisatie kan verhogen in het kader van MIAPE richtlijnen (Taylor et al., 2007). Implementeren, hebben we voorgesteld het gebruik van een video-protocol waarin monster verwerking. Video beschrijving van de experimenten kunnen aanzienlijk bijdragen tot het aantal van informatie over de verwerking van monsters die kunnen leiden tot een betere reproduceerbaarheid van &quot;omics&quot; experimenten (Pasquali, 2007) te verhogen. Inderdaad, reproduceerbaarheid over laboratoria is een fundamentele vereiste om de validiteit te waarborgen van proteomics resultaten (http://www.fixingproteomics.org). De cross-laboratorium reproduceerbaarheid wordt beïnvloed door twee factoren: verschillende bezettingen en verschillende operators manipuleren van monsters. In de beschreven protocol, stellen we voor om te presteren biologische repliceert met meerdere operatoren (figuur 2 en video) naar de betrouwbaarheid van de gegevens (dat wil zeggen technische variant van de resultaten wordt rekening gehouden) te verhogen. De procedure beschreven voor eiwit-extractie is gebaseerd op de SDS en verwarming. Dit werd eerder aangetoond dat een goede zuiverheid en hoeveelheid van eiwitten (Bridge 1996) te garanderen. SDS in combinatie met kokend lost celwanden, hydrofobe eiwitten en voorkomt de vorming van oligomeren die afbreken neerslag van eiwitten. Koken maakt het ook mogelijk inactivatie van proteasen. Hetzelfde effect wordt ook geproduceerd door EDTA, PMSF en complete mini-protease-remmer. DTT verwijdert disulfide bruggen in en tussen eiwitten faciliteren eiwit oplosbaar. Om de SDS te verwijderen voordat IEF, zijn eiwitten neergeslagen door aceton / TCA / DTT. Bovendien, aceton / TCA / DTT neerslag kan het verwijderen van bepaalde verontreinigingen, zoals lipiden, nucleïnezuren, zouten en / of fenolische verbindingen wanneer deze verbindingen aanwezig zijn. Net als SDS, deze moleculen voorkomen dat een goede migratie tijdens het IEF. Na deze neerslag, is het noodzakelijk om de neergeslagen eiwitten wassen aceton / DTT, om TCA te verwijderen als het kan interfereren met IEF. Een goed voorbeeld voorbereiding is de sleutel tot goede resultaten. Voor deze, is het ook essentieel om te voorkomen dat verontreiniging van eiwitten uit de omgeving het werken met poeder handschoenen en het respecteren van goede laboratoriumpraktijken. Vanuit een technisch oogpunt, binnen het beschreven protocol, de meest kritische stappen voor het verkrijgen van voldoende hoeveelheden en de zuiverheid van eiwitten zijn twee fasen. Eerste, het slijpen fase waarin volledige vernietiging van de cel is fundamenteel voor eiwitten vrijkomen, en ten tweede, de zuivering van totale eiwitten, een fase omvat het verwijderen van de meerderheid van de lipiden, DNA en andere verontreinigingen die kunnen interfereren met de migratie van eiwitten.

Media en oplossingen PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco), 1 L gedestilleerd water. V8 agar: 200 ml V8 (Campbell, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (Difco), 800 ml gedestilleerd water Toxine inducerende media: 1g K 2 HPO 4, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutaminezuur, 10g sucrose in 1L gedestilleerd water. Lysis Buffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100 ml </td><td> Uiteindelijke concentratie </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCL pH8 </td><td> 5 ml </td><td> 50 mM </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2g of 10 ml </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 500ML </td><td> 10 mM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20 ml </td><td> 0.1mm </td><td> 0,5 M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Compleet mini proteaseremmer </td><td> 1 tablet </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Water </td><td> QSP </td><td></td><td></td></tr></table> Neerslag Buffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100 ml </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20 ml </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> QSP </td><td></td></tr></table> Wassen Buffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100 ml </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> 100 ml </td><td></td></tr></table> Etikettering Buffer (bewaren bij -18 ° C in kleine porties): <table border="1"><tr><td></td><td> 1 ml </td><td> Uiteindelijke concentratie </td></tr><tr><td> Ureum </td><td> 140 mg </td><td> 7M </td></tr><tr><td> Thioureum </td><td> 50 mg </td><td> 2M </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 40 mg </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 30 pi </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> Water </td><td> 1 mL </td><td></td></tr></table>

toxine inductie en eiwitextractie uit fusarium spp. cultures for proteoom studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria zijn filamenteuze schimmels in staat om verschillende gifstoffen produceren. Fusarium mycotoxinen, zoals deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric zuur, moniliformin, enz. .. negatieve effecten hebben op zowel mens en dier en sommige worden beschouwd als pathogeniteit factoren. Proteomische studies toonden effectief te zijn voor het ontcijferen van toxine productie mechanismen (Taylor et al., 2008). Alsook voor het identificeren van potentiële pathogene factoren (papier et al.., 2007, Houterman et al., 2007). Fusaria in. Het wordt daarom van fundamenteel belang betrouwbare methoden vast te stellen voor het vergelijken tussen de proteomische studies om te vertrouwen op echte verschillen gevonden in eiwitexpressie tussen de experimenten, stammen en laboratoria. De procedure die zal worden beschreven zou moeten bijdragen tot een grotere mate van standaardisatie van proteomics procedures door twee manieren. De gefilmde protocol wordt gebruikt om het niveau van de details die nauwkeurig kan worden beschreven toenemen. Bovendien is de beschikbaarheid van gestandaardiseerde procedures te verwerken biologische repliceert moet een hogere robuustheid van de gegevens te waarborgen, rekening houdend met de menselijke factor binnen de technische reproduceerbaarheid van de extractie-procedure. De beschreven protocol vereist 16 dagen voor de voltooiing ervan: veertien dagen voor culturen en twee dagen voor eiwitextractie (figuur 1). Kortom, zijn Fusarium stammen gekweekt op vaste media voor 4 dagen, ze zijn vervolgens handmatig gefragmenteerd en overgebracht naar een aangepaste toxine inducerende media (Jiao et al., 2008.) Gedurende 10 dagen. Mycelium wordt verzameld door filtratie door een Miracloth laag. Slijpen is uitgevoerd in een koude kamer. Verschillende operatoren uitgevoerd extractie repliceert (n = 3), om rekening te houden met de vertekening als gevolg van technische variaties (figuur 2). Extractie was gebaseerd op een SDS / DTT buffer zoals beschreven in Taylor et al.. (2008) met kleine wijzigingen. Totaal eiwitextractie vereist een neerslag proces van de eiwitten met behulp van aceton / TCA / DTT buffer &#39;s nachts en Aceton / DTT wassen (figuur 3a, 3b). Eiwitten werden uiteindelijk resolubilized in het eiwit-etikettering buffer en gekwantificeerd. De resultaten van de extractie werden gevisualiseerd op een 1D gel (figuur 4, SDS-PAGE), alvorens over te gaan tot 2D-gels (IEF / SDS-PAGE). Dezelfde procedure kan worden toegepast voor proteomics analyses op andere groeiende media en andere filamenteuze schimmels (Miles et al., 2007)..

Eiwitextractie voor proteomische analyses in schimmelsoorten vereist een hoge mate van standaardisatie te worden bereikt op basis van de minimale informatie over een proteomics experiment (MIAPE) richtlijnen. We presenteren een video-protocol, dat een procedure voor het minimaliseren van experimentele vooringenomenheid tijdens toxine inductie en eiwit-extractie uit omvat<em&gt; Fusarium spp.</em

Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies

Fusaria zijndraadschimmels die in staat zijn verschillende toxines te produceren. Fusarium-mycotoxinen zoals deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearalenon, fusarinezuur, ...

Deze video beschrijft een procedure die wordt gebruikt om toxine-synthese te induceren in sommige soorten, in dit geval voor, en het protocol voor volledige eiwitextractie dat wordt gebruikt voor proteomische studies in ons laboratorium. De duur van de procedure is 16 dagen: vier dagen voor schimmegroei, 10 dagen voor toxinesynthese en twee dagen voor eiwitextractie. Na vier dagen groeien de kolonies nog steeds actief naar de rand van de plaat.Typisch luchtmycelium wordt gevormd en verzameld met een steriel mesje onder een laminaire flowkast door het oppervlak van de plaat voorzichtig af te krabben. Het mycelium wordt in vijf kleine stukjes gesneden en toegevoegd aan een Erlenmeyerkolf met 25 milliliter toxine-inducerend medium. Toxine-inductie is efficiënter dan in het donker.De kolf wordt afgedekt met aluminiumfolie. De culturen worden vervolgens gedurende 10 dagen geschud, 150 toeren per minuut bij 25 °C. Het medium is SAPH en bevat een hooggeconcentreerde S-rijoplossing.Het is bekend dat een combinatie van een bed met duisternis de toxinesynthese in ria faciliteert. Het mycelium wordt vervolgens gescheiden van de toxinebevattende vloeistof door filtratie op MI-closeweefsel. De vloeistof kan worden gebruikt om het toxinegehalte te meten, terwijl het mycelium wordt gebruikt voor eiwitextractie.Om overdraag van medium te voorkomen, wordt het mycelium drie keer gewassen met steriel water. Het overtollige water moet vervolgens worden verwijderd, waarna vloeibare stikstof wordt toegevoegd; de monsters kunnen vervolgens worden bewaard bij -80°C of worden gebruikt voor proteïne-extractie. De procedure voor proteïne-extractie is gebaseerd op het gebruik van SDS en TCA en bestaat uit verschillende lysisstappen.Er wordt een methode voorgesteld die door meerdere operators kan worden uitgevoerd. Tijdens de extractie van biologische replica's voert een verschillende operator elke replica uit. Deze procedure houdt rekening met verschillen in de extractieprocedure die kunnen ontstaan door verschillende operators die de replica's verwerken.Hierdoor zou een hogere robuustheid moeten blijken wanneer biologische replica's worden vergeleken, aangezien de variabele van de operator is opgenomen in de replica. Tegelijkertijd verkort het gebruik van meerdere operators de verwerkingstijd. Het monster wordt in een steriele vijzel met vloeibare stikstof vermalen totdat het mycelium een fijn poeder is.Deze stap is cruciaal voor de kwaliteit en hoeveelheid van de eiwitten. Mycelium wordt verzameld in 10 ml Teflon-buisjes in een verhouding van vier tienden van het totale volume van de buisjes. Vervolgens wordt lysisbuffer toegevoegd die SDS en verschillende protease-remmers bevat.De buisjes worden vervolgens geschud tot een homogene oplossing is verkregen. Daarna worden de monsters 30 minuten lang geschud in de koelcel om ze verder te homogeniseren; de monsters worden gekookt om celwanden en hydrofobe eiwitten op te lossen. De aanwezigheid van SDS voorkomt de vorming van oligomeren die de precipitatie van eiwitten kunnen verhinderen.Een centrifugatiestap scheidt drie fasen. Eiwitten zijn gesuspendeerd in de transparante oplossing die wordt verzameld in een nieuwe buis op ijs. Het pellet wordt vervolgens gebruikt voor een tweede lyse-stap, waarbij het vortexen, koken en centrifugeren wordt herhaald.De supernatanten van de twee lyses worden samengevoegd om precipitatie uit te voeren met een precipitatiebuffer die aceton, trichlorazijnzuur en DTT bevat. De monsters worden vervolgens gedurende 16 uur overnacht bewaard bij -20 °C om proteïneprecipitatie mogelijk te maken. De proteïnen bevinden zich onderin de buisjes om de precipitatie te bevorderen.De buizen worden op hoge snelheid 45 minuten gecentrifugeerd. De pellet is nu duidelijk zichtbaar. De supernatanten kunnen worden verwijderd met een pipet van vijf milliliter.TCA wordt vervolgens verwijderd door 25 milliliter glaciale wasbuffer te toevoegen die aceton en DTT bevat. Hierna wordt het mengsel grondig en krachtig geschud. Vervolgens wordt er een nieuwe centrifugatiestap uitgevoerd.Het eiwitprecipitaat drijft nu, dus er moet aandacht worden besteed aan het verwijderen van het supernatant. Er wordt een tweede wasstap uitgevoerd door wasbuffer toe te voegen, te schudden en te centrifugeren. De supernatant wordt verwijderd en het monster wordt gedroogd met een vacuümcentrifuge.Wanneer het monster droog is, heeft het eiwit een poederachtige consistentie. Voor bewaring moet het monster-eiwit uit de buis worden verzameld om elektrostatische interferentie van het plastic te verminderen.Er wordt gebruikgemaakt van een elektrostatisch pistool en het proteïnepoeder wordt verzameld met een metalen spatel. De proteïnen worden vervolgens direct resuspenderd in de labelingsbuffer. Gebruikt voor 2D dash 30 minuten bij 800 g per minuut.Voldoende om te solubiliseren. Het eiwit voordat men overgaat tot de kostbare 2D-labeling. De eiwitkwaliteit wordt getest op een SDS-PAGE één-dimensionaal gel, zoals te zien is.De afwezigheid van significante vegen aan de rand van een baan wijst op een goede kwaliteit van het monster.

toxin-induction-protein-extraction-from-fusarium-spp-cultures-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De studie van de ontwikkelingsprocessen van de ascosporen in Gibberella zeae, een procedure voor de collectie onder steriele omstandigheden wordt gefilmd om het hoogste niveau van informatie voor protocol beschrijving te genereren. Dit moet de reproduceerbaarheid van het experiment, een cruciaal aspect bij het volledige genoom expressie profiel testen worden uitgevoerd.

Gibberella zeae Ascospore Productie en collectie voor microarray experimenten.

De verwoesting van de graangewassen door zaad-infecterende schimmels heeft ertoe geleid dat tal van onderzoeksinspanningen om beter te begrijpen plant-pathogeen interacties. Om zaad-schimmel interacties in een laboratorium te bestuderen, ontwikkelden we een robuuste methode voor de kwantificering van de schimmel reproductie, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen met behulp van kernel bioassays.

Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

De leden van het Burkholderia geslacht zijn ziekteverwekkers van klinisch belang. We beschrijven een werkwijze voor het totaal bacterieel eiwit extractie met mechanische verbreking en 2-D gelelektroforese voor daaropvolgende proteoomanalyse.

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em&gt; Burkholderia</em&gt; Soorten

We tonen een werkwijze voor de analyse van aflatoxinen en transgenexpressie in pindazaden dat RNA-stoorsignalen bevatten voor silencing aflatoxine-synthese genen in de schimmel Aspergillus flavus. RNAi-gemedieerde regulering van mycotoxinen in planten is niet eerder gerapporteerd.

RNAi-gemedieerde controle van Aflatoxines in Peanut: Methode om Mycotoxine Productie en transgenexpressie Analyseer de Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Hier presenteren we een protocol om Aspergillus flavus groei en productie van aflatoxine in maïs kernels uiting van een antischimmel eiwit te analyseren.  Met behulp van een stam GFP-uiten A. flavus bewaakt we de infectie en de verspreiding van de schimmel in volwassen kernels in real-time. De bepaling is snel, betrouwbaar en reproduceerbaar.

Remming van de groei van de Aspergillus flavus en aflatoxine productie in transgene maïs uiten van de α-amylase Inhibitor van Lablab purpureus L.

Het doel van dit protocol is het opsporen van verschillende Clostridium perfringens toxinotypes in lokaal aangekochte voedingsmiddelen, in het bijzonder Epsilon toxine die stam types B en D produceren, zonder het gebruik van anaerobe kamers.

Verrijking en detectie van Clostridium perfringens toxinotypes in Retail Food monsters

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

Hier presenteren we een protocol op basis van het meelworm (Tenebrio molitor)-aassysteem dat werd gebruikt voor het isoleren en selecteren van entomopathogene schimmels (EPF) uit bodemmonsters. Een effectieve conidia-getalformule (ECN) wordt gebruikt om een hoge stresstolerante EPF te selecteren op basis van fysiologische kenmerken voor microbiële bestrijding van plagen in het veld.

Isolatie en selectie van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters en evaluatie van schimmelvirulentie tegen insectenplagen

Entomopathogene schimmelkolonies worden geïsoleerd uit tropische bodemmonsters met tenebrio-aas , Galleria-aas en selectief kunstmatig medium, d.w.z. aardappeldextrose-agar verrijkt met gistextract aangevuld met chlooramfenicol, thiabendazool en cycloheximide (CTC-medium).

Vergelijking van methoden voor het isoleren van entomopathogene schimmels uit bodemmonsters

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Leer een gestandaardiseerd protocol voor eiwitextractie uit Fusarium spp. voor proteoomanalyses volgens MIAPE-richtlijnen. Deze methode minimaliseert experimentele bias tijdens toxine-inductie en verbetert de reproduceerbaarheid van resultaten.

Toxine Inductie en eiwitextractie uit Fusarium Spp. Cultures for Proteoom Studies

Meer video's verkennen