Name: PuraMatrix Encapsulation van kankercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer hoe je de eierstokkankercellijn CAR5 inkapselt in PuraMatrix, een zelf-assemblerende peptidegel. Deze methode creëert een 3D-cultuuromgeving die in vivo-omstandigheden beter nabootst voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Technische opmerkingen: <ul><li> Gelering wordt geïnitieerd door de toevoeging van zouten. Daarom is het essentieel dat er geen zouten in contact komen met PuraMatrix tot gelering is gewenst, de blootstelling aan zouten van zeer lage ionische sterkte (bijv. &lt;0.05 M) zal leiden tot onherstelbare gelering. </li><li> Overgebleven voorraad oplossingen die zijn voorbereid kan worden gebruikt op een later tijdstip op voorwaarde dat zij niet in contact komen met zouten. U hoeft geen zorgen te maken over te herhalen ultrasoonapparaat. </li><li> Luchtbellen kunnen verwijderd worden aliquoting PuraMatrix in steriele buizen, gevolgd door centrifugeren. </li><li> Wees zeer voorzichtig tijdens het verwisselen van media zoals aspiratie kan gemakkelijk verstoren de PuraMatrix bed. </li></ul> Materialen: BD PuraMatrix RAD16 Peptide Hydrogel-1% (Cat # 354250): De totale peptide concentratie van het onverdunde mengsel wordt 10 mg / ml. <ul><li> Water Bath ultrasoonapparaat of Vortex </li><li> 96-well celkweek schotel </li><li> Cel Cultuur Media </li><li> Steriel gefiltreerd H 2 O </li><li> Steriel gefiltreerd 20% Sucrose </li><li> Cellen (alle bij 5.000 cellen / putje): OVCAR-5 </li></ul> Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden. Procedure: <ol><li> Ultrasone trillingen van de 1% PuraMatrix (RAD16) in een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 30 minuten om de viscositeit te verminderen alvorens te gebruiken. </li><li> De 1%-oplossing PuraMatrix kan nu worden in hoeveelheden verdeeld in steriele buizen aan toekomstige experimenten te vereenvoudigen. <ol class="lalpha"><li> Vermijd de vorming van luchtbellen, als ze vormen gewoon spin down van de steriele buisjes met PuraMatrix bij 1000 rpm (300 xg) voor 5 minuten. </li><li> De totale peptide concentratie van het onverdunde mengsel wordt 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Twee sets van vier putten zullen worden verzilverd met 2,5 mg / ml en 1,25 mg / ml totaal peptide concentratie, respectievelijk. </li><li> Verdun de PuraMatrix in elk putje set met 0,2 micrometer steriel gefiltreerd 20% sucrose en 13,3% sucrose aan de totale peptide concentraties van 5 mg / ml en 2,5 mg / ml, respectievelijk een 2x concentratie van BD PuraMatrix te bereiken in 10% sucrose. <ol class="lalpha"><li> Maak tot 20% sucrose, verdunnen 10 g sucrose, dan is het volume op 50 ml water. </li><li> 13% en 10% sucrose kan worden bereid door verdunning van de 20% stamoplossing. <ol class="lroman"><li> 13% Sucrose (per 10 ml): 6,5 ml 20% sucrose + 3,5 ml steriele H 2 O. </li><li> 10% Sucrose (per 10 ml): 5,0 ml 20% sucrose + 5,0 ml steriele H 2 O. </li></ol></li></ol></li><li> Bereid een meester mix van PuraMatrix peptide op basis van het aantal putten u van plan bent om te plaat. (Zie onderstaande voorbeeld.) Dan aliquot in afzonderlijke buizen die 25 ml van de master mix. <ol class="lalpha"><li> De master mix moeten worden voorbereid op tweemaal de gewenste uiteindelijke concentratie van het totaal peptide zoals het zal worden verdund met een gelijk volume van cellen tijdens de plating. <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig11.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 1"></li></ol></li><li> Bereid celsuspensies door trypsinizing celmonolaag celculturen. <ol class="lalpha"><li> 2 ml van 0,05% trypsine EDTA kan worden gebruikt voor elke T-75 kolf. </li></ol></li><li> Neutraliseer de trypsine door toevoeging van media voor celkweek met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (gebruik ten minste 2 ml van de media per ml trypsine gebruikt in de vorige stap.) </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1000 tpm (~ 300 xg) voor 5 minuten om een ​​cel pellet te creëren. <ol><li> Resuspendeer de cellen in 10% steriel gefiltreerd sucrose. </li><li> Tel het aantal cellen en weer spin down bij 1000 rpm (~ 300 xg) voor 5 minuten om sporen van zout in de media te verwijderen. </li></ol></li><li> Resuspendeer de OVCAR-5-cellen in 10% sucrose op 2,0 x 10 5 cellen / ml, zodat het uiteindelijke aantal cellen per goed zal 5.000 cellen worden in elk putje. De volgende stappen moeten snel worden uitgevoerd. </li><li> Voeg 25 ul van de 2,0 x 10 5 cellen / ml suspensie aan de eerste persoon buis met 25 ul van de master mix van PuraMatrix zoals weergegeven in het bovenstaande schema. <ol class="lalpha"><li> Snel mix door pipetteren (~ 5 keer op en neer) in de buis zonder dat er luchtbellen. </li><li> Dan pipet de 50 ui celsuspensie / PuraMatrix mengsel in de juiste well van een 96 goed gerecht. </li><li> Initiëren gelering van de BD PuraMatrix door voorzichtig pipetteren 150 ul van media voor celkweek (RPMI + 10% FBS) aan de zijkant van de put <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig12.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 2"></li></ol></li><li> Herhaal de stappen die in acht tot alle bronnen zijn verguld. </li><li> Na 30 minuten heel zachtjes te verwijderen ~ 2 / 3 van de media met een 200 ul pipet om de pH van de hydrogel evenwicht. <ol class="lalpha"><li> GEBRUIK GEEN VACUUM aspirator omdat dit de MATRIX VERSTOREN </li><li> Plaats de pipet tip in de put, zodathet doet niet aan de PuraMatrix bed en voorzichtig media te verwijderen uit de put. </li><li> Zorg moet worden genomen om de matrix niet verstoren tijdens de cultuur van de cellen in PuraMatrix. </li></ol></li><li> Heel voorzichtig voeg 150 ul van verse media voor celkweek aan de zijkant van het putje met cellen ingekapseld in PuraMatrix. </li><li> Wijzig de celkweek media in elk putje om de 48 uur met verse cultuur media door zorgvuldig te herhalen stap 10 en 11. </li></ol> Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/1692/1692_fig1tmb.jpg" alt="Figuur 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="figuur 1"> Figuur 1. OVCAR-5 cellen werden ingekapseld zoals beschreven in de bovenstaande protocol. Beelden werden verkregen met behulp van een omgekeerde Olympus FV1000 microscoop uitgerust met Spectra-Physics DeepSee Ti: saffier laser afgestemd op 750 nm. Imaging sessies werden uitgevoerd op dag 1, 3, 5 en 7 post-plating. Een lange werkafstand, water dompelen 40x objectief (Olympus LUMPLFLN 0.8 NA) werd gebruikt om de afbeelding door de PuraMatrix. Drie-dimensionale volumes werden verzameld door de overname van image stacks in 1,47 micrometer axiale stappen. Twee niet-descanned detectoren verzamelde de autofluorescentie-emissie met behulp van violet (440-490 nm) en groen (510-550 nm) banddoorlaatfilters. De laatste foto's en diepte-stack films werden verwerkt met behulp van ImageJ door combinatie van beide detectie-kanalen. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1692/1692_fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

<ol><li>Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+Peptide+nanofiber+scaffolds+for+adult+mouse+neural+stem+cell+3-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling Peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures.</a> PLoS One. 1, e119-e119 (2006).</li>
</ol>

puramatrix encapsulation van kankercellen

PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells

Steeds meer gegevens wijzen erop dat het kweken van kankercellen in drie dimensies nauwkeuriger recapituleert de complexiteit van de tumor biologie. Veel van deze modellen maken gebruik van gereconstitueerde basaalmembraan afkomstig van dieren die een variabel bedrag van groeifactoren en cytokinen die de groei van deze celcultuur modellen kunnen beïnvloeden bevatten. Hier beschrijven we in detail de bereiding en het gebruik van PuraMatrix, een in de handel verkrijgbaar zelfassemblerende peptide gel die verstoken is van dierlijke materiaal en ziekteverwekkers te integreren en te verspreiden van de eierstokkanker cellijn, OVCAR-5. We beginnen met de beschrijving van hoe de PuraMatrix voor te bereiden voor gebruik. Vervolgens laten we zien hoe goed de PuraMatrix en celsuspensie mix om de cellen in te kapselen in de hydrogel. Na de toevoeging van celkweek media of een injectie in een fysiologische omgeving, de peptide component van PuraMatrix snel zelf assembleert in een 3D-hydrogel dat een nanometer schaal vezelachtige structuur vertoont met een gemiddelde poriegrootte van 500 tot 200 nm<sup&gt; 1</sup&gt;. Daarnaast hebben we laten zien hoe je culturen gekweekt in ingekapselde PuraMatrix propageren. Wanneer ingekapseld in PuraMatrix, OVCAR-5-cellen monteren in drie dimensionale acinaire structuren die meer lijken op de morfologie van micrometastatische knobbeltjes waargenomen in de kliniek dan monolaag in vitro modellen. Met behulp van confocale microscopie illustreren we het uiterlijk van de representatieve OVCAR-5-cellen ingekapseld in PuraMatrix op dag 1, 3, 5 en 7 na de plating. Het gebruik van PuraMatrix tot cultuur kankercellen moeten verbeteren ons begrip van de ziekte en kunnen we de behandeling respons te beoordelen in meer klinisch voorspellende modelsystemen.

Deze video laat zien hoe u in te kapselen en cultuur kankercellen in PuraMatrix, een commercieel verkrijgbaar zelfassemblerende peptide gel.

PuraMatrix Encapsulation van kankercellen

Er zijn steeds meer aanwijzingen dat het kweken van kankercellen in drie dimensies de complexiteit van de tumorbioologie nauwkeuriger nabootst. Veel van deze ...

Monolaag-celcultuurmodellen zijn zeer nuttige instrumenten geweest voor het bestuderen van diverse ziekten, waaronder kanker. Deze modellen slagen er echter niet in om de driedimensionale omgeving na te bootsen die in vivo wordt waargenomen. Deze video demonstreert het gebruik van pure Matrixx, een commercieel verkrijgbare zelf-assemblerende peptidegel, om de eierstokkanker-cellijn CAR five te inkapselen en te kweken.De celsuspensie wordt gemengd met de pure Matrixx en celkweekmedium wordt toegevoegd om de initiatie van de pure Matrixx te starten wanneer deze wordt ingekapseld en gekweekt in pure Matrixx van Carv; vijf cellen assembleren tot 3D ASIN R-structuren die lijken op de morfologie van micrometastatische noduli. Hoi, ik ben Adnan Abbi.Ik ben een onderzoeker in het laboratorium van Dr. TBA Hassan bij het Woman Center for Photo Medicine van het Massachusetts General Hospital. Vandaag tonen we u een protocol voor het inkapselen en kweken van een eierstokkanker-cellijn in een synthetische matrix genaamd pure matrix. In ons laboratorium gebruiken we dit model om de behandelingsrespons bij eierstokkanker te evalueren.Laten we beginnen. De BD 1%pure matrix RAD 16 peptide-hydrogel heeft een totale peptideconcentratie van 10 mg/mL vóór gebruik. Verlaag de viscositeit van de pur matrix door deze in een waterbad te sonceren; sonceer gedurende 30 minuten terwijl steriele omstandigheden worden gehandhaafd.Verdeel de 1% pure matrix-oplossing over steriele buisjes. Om toekomstige experimenten te vereenvoudigen, dient de vorming van luchtbellen te worden voorkomen; indien er bellen ontstaan, centrifugeer de steriele buisjes met de pure matrix dan kortstondig bij 1000 RPM gedurende vijf minuten. In deze demonstratie zullen we twee sets van vier wells platen bij een totale peptideconcentratie van respectievelijk 2,5 mg/mL en 1,25 mg/mL. Bereid twee mastermixen van de pure matrix-peptide voor op basis van het aantal wells dat u wilt platen, wat in dit geval acht is.Elke mastermix moet worden bereid met een tweemaal zo hoge concentratie van het totale peptide als de gewenste eindconcentratie, aangezien deze tijdens het uitplaten met een gelijk volume cellen zal worden verdund. Om de mastermixen te maken, wordt de pure matrix verdund met steriele 10% sucrose en 13,3% sucrose tot totale peptideconcentraties van respectievelijk 5 mg/mL en 2,5 mg/mL, om zo een 2x concentratie van pure Matrixx in 10% sucrose te bereiken. Verdeel vervolgens 25 µL van de mastermixen over acht afzonderlijke buisjes. De mastermixen van de pure matrix zijn nu klaar voor het inkapselen van cellen. De eierstokkanker-cellijn CAR5 zal in dit experiment worden ingekapseld en gepropageerd. Incubeer de cellen vóór trypsinisatie gedurende 15 tot 20 minuten met 10 mL steriele PBS zonder calcium en magnesium.Zuig de PBS af en behandel een cellaagcultuur met trypsine; neutraliseer de trypsine door cellenkweekmedium toe te voegen dat 10% hitte-inactief foetaal runderserum bevat. Gebruik ten minste twee milliliter medium per milliliter trypsine die in de vorige stap is gebruikt. Breng de cellen vervolgens over in centrifugebuisjes en centrifugeer de cellen bij 1000 RPM gedurende vijf minuten om een cellpellet te vormen.Na centrifugatie van de reus-cellen wordt het celpellet geresuspendeerd in 10% steriel gefilterde sucrose. Tel de cellen en centrifugeer opnieuw bij 1000 RPM gedurende vijf minuten. Om sporen van zouten in het reus-medium te verwijderen, worden de O car five-cellen geresuspendeerd in 10% sucrose bij een concentratie van 2 × 10⁵ cellen per milliliter, zodat het uiteindelijke celgetal 5.000 cellen per well zal zijn.De cellen zijn nu klaar voor inkapseling in de pure Matrixx. De volgende stappen voor het inkapselen van cellen in de pure matrix moeten snel worden uitgevoerd: voeg 25 µL van de eerder bereide celsuspensie toe aan de eerste individuele buis die 25 µL van de mastermix van pure Matrixx bevat. Meng snel door ongeveer vijf keer op en neer te pipetteren in de buis, zonder luchtbellen te introduceren.Pipette vervolgens de 50 µL cel-suspensie van het pure Matrixx-mengsel in de juiste put van een 96-wells celkweekplaat. Start de activering van de BD pure matrix door voorzichtig 150 µL celkweekmedium naast de wand van de put te pipetteren. Herhaal de stappen voor de inkapseling van de cellen voor de overige putten.Onthoud dat deze stappen snel moeten worden uitgevoerd en dat de volledige inkapselingsprocedure voor één well moet zijn voltooid voordat u doorgaat naar de volgende. Nadat alle acht de wells zijn geplaat, laat u de cellen 30 minuten rusten. Gebruik na 30 minuten een 200 µL pipet en plaats de pipetpunt in de well zodanig dat deze het pure matrixbed niet raakt, en verwijder zeer voorzichtig het medium uit de well. Ongeveer twee derde van het medium moet worden verwijderd om de pH van de hydrogel te equilibreren.Gebruik geen vacuümaspirator, omdat dit de matrix zal verstoren. Voeg vervolgens zeer voorzichtig 150 µL vers celkweekmedium toe aan de zijkant van de well met cellen die zijn ingekapseld in pure Matrixx. Verwijder op dezelfde wijze als eerder getoond twee derde van het medium en voeg vers medium toe aan de resterende wells.Vervang het celkweekmedium in elke well elke 48 uur door vers kweekmedium. Ocar five-cellen werden ingekapseld zoals gedemonstreerd in de voorgaande procedure. Representatieve 3D-renders van afbeeldingen van ingekapselde en gekweekte OR five-cellen in een zuivere matrix op dag 1, 3, 5 en 7 worden getoond.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u de eierstokkanker-cellijn OCar5 kunt inkapselen in een kweek met behulp van een synthetische matrix genaamd Pure Matrixx. Bij het gebruik van Pure Matrixx is het belangrijk om te beseffen dat dit protocol is geoptimaliseerd voor de OCar5-cellijn. Elke onderzoeker zal het protocol moeten optimaliseren en verfijnen voor zijn of haar specifieke cellijn.En onthoud dat het bij het vervangen van het medium erg belangrijk is om het matrixbed niet te verstoren omdat dit zeer fragiel is; aspireer nooit en gebruik altijd een pipet. Dat is alles. Hartelijk dank voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De mesotheelcellen klaring test hier beschreven maakt gebruik van fluorescent gelabelde cellen en time-lapse video-microscopie kwantitatief te visualiseren en meten van de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen. Deze test modelleert de eerste stappen van eierstokkanker metastase.

In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase

De cytotoxische activiteit van de fenanthridine PJ-34 in kankercellen ondergaan mitose werd in real time gedocumenteerd door levende confocale beeldvorming. PJ-34 uitgeroeide menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen die extra-centrosomes in mitose. In tegenstelling tot normale bifocale mitose, werden de extra-centrosomes niet geclusterd in de twee polen spil in aanwezigheid van PJ-34.

Cel dood in verband met abnormale Mitosis Waargenomen door confocale Imaging Live kankercellen

Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is ​​een opkomende hulpmiddel om een ​​stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.

Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Hier presenteren we een protocol voor het inkapselen van katabolische cellen, die lipiden consumeren voor warmteproductie in intra-abdominaal vetweefsel en de energiedissipatie bij obese muizen verhogen.

Inkapseling Thermogenic preadipocyten voor transplantatie in VetWeefsel Depots

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Hier beschrijven we een methode van lange-termijn tijds-lapse microscopie om individuele cellen longitudinaal te volgen in reactie op anti-kanker therapieën.

Through the Looking Glass: Time-lapse microscopie en Longitudinal volgen van enkele cellen aan anti-kanker Therapeutics Studie

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Hier beschrijven we een driedimensionale cultuur-methode voor het analyseren van de morfologie van primaire borstkankercellen, alsmede over de studie van hun directe/indirecte interacties met monocyten en de resultaten zoals de aantasting van het collageen, immuun cel aanwerving, cel invasie, en bevordering van kanker-gerelateerde ontsteking.

Analyseren van de communicatie tussen monocyten en primaire borstkankercellen in een extracellulaire Matrix extraheren (ECME)-gebaseerde driedimensionaal systeem

Paracrine en juxtacrine cellulaire interacties spelen een belangrijke rol in vele biologische processen, met inbegrip van de progressie van de tumor, immuunresponsen, angiogenese en ontwikkeling. Hier, wordt een proximale cultuur-methode gebruikt om te studeren paracrine signalering waar de gelokaliseerde concentraties van de secreted factoren terwijl het voorkomen van rechtstreekse cellulaire contacten worden onderhouden.

Een proximale cultuur methode om te studeren Paracrine signalen tussen cellen

Leer hoe je de eierstokkankercellijn CAR5 inkapselt in PuraMatrix, een zelf-assemblerende peptidegel. Deze methode creëert een 3D-cultuuromgeving die in vivo-omstandigheden beter nabootst voor kankeronderzoek.

PuraMatrix Encapsulation van kankercellen

Meer video's verkennen