Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

In dit videoartikel wordt real-time PCR gedemonstreerd met behulp van Solaris QPCR-assays. Solaris QPCR-assays zijn genspecifieke probe- en primer-sets die zijn ontworpen om alle bekende splicevarianten van een bepaald gen te detecteren. Onder universele thermocyclusomstandigheden beschikt de Solaris-probe over een minor groove binder-groep en een FA-reporter aan het 5'-uiteinde en een eclipsed dark quencher aan het 3'-uiteinde.

Tijdens de denaturatiestap van real-time PCR blijft de probe in oplossing en wordt de fluorescentie van de FAM-reporter onderdrukt. Tijdens de annealing- en extensiefasen binden de primers en de probe aan de doelsequentie, waardoor de quencher van FAM wordt gescheiden. FAM geeft vervolgens een sterk fluorescent signaal af; wanneer de probe dissocieert, wordt de fluorescentie opnieuw onderdrukt.

Er worden real-time PCR-resultaten verkregen die de sensitiviteit, specificiteit en reproduceerbaarheid van deze efficiënte assay aantonen. Hallo, ik ben James Covino van het Research and Development Team van Thermo Fisher Scientific in Lafayette, Colorado. Vandaag laten we u een procedure zien voor het opzetten van een standaard QPCR-reactie met behulp van Lars QPCR-genexpressiereagentia.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de knockdown van doelgenen te bestuderen met behulp van RNA-interferentietechnologieën. Laten we beginnen. De Solaris QPCR assay STEM wordt gekenmerkt door een uniek algoritme dat gebruikmaakt van MGB- en superbase-technologieën om één handige assay te bieden voor 98% van de geannoteerde menselijke en muisgenen.

Doorgaans wordt het ontwerp van DNA-sondes en primers beperkt door de smelttemperatuur van de sonde, die wordt bepaald door het aantal en het type basen. Langere sequenties en GC-rijke sequenties hebben hogere smelttemperaturen. Het minor groove-bindende deel dat in Solaris-sondes wordt gebruikt, past in de minor groove van de DNA-helix en stabiliseert de interactie tussen de sonde en de doelsequentie.

Dit verhoogt de smelttemperatuur, waardoor kortere probes kunnen worden gebruikt. Het Solaris-algoritme incorporeert daarnaast selectief gemodificeerde nucleotiden, genaamd super bases, om de stabiliteit van AT-bindingen te verbeteren en GG-zelfassociatie in guaninerijke sequenties te elimineren. Hierdoor kunnen targetsequenties worden gebruikt die anders vermeden zouden worden.

De verhoogde sequentieflexibiliteit die door het gebruik van deze technologieën wordt geboden, maakt het ontwerp mogelijk van primer-sonesets die alle bekende splicevarianten van een enkel gen herkennen. Merk op dat waar mogelijk regio's die exon-overgangen overspannen zijn opgenomen in de targetsite om de specificiteit te verhogen door amplificatie van contaminerend genomisch DNA te vermijden; de resulterende primer-sonesets zijn via blast geanalyseerd met behulp van drie verschillende databases (genomisch, transcript en pseudogen) om de specificiteit te waarborgen. Bovendien zijn de Solaris primer-sonesets volledig geoptimaliseerd zodat de cycluseringscondities voor alle qPCR-assays identiek zijn, waardoor de expressie van verschillende transcripten in enkele PCR-runs kan worden beoordeeld.

Om te beginnen met de planning van het qPCR R-experiment, identificeert u de reagentia die nodig zijn om qPCR uit te voeren voor het gen van belang met behulp van de genius-productzoekfunctie, die te vinden is op thermo.com/solaris. Klik in het zoekveld en kies het juiste doelorganisme. De genius-productzoekfunctie kan veel verschillende gen-identificatoren verwerken. Hier.

Voer een van de voorgestelde zoektermen voor het gen van belang in, klik vervolgens op zoeken, identificeer het gen van belang en klik aan de linkerzijde op selecteren. Er wordt nu een venster geopend waarin de verschillende beschikbare reagentia voor het gen van belang worden getoond. Klik onder de Solaris gene expression assay op het tabblad QPCR detection.

Een optimaal ontworpen Solaris-probe primer assay wordt weergegeven. Deze ene assay zal alle bekende splicevarianten van het gen van belang detecteren. Zodra het geschikte primer-agens is geïdentificeerd, selecteer dan de te gebruiken QPCR-cycler in het menu en identificeer de compatibele mastermix, zijnde ofwel de mastermix met een apart flaconnetje met passieve referentiekleurstof (ROX), de ROX-mix, of de low-ROX-mix.

Hier maken we gebruik van de Roche LightCycler 480, waarbij de Master Mix Plus-cuvetten worden gebruikt. Het is daarnaast belangrijk om ervoor te zorgen dat er een geschikt referentiegen in deze studie is opgenomen. B2M zal worden gebruikt zodra alle Solaris qPCR-reagentia zijn ontvangen.

Deze moeten worden bewaard bij -20 °C tot aan gebruik. De reagentia zijn ten minste 12 maanden stabiel. Herhaaldelijk vries-dooi-cycli moeten worden vermeden.

Bereid cDNA voor voor qPCR door reverse transcriptie-reacties uit te voeren op het monster-RNA. Zodra het cDNA is voorbereid, laat u de Solaris assay en de mastermix ontdooien op ijs. De mastermix bevat alle componenten voor kwantitatieve PCR, behalve de genspecifieke assay; de template-componenten omvatten thermostat, DNA-polymerase dn en TPS rocks.

Indien het QPCR-instrument beads en een eigen reactiebuffer met een blauwe indicator bevat, houd dan ook PCR-water en QPCR-plaatjes bij de hand. Zodra de oplossingen zijn ontdooid, mengde deze door kort te tikken en centrifugeer de oplossingen vervolgens kort om verlies van reagentia te voorkomen. Bereid daarna in een buis van 15 milliliter een 1x Solaris QPCR-assay en mastermix voor.

Combine voor het gewenste aantal monsters dat op een 384-wells plaat wordt uitgevoerd vijf microliter 2x mastermix, 0,5 microliter 20X Solaris-assay en PCR-waardig water, zodanig dat het uiteindelijke volume in elke well 10 microliter bedraagt. Zorg ervoor dat na toevoeging van het cDNA voldoende mengsel wordt voorbereid voor drie replica's van elk monster, inclusief een controle zonder template (NTC) en een controle zonder reverse transcriptase (no RT), om respectievelijk te controleren op gecontamineerde reagentia of contaminerende genomisch DNA. Breng het mengsel vervolgens over naar een steriel reservoir.

Gebruik vervolgens een meerkanaalpipet om het juiste volume van de 1x mastermix over te brengen naar de betreffende wells van de PCR-plaat. Indien witte platen worden gebruikt, helpt de aanwezige blauwe kleurstof in de mastermix bij het volgen van de voortgang van het pipetteren. Meerdere cDNA-bibliotheken en referentiegenen kunnen op dezelfde plaat worden geanalyseerd, aangezien alle cyclustijden en -condities identiek zijn.

Zodra de one x mastermix aan de juiste wells is toegevoegd, voegt u verdund CD NA template toe aan elke well, zodat het uiteindelijke volume 10 µL is; pipetteer herhaaldelijk op en neer om te mengen. Sluit de plaat af met een plakfolie of een hitteseal, zoals hier wordt getoond.

Plaats de plaat in een centrifuge en centrifugeer deze kort om de reagentia naar de bodem van de put te brengen en eventuele bellen te verwijderen die de fluorescentiemetingen kunnen verstoren. In het thermocycler-programma moet de hot-start polymerase in de Solaris QPCR master mix worden geactiveerd bij 95 °C gedurende 15 minuten (één cyclus), gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 15 seconden en een annealing/extensie bij 60 °C gedurende 60 seconden. Dit protocol is hetzelfde voor alle Soliris QPCR-assays, ongeacht het gen dat wordt geamplificeerd.

Plaats tot slot de plaat in het QPCR-instrument en start het programma. Deze figuur demonstreert hier de hoge prestaties van de Solaris-assays; 10voudige verdunningen van synthetisch DNA of cDNA werden geamplificeerd met behulp van de Solaris QPCR-genexpressie-assays voor CDC 20 en F two RL one. De amplificatiecurven op logaritmische schaal en standaardcurven voor de 10 log 10 verdunningen tonen de hoge prestaties van de assay, zelfs bij lage inputconcentraties.

De prestaties van elke assay worden gemeten aan de hand van de efficiëntie, de kwadraatwaarde van het dynamische bereik op een schaal van 10, log 10-verdunningen en de onderste detectiegrens. De hier getoonde gegevens demonstreren de reproduceerbaarheid van Solaris-assays. Hierbij werden aliquots van CD NA geamplificeerd in twee geografisch gescheiden laboratoria met behulp van Solaris QPCR-genexpressie-assays en mastermix.

Dezelfde expressieniveaus werden in beide laboratoria berekend voor twee gen-doelen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een standaard QPCR-reactie opzet met behulp van Solaris QPCR-reagentia voor genexpressie. Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om eraan te denken mastermixen samen te stellen met de juiste uiteindelijke concentratie van reagentia en passende biologische en/of technische replica's op te nemen.

Daarnaast is het essentieel om het QPCR-instrument in te stellen met de juiste thermocycling-condities voor Solaris. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.