Name: Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Leer kwantitatieve real-time PCR met Solaris qPCR Assays voor genexpressieanalyse. Deze methode detecteert alle bekende splicevarianten met hoge specificiteit en reproduceerbaarheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. De Thermo Scientific Solaris qPCR Assay Ontwerp Algorithm <ol><li> Het algoritme gebruikt in het ontwerp van de Solaris qPCR probe / primerparen past de Tm van elke component waardoor universele fietsen voorwaarden. Incorporatie van de MGB, of minor groove binding, eenheid in de sonde verhoogt de Tm en zorgt voor kortere probes worden ontworpen voor een grotere assay flexibiliteit en prestaties. Zoals hun naam al aangeeft, MGBs zijn een klasse van antibiotica die kunnen passen in de kleine groef van de DNA-helix. MGBs zijn gekoppeld aan de 3 of 5 einde van een DNA-probe. In oplossing, is de FAM verslaggever fluorescentie van de sonde gedoofd door Eclipse Dark Quencher. Wanneer de probe bindt aan een doelsequentie, de daaruit voortvloeiende wijziging in 3-D van de sonde s bouw zorgt voor een sterke fluorescerende signaal. Binding van het DNA-sonde naar doelsequentie wordt gestabiliseerd door de MGB, die het gebruik van zeer specifieke, kortere probes kunnen met behoud van de juiste smelttemperatuur voor PCR. Zo signaaldetectie treedt op tijdens de annealing fase van doelamplificatie. Gedurende de verlenging stap, de MGB probe distantieert en de fluorescentie is weer gedoofd. Omdat de sonde distantieert, is het niet van invloed op PCR-efficiëntie. </li><li> Een ander kenmerk van het Solaris-algoritme is het gebruik van Superbases. Superbases zijn gemodificeerde basen die verhoogde binding mogelijkheden om de stabiliteit van AT obligaties te verbeteren en de GG self-vereniging in guanine rijke sequenties te elimineren. Bovendien hebben ze niet uitdoven aangrenzende fluoroforen bevestigd op het 5 eindpunt. Deze bases worden selectief geplaatst, volgens het algoritme, om de beschikbaarheid van doelsequenties uit te breiden. Dit maakt het mogelijk om sequenties, zoals de GC-rijke regio's, die anders zouden worden vermeden in het ontwerpen van primers en probes. </li><li> Waar mogelijk, de Solaris-algoritme bevat exon kruispunt verspreid over de regio's in de doelgroep site. Dit verhoogt de specificiteit door het vermijden van de amplificatie van verontreiniging genomisch DNA. </li><li> Belangrijk is dat het algoritme wordt ook een consensus-sequentie voor alle bekende splice varianten, zodanig dat alle vallen onder een sonde / primer in te stellen. Zo is, is slechts een test nodig is voor een bepaald gen van belang. </li><li> Ten slotte is de Solaris qPCR Assay ontwerp algoritme maakt gebruik van zeer strenge parameters voor het ontwerp kritische overwegingen, waaronder GC inhoud, lengte, Tm, en strekt zich uit van homogene nucleotiden. De resulterende sequenties worden BLAST geanalyseerd op specificiteit met behulp van 3 verschillende databases: genomische, transcript, en pseudogen. </li></ol> 2. Het verkrijgen van Solaris Reagentia <ol><li> Voor het verkrijgen van de juiste Solaris reagentia, bezoek <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Klik eenmaal op de website van "GENEius Product Search". Om direct naar het GENEius product zoeken, ga dan naar <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Klik in de zoekactie box en kies de gewenste doelorganisme. </li><li> Het GENEius product zoeken kan verwerken veel verschillende gen-id's. Hier voert u een van de voorgestelde zoektermen om het gen van belang, met inbegrip Ref Seq toetreding, de Gene-ID, de Gene Symbol, een Gene Beschrijving, de Sanger-ID of toetreding nummer, of een catalogus nummer te vinden. Klik vervolgens op "Zoeken". </li><li> Identificeer het gen van interesse en klik op "Select" op de linkerkant. Dit opent een venster waarin de verschillende Thermo Scientific producten die beschikbaar zijn voor het gen van interesse toont. Onder "Producten" selecteer dan de "qPCR Detection" Tab. </li><li> Onder de "Solaris Gene Expression Assay" rubriek, ziet u een optimaal Solaris probe / primer test ontworpen. Deze test zal betrekking hebben op alle bekende splice-varianten van de genen doel. Kies de gewenste hoeveelheid. Ze zijn verkrijgbaar in 100, 200, 400, en 1000 X 25 ul reacties (als de test wordt geïdentificeerd als made-to-order, de 100 verpakkingsgrootte niet beschikbaar). Klik op "Add to Cart". </li><li> Vervolgens selecteert u de juiste master mix voor de thermische cycler die zullen worden gebruikt. Om te bepalen welke master mix het beste zal werken met de machine beschikbaar, klik op "Zoek uit welke Master Mix werkt het beste met uw PCR Cycler!" </li><li> Zoek de qPCR cycler die zal worden gebruikt op het menu om te bepalen welke mix te gebruiken. </li><li> Keer terug naar het product GENEius zoekvenster, en selecteer de juiste master mix. De master mix wordt geleverd in 100, 200, 400, en 1000 reacties maten. Klik op "Add to Cart". </li><li> Suggesties voor referentie genen en verso cDNA synthese kits kunnen ook besteld worden voor een complete qRT-PCR-analyse. </li><li> Wanneer de Solaris qPCR reagentia aankomen, bewaar ze bij -20 ° C tot klaar voor gebruik. De volgende reagentia moeten worden ontvangen: een 20x-oplossing met twee primers die op 800 nM elk en een gen-specifieke probe die bij 200 nm, sequlingen informatie voor zowel de sonde en de primers en Solaris qPCR Gene Expression Master Mix in een 2X concentratie. Solaris qPCR Gene Expression Assays stabiel zijn voor een minimum van 12 maanden. Vermijd herhaaldelijk bevriezen ontdooien. </li></ol> 3. qPCR setup <ol><li> Begin de qPCR protocol met cDNA. Totaal RNA moet worden gewonnen met behulp van een spin kolom methode. De Thermo Scientific Verso cDNA synthese kit wordt aanbevolen voor reverse transcriptie tot cDNA te genereren. </li><li> Bereid je voor op qPCR door het ontdooien van de primers, probes, en master mix op ijs. Ook bij de hand hebt PCR kwaliteit water en ondoorzichtig wit qPCR platen, die de gevoeligheid van de real-time PCR kunnen verbeteren. </li><li> De master mix bevat alle componenten voor real-time PCR, waaronder: 1) Thermo-Start DNA-polymerase, een hot-start versie van Thermoprime DNA-polymerase. Dit type van polymerase wordt gebruikt om niet-specifieke amplificatie te voorkomen dat tijdens de reactie set-up en vereist activering stap bij 95 ° C 15 minuten. 2) dNTPs in het Solaris Master mix, dTTP vervangt dUTP om amplificatie-efficiëntie 3) Proprietary reactiebuffer, geoptimaliseerd om te werken met Solaris primer / probe assays te maximaliseren. Deze reactie buffer bevat blauwe kleurstof te verhogen contrast tussen reagens en kunststof. 4) ROX, als uw qPCR instrument vereist ROX. </li><li> Zodra de oplossingen hebben ontdooid, meng door flicking de buis (niet vortex). Spin ze naar beneden om het verlies van reagens te voorkomen. </li><li> Vervolgens bereiden een 15 ml steriel Falcon buis naar het opzetten van de reactie mix voor het gen van interesse, plus een voor de referentie-gen, opschalen afhankelijk van het aantal monsters. Bereid genoeg zodanig dat drie duplo kan worden voorbereid voor elk monster, met inbegrip van een template geen controle (NTC) en standaard curve monsters, indien de standaard curve methode zal worden gebruikt voor analyse. </li><li> Voor elk monster te draaien op een 96 wells plaat, meng het volgende: 5 pi van de 2X Solaris qPCR Master Mix, 0,5 pi van de Solaris primer / probe set (20X), en PCR-kwaliteit water zodanig dat de uiteindelijke reactie volume, een keer het cDNA wordt toegevoegd wordt 25 uL worden. Voor elk monster te draaien op een 384 wells plaat mix van de volgende: 12,5 pi van de 2X Solaris qPCR Master Mix, 1,25 ul van de Solaris primer / probe set (20X), en PCR-kwaliteit water zodanig dat de uiteindelijke reactie volume, zodra de cDNA wordt toegevoegd zal 10 pi worden. </li><li> Met behulp van een multi-channel pipet, overdracht van de master mix om de juiste putjes van de plaat. De blauwe kleurstof die in de master mix zal hulp bij het opsporen pipetteren de voortgang op de witte borden. Voeg vervolgens de 1-5 pi cDNA template (voor een 96 wells-plaat) of 1-2 ul van cDNA template (voor een 384 wells plaat). Pipet op en neer om te mengen. Plaats de plaat in een centrifuge en spin down om eventuele luchtbellen te verwijderen, omdat deze interfereren met de fluorescentie metingen. </li><li> Programmeer de thermal cycler: Het enzym moet worden geactiveerd met een 95 ° C 15 min (een cyclus). Dan 40 cycli van 95 ° C, denaturatie gedurende 15 seconden, en gloeien en extensie bij 60 ° C gedurende 60 seconden. </li><li> Plaats de plaat in de qPCR instrument. Start het programma. </li></ol> Representatieve qPCR resultaten met Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Solaris testen geven een betrouwbare detectie, zelfs bij zeer lage concentraties ingang, zoals beoordeeld door de PCR-efficiëntie en r2 waarden. Tien 10-voudige verdunningen van cDNA gesynthetiseerd uit synthetische RNA-sequentie of amplicon DNA-sequentie werd geamplificeerd amplicon op een ABI 7900HT instrument met behulp van Solaris qPCR Gene Expression Assay voor F2RL1 of CDC20, respectievelijk. Het log-schaal versterking curves en standaard curves worden getoond, samen met de prestaties van elke analyse inclusief energie-efficiëntie, r2 waarde, dynamisch bereik van de 10 log10 verdunningen, en de ondergrens van detectie. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Solaris Testen geven consistente resultaten zelfs tussen verschillende onderzoekers en laboratoria. siRNA's gericht op ALDOA en PPIB, evenals een niet-targeting Control (NTC), werden getransfecteerd in HeLa cellen op 100, 10, 1 en 0,1 nM eindconcentraties. Cellen werden geoogst en totaal RNA geïsoleerd 48 uur na de behandeling. cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van Thermo Scientific Verso cDNA synthese kit. Een hoeveelheid van het cDNA werd geamplificeerd in twee geografisch gescheiden laboratoria met behulp van Solaris qPCR Gene Expression Testen voor het opsporen van ALDOA, PPIB, en GAPDH op een Roche LightCycler 480 (384-wells) platform. Knockdown was berekend met de ΔΔCq methode (genormaliseerd voor GAPDH referentie-gen en NTC-behandelde cellen). Dezelfde niveaus van knockdown werden aangetoond voor zowel de gen-targets tussen beide onderzoekers van beide locaties.

De auteurs van dit artikel zijn de werknemers van Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris qPCR Testen bieden een eenvoudige, verbeterde methode voor het uitvoeren van qPCR analyse. Met behulp van een hoge stringentie-algoritme, waarin MGB technologie en Superbases, deze primer en probe-sets te maximaliseren de trouw en de robuustheid van qPCR experimenten. Een primer en probe-set herkent alle bekende splice varianten van een bepaald gen. De beoogde locatie, waar mogelijk, ook exon verspreid over de regio&#39;s, om ervoor te zorgen dat de genomisch DNA is niet versterkt. Deze functies maken het mogelijk om gelijktijdig een groot aantal monsters, sterk verminderen van de hoeveelheid tijd die nodig is om complexe experimenten uit te voeren. Omdat de master mix is ​​blauw, is het mogelijk om gebruik witte opake platen, die de gevoeligheid van de qPCR te verbeteren, zonder oog te verliezen van het pipetteren. Alles bij elkaar genomen, het ontwerp kenmerken van de Solaris qPCR Assay maken deze roman qPCR assay een eenvoudige, maar high-performance test die zowel specifiek en robuust.

kwantitatieve real-time pcr met behulp van de thermo scientific solaris qpcr assay

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

De Solaris qPCR Gene Expression Assay is een nieuw type primer / probe set, ontworpen om de qPCR proces te vereenvoudigen met behoud van de gevoeligheid en de nauwkeurigheid van de test. Deze primer / probe sets zijn vooraf ontworpen naar&gt; 98% van het menselijk genoom en de muis en zijn voorzien van een significante verbetering van eerder beschikbare technologieën. Deze verbeteringen zijn mogelijk gemaakt op grond van een nieuwe ontwerp-algoritme, ontwikkeld door Thermo Scientific bioinformatica experts. Een aantal handige functies zijn opgenomen in de Solaris qPCR Assay om het proces van het uitvoeren van kwantitatieve real-time PCR te stroomlijnen. Eerste, het protocol is vergelijkbaar met die algemeen alternatieven, zodat de methoden die worden gebruikt tijdens de qPCR waarschijnlijk bekend te zijn. Ten tweede, de master mix is ​​blauw, waardoor het instellen van de qPCR reacties makkelijker op te sporen. Ten derde, de thermische cycli voorwaarden zijn dezelfde voor alle assays (genen), waardoor het mogelijk is om een ​​groot aantal monsters draaien op een tijdstip en het verminderen van de kans op fouten. Tot slot worden de probe en primer sequentie-informatie verstrekt, de vereenvoudiging van de publicatie proces. Hier laten we zien hoe de juiste Solaris reagentia met behulp van de GENEius product zoekfunctie te vinden op de website bestellen (www.thermo.com / solaris) en hoe het Solaris reagentia te gebruiken voor het uitvoeren van qPCR behulp van de standaard curve methode te verkrijgen.

De Solaris qPCR Gene Expression Assays zijn nieuwe vooraf ontworpen qPCR primer / probe met het doel de qPCR proces te vereenvoudigen zonder dat de specificiteit en robuustheid van de test.

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

De Solaris qPCR Gene Expression Assay is een nieuw type primer/sonde-set, ontworpen om het qPCR-proces te vereenvoudigen terwijl de gevoeligheid en ...

In dit videoartikel wordt real-time PCR gedemonstreerd met behulp van Solaris QPCR-assays. Solaris QPCR-assays zijn genspecifieke probe- en primer-sets die zijn ontworpen om alle bekende splicevarianten van een bepaald gen te detecteren. Onder universele thermocyclusomstandigheden beschikt de Solaris-probe over een minor groove binder-groep en een FA-reporter aan het 5'-uiteinde en een eclipsed dark quencher aan het 3'-uiteinde.Tijdens de denaturatiestap van real-time PCR blijft de probe in oplossing en wordt de fluorescentie van de FAM-reporter onderdrukt. Tijdens de annealing- en extensiefasen binden de primers en de probe aan de doelsequentie, waardoor de quencher van FAM wordt gescheiden. FAM geeft vervolgens een sterk fluorescent signaal af; wanneer de probe dissocieert, wordt de fluorescentie opnieuw onderdrukt.Er worden real-time PCR-resultaten verkregen die de sensitiviteit, specificiteit en reproduceerbaarheid van deze efficiënte assay aantonen. Hallo, ik ben James Covino van het Research and Development Team van Thermo Fisher Scientific in Lafayette, Colorado. Vandaag laten we u een procedure zien voor het opzetten van een standaard QPCR-reactie met behulp van Lars QPCR-genexpressiereagentia.We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de knockdown van doelgenen te bestuderen met behulp van RNA-interferentietechnologieën. Laten we beginnen. De Solaris QPCR assay STEM wordt gekenmerkt door een uniek algoritme dat gebruikmaakt van MGB- en superbase-technologieën om één handige assay te bieden voor 98% van de geannoteerde menselijke en muisgenen.Doorgaans wordt het ontwerp van DNA-sondes en primers beperkt door de smelttemperatuur van de sonde, die wordt bepaald door het aantal en het type basen. Langere sequenties en GC-rijke sequenties hebben hogere smelttemperaturen. Het minor groove-bindende deel dat in Solaris-sondes wordt gebruikt, past in de minor groove van de DNA-helix en stabiliseert de interactie tussen de sonde en de doelsequentie.Dit verhoogt de smelttemperatuur, waardoor kortere probes kunnen worden gebruikt. Het Solaris-algoritme incorporeert daarnaast selectief gemodificeerde nucleotiden, genaamd super bases, om de stabiliteit van AT-bindingen te verbeteren en GG-zelfassociatie in guaninerijke sequenties te elimineren. Hierdoor kunnen targetsequenties worden gebruikt die anders vermeden zouden worden.De verhoogde sequentieflexibiliteit die door het gebruik van deze technologieën wordt geboden, maakt het ontwerp mogelijk van primer-sonesets die alle bekende splicevarianten van een enkel gen herkennen. Merk op dat waar mogelijk regio's die exon-overgangen overspannen zijn opgenomen in de targetsite om de specificiteit te verhogen door amplificatie van contaminerend genomisch DNA te vermijden; de resulterende primer-sonesets zijn via blast geanalyseerd met behulp van drie verschillende databases (genomisch, transcript en pseudogen) om de specificiteit te waarborgen. Bovendien zijn de Solaris primer-sonesets volledig geoptimaliseerd zodat de cycluseringscondities voor alle qPCR-assays identiek zijn, waardoor de expressie van verschillende transcripten in enkele PCR-runs kan worden beoordeeld.Om te beginnen met de planning van het qPCR R-experiment, identificeert u de reagentia die nodig zijn om qPCR uit te voeren voor het gen van belang met behulp van de genius-productzoekfunctie, die te vinden is op thermo.com/solaris. Klik in het zoekveld en kies het juiste doelorganisme. De genius-productzoekfunctie kan veel verschillende gen-identificatoren verwerken. Hier.Voer een van de voorgestelde zoektermen voor het gen van belang in, klik vervolgens op zoeken, identificeer het gen van belang en klik aan de linkerzijde op selecteren. Er wordt nu een venster geopend waarin de verschillende beschikbare reagentia voor het gen van belang worden getoond. Klik onder de Solaris gene expression assay op het tabblad QPCR detection.Een optimaal ontworpen Solaris-probe primer assay wordt weergegeven. Deze ene assay zal alle bekende splicevarianten van het gen van belang detecteren. Zodra het geschikte primer-agens is geïdentificeerd, selecteer dan de te gebruiken QPCR-cycler in het menu en identificeer de compatibele mastermix, zijnde ofwel de mastermix met een apart flaconnetje met passieve referentiekleurstof (ROX), de ROX-mix, of de low-ROX-mix.Hier maken we gebruik van de Roche LightCycler 480, waarbij de Master Mix Plus-cuvetten worden gebruikt. Het is daarnaast belangrijk om ervoor te zorgen dat er een geschikt referentiegen in deze studie is opgenomen. B2M zal worden gebruikt zodra alle Solaris qPCR-reagentia zijn ontvangen.Deze moeten worden bewaard bij -20 °C tot aan gebruik. De reagentia zijn ten minste 12 maanden stabiel. Herhaaldelijk vries-dooi-cycli moeten worden vermeden.Bereid cDNA voor voor qPCR door reverse transcriptie-reacties uit te voeren op het monster-RNA. Zodra het cDNA is voorbereid, laat u de Solaris assay en de mastermix ontdooien op ijs. De mastermix bevat alle componenten voor kwantitatieve PCR, behalve de genspecifieke assay; de template-componenten omvatten thermostat, DNA-polymerase dn en TPS rocks.Indien het QPCR-instrument beads en een eigen reactiebuffer met een blauwe indicator bevat, houd dan ook PCR-water en QPCR-plaatjes bij de hand. Zodra de oplossingen zijn ontdooid, mengde deze door kort te tikken en centrifugeer de oplossingen vervolgens kort om verlies van reagentia te voorkomen. Bereid daarna in een buis van 15 milliliter een 1x Solaris QPCR-assay en mastermix voor.Combine voor het gewenste aantal monsters dat op een 384-wells plaat wordt uitgevoerd vijf microliter 2x mastermix, 0,5 microliter 20X Solaris-assay en PCR-waardig water, zodanig dat het uiteindelijke volume in elke well 10 microliter bedraagt. Zorg ervoor dat na toevoeging van het cDNA voldoende mengsel wordt voorbereid voor drie replica's van elk monster, inclusief een controle zonder template (NTC) en een controle zonder reverse transcriptase (no RT), om respectievelijk te controleren op gecontamineerde reagentia of contaminerende genomisch DNA. Breng het mengsel vervolgens over naar een steriel reservoir.Gebruik vervolgens een meerkanaalpipet om het juiste volume van de 1x mastermix over te brengen naar de betreffende wells van de PCR-plaat. Indien witte platen worden gebruikt, helpt de aanwezige blauwe kleurstof in de mastermix bij het volgen van de voortgang van het pipetteren. Meerdere cDNA-bibliotheken en referentiegenen kunnen op dezelfde plaat worden geanalyseerd, aangezien alle cyclustijden en -condities identiek zijn.Zodra de one x mastermix aan de juiste wells is toegevoegd, voegt u verdund CD NA template toe aan elke well, zodat het uiteindelijke volume 10 µL is; pipetteer herhaaldelijk op en neer om te mengen. Sluit de plaat af met een plakfolie of een hitteseal, zoals hier wordt getoond.Plaats de plaat in een centrifuge en centrifugeer deze kort om de reagentia naar de bodem van de put te brengen en eventuele bellen te verwijderen die de fluorescentiemetingen kunnen verstoren. In het thermocycler-programma moet de hot-start polymerase in de Solaris QPCR master mix worden geactiveerd bij 95 °C gedurende 15 minuten (één cyclus), gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 15 seconden en een annealing/extensie bij 60 °C gedurende 60 seconden. Dit protocol is hetzelfde voor alle Soliris QPCR-assays, ongeacht het gen dat wordt geamplificeerd.Plaats tot slot de plaat in het QPCR-instrument en start het programma. Deze figuur demonstreert hier de hoge prestaties van de Solaris-assays; 10voudige verdunningen van synthetisch DNA of cDNA werden geamplificeerd met behulp van de Solaris QPCR-genexpressie-assays voor CDC 20 en F two RL one. De amplificatiecurven op logaritmische schaal en standaardcurven voor de 10 log 10 verdunningen tonen de hoge prestaties van de assay, zelfs bij lage inputconcentraties.De prestaties van elke assay worden gemeten aan de hand van de efficiëntie, de kwadraatwaarde van het dynamische bereik op een schaal van 10, log 10-verdunningen en de onderste detectiegrens. De hier getoonde gegevens demonstreren de reproduceerbaarheid van Solaris-assays. Hierbij werden aliquots van CD NA geamplificeerd in twee geografisch gescheiden laboratoria met behulp van Solaris QPCR-genexpressie-assays en mastermix.Dezelfde expressieniveaus werden in beide laboratoria berekend voor twee gen-doelen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een standaard QPCR-reactie opzet met behulp van Solaris QPCR-reagentia voor genexpressie. Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om eraan te denken mastermixen samen te stellen met de juiste uiteindelijke concentratie van reagentia en passende biologische en/of technische replica's op te nemen.Daarnaast is het essentieel om het QPCR-instrument in te stellen met de juiste thermocycling-condities voor Solaris. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We zullen aantonen de opzet en analyse van pre-microRNA 96-wells-arrays voor QPCR het gebruik van een robot als door de hand met een Thermo Scientific Matrix multichannel pipet.

Profilering van de Pre-micro-RNA&#39;s en microRNA&#39;s met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qPCR) arrays

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Er is een protocol gegeven voor het ontwikkelen van een real-time recombinase polymerase-amplificatietest om de initiële concentratie van DNA-monsters te kwantificeren met behulp van een thermische cycler of een microscoop en een stage-heater. Ook beschreven is de ontwikkeling van een interne positieve controle. Scripts zijn gegeven voor het verwerken van ruwe real-time fluorescentiegegevens.

Ontwikkeling van een kwantitatieve Recombinase Polymerase Amplificatie test met een interne positieve controle

Dit protocol beschrijft een qRT-PCR-assay met hoge doorvoer voor de analyse van type I en III IFN-expressiesignaturen. De assay onderscheidt verschillen van enkele basenparen tussen de zeer vergelijkbare transcripten van deze genen. Door batchassemblage en robotisch pipetteren zijn de assays consistent en reproduceerbaar.

High-throughput Kwantitatieve real-time RT-PCR assay voor het bepalen van expressieprofielen van de typen I en III interferon subtypen

Ontworpen chromosomen van het Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, kunnen worden onderscheiden van hun natuurlijke tegenhangers met behulp van een PCR-gebaseerde genotyperingstest genaamd PCRTagging, die een aanwezigheid/afwezigheid-endpoint heeft. Hier beschrijven we een high-throughput real-time PCR detectiemethode voor PCRTag genotypering.

qPCRTag Analyse - Een High Throughput, Real Time PCR test voor Sc2.0 genotypering

Dit is een tijd - en goedkoop cost-effective in vitro protocol van het onderzoek naar de mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, dat is een zeer onvervulde medische noodzaak in kanker beheer.

Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down

Snelle en nauwkeurige detectie van plant ziekteverwekkers on-site, met name bodem overgedragen ziekteverwekkers, is van cruciaal belang om te voorkomen dat verdere entmateriaal productie en verspreiding van plantenziekten in het veld. De methode ontwikkeld die hier met behulp van een draagbaar real-time PCR detectiesysteem kunt on-site diagnose onder veldomstandigheden.

On-Site moleculaire detectie van bodem-gedragen planteziekteverwekkers met behulp van een draagbare Real-Time PCR-systeem

Hier, wordt een kwantitatief real-time op de kettingreactie-gebaseerd protocol van de polymerase voorgesteld voor de bepaling van de inheemse micro-RNA inhoud (absoluut/verwant) van lipoprotein deeltjes. Bovendien is een methode voor het verhogen van het micro-RNA-niveau, evenals een methode voor het bepalen van de cellulaire opnamesnelheid van lipoprotein deeltjes, aangetoond.

Verrijking van native lipoprotein deeltjes met microRNA en daaropvolgende bepaling van hun absolute/relatieve microRNA inhoud en hun cellulaire overdrachtssnelheid

Microvolume monsters worden gekwantificeerd door een spectrofotometer systeem dat natuurlijke oppervlaktespanning gebruikt om monsters te behouden zonder het gebruik van cuvetten of haarvaten. Het dynamisch bereik van eiwitconcentraties en de snelheid waarmee ze kunnen worden gemeten zijn sterk verhoogd met deze methode.

Microvolume Eiwitconcentratie Bepaling met behulp van de NanoDrop 2000C Spectrophotometer

Leer kwantitatieve real-time PCR met Solaris qPCR Assays voor genexpressieanalyse. Deze methode detecteert alle bekende splicevarianten met hoge specificiteit en reproduceerbaarheid.

Kwantitatieve real-time PCR met behulp van de Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Meer video's verkennen