Name: Een protocol voor de productie van KLRG1 tetrameer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-12T16:01:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Leer de productie van KLRG1-tetrameren voor immunologisch onderzoek met behulp van bacteriële expressie en zuivering. Dit protocol maakt gedetailleerde analyse van KLRG1-ligand-interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken dr. Naidenko voor hulp bij het optimaliseren van de hervouwing voorwaarden. Dit werk werd ondersteund door NIH onderzoek te verlenen AI58181 aan Laurent Brossay. Cindy Banh wordt ondersteund door NIH NRSA F31 AI080230. Stephanie Terrizzi en Cindy Banh een gelijkwaardige bijdrage aan dit werk.

Voorbereiding van de insluitingslichamen <ol><li> Inoculeren 4 x 500 ml flesjes van TB elk met 50 ug / ml carbenicilline en chlooramfenicol met een overnachting cultuur van bacteriën de uiting van de KLRG1 plasmide bouwen. Wanneer de OD 0.6 Å bereikt bij 600 nm, braken met de toevoeging van 0,4 M IPTG en de cultuur voor een extra 4 uur schudden geïncubeerd bij 37 ° C. </li><li> Resuspendeer de geoogste cellen in resuspensie buffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Let op: pellets kunnen worden ingevroren in dit stadium. </li><li> Zwembad niet meer dan 60 ml van bacteriële resuspensions in een polypropyleen beker. Indien nodig aan te passen tot 60 ml met TE-buffer pH 8,0 en roer mengsel op halve snelheid. </li><li> Om roerend mengsel toe te voegen druppelsgewijs: lysozym (laatste = 1 mg / ml), MgCl2 (laatste = 5 mm), 2 mg DNAse I in 50% glycerol bevatte 75 mM NaCl, Triton-X100 (finale = 1%), DTT ( laatste = 10 mm). </li><li> Ultrasone trillingen de oplossing op ijs gedurende 1,5 minuten en centrifugeer de lysaten bij 5.000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Schenk de bovenstaande vloeistof. </li><li> Voeg 15 ml wasbuffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> Op het ijs, ultrasone trillingen oplossing voor 1,5 min, totdat het pellet volledig geresuspendeerd. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 5.000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Herhaal de wasbeurt 5 keer. </li></ol></li><li> Herhaal 5b met wasbuffer zonder Triton X-100, centrifuge en resuspendeer in 4 ml TE-buffer. </li><li> Neem het natte gewicht insluitingslichamen drijfmest en op te slaan in de TE-buffer bij een concentratie van 30 tot 100 mg / ml. </li></ol> Hervouwing van KLRG1 <ol><li> Maak een L van hervouwingsbuffer pH = 8,0 (0,4 M Arginine-HCl, 0,1 M Tris pH 8-8,3, 2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 3 EDTA-vrije protease-remmer tabletten, 5 mM GSH en 0,5 mM GSSG) en chill tot 4 ° C onder roeren. </li><li> Bereid de insluitingslichamen voor injectie in de vouwen mengsel: Het is ideaal om 5 10 injecties te maken met elk 0,25 0,5 uM concentratie, zodat de uiteindelijke concentratie van het eiwit wordt 2 3 uM. <ol class="lalpha"><li> Smelt het volume van de 50 mg insluitingslichamen slurry in 7 M GnHCl met 10 mM β-mercapto-ethanol. </li><li> Houd de insluitingslichamen / GnHCl mengsel bij 37 ° C gedurende 30 - 40 min en vortex om de 5 minuten in beslag smelten zorgen (gier zal duidelijk worden wanneer ze volledig gesmolten is). </li><li> Centrifugeer bij max. snelheid gedurende 30 minuten in microcentrifuge bij 4 ° C en breng het supernatant om een ​​15 ml centrifugebuis. Niet een van de kleine zwartachtige pellet transfer. </li></ol></li><li> Het volume aanpassen met injectie buffer (3 M GnHCl, 10 mM NaAcetate, pH 4.2,10 mM EDTA). </li><li> Injecteer 1 ml verdund insluitingslichamen elk uur. Bij het injecteren, roeren op hoge snelheid, voeg 1 ml verdund insluitingslichamen druppelsgewijs met 2 seconden tussen elke druppel. Als injectie wordt gedaan, roer op lage snelheid. </li><li> 'S nachts blijven roeren op lage snelheid bij 4 ° C. </li></ol> Concentratie van hervouwing Reacties <ol><li> Volgende protocol Millipore s, concentreren de 1 L van pre-gefilterd (0,22 um gefilterd) hervouwingsreactie met behulp van een Amicon geroerde cel en YM10 NMWL 10K ultrafiltratie membraan (Millipore) tot ~ 10 ml. </li><li> Concentreer tot ≤ 2 ml met behulp van een Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li></ol> Zuivering van KLRG1 tetrameer <ol><li> Het instellen van de AKTAFPLC bij 4 ° C volgens GE Healthcare handleidingen. </li><li> Zuiveren het monomeer vorm van KLRG1 door grootte uitsluiting chromatografie met behulp van een Sephacryl S-200 16 / 60 met een hoge resolutie kolom (GE Healthcare) in 20 mM HEPES en 150 mM NaCl. (Zie figuur 1). </li><li> Concentraat tot 1 ml met behulp van Centriplus YM-10 10K MWCO (Millipore). </li><li> Gebruik BirA enzym volgens aviditeit s protocol bij de KLRG1 monomeer biotinylate. </li><li> De vrije biotine wordt uitgescheiden via de size exclusion chromatografie als in 2. </li><li> KLRG1 molecuul is tetramerized door het mengen van KLRG1 monomeer met 4-voudige molaire overmaat PE-geconjugeerd streptavidine (BD Biosciences). </li></ol> Representatieve resultaten <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1702/1702fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1702/1702fig1tmb.jpg" alt="Figuur 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"></a> Figuur 1. Representatieve positieve resultaten van de AKTA FPLC size exclusion chromatografie van de hervouwen KLRG1. De grafiek toont de scheiding van het monomeer (83,52 ml), dimeer (56,36 ml), en multimeer (36,26 ml) vorm van de hervouwen KLRG1. De piek bij 94,25 ml staat voor de buffer uit te wisselen.

<ol><li>Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLRG1+binds+cadherins+and+preferentially+associates+with+SHIP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1.</a> Int Immunol. 19, 391-400 (2007).</li>
<li>Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+identification+of+E-cadherin+as+a+ligand+for+the+murine+killer+cell+lectin-like+receptor+G1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1.</a> J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).</li>
<li>Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+lectin-like+receptor+G1+binds+three+members+of+the+classical+cadherin+family+to+inhibit+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity.</a> J Exp Med. 203, 289-295 (2006).</li>
<li>Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+natural+killer+cell+receptor+KLRG1+bound+to+E-cadherin+reveals+basis+for+MHC-independent+missing+self+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition.</a> Immunity. 31, 35-46 (2009).</li>
<li>Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K.+Molecular+basis+for+E-cadherin+recognition+by+killer+cell+lectin-like+receptor+G1+%28KLRG1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1).</a> J Biol Chem. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

In dit protocol wordt aangetoond hoe te zuiveren, biotinylate, en tetramerize KLRG1. KLRG1 tetrameer kan worden gebruikt om KLRG1 liganden label door flowcytometrie. Hoewel hervouwing voorwaarden moeten empirisch worden getest op elk eiwit, kunnen andere C-type lectines worden tetramerized met behulp van een soortgelijk protocol. Met behulp van tetramerized eiwitten als probes, liganden van verweesde C-type lectine receptoren zou kunnen worden geïdentificeerd.

<table><tbody><tr><td>BirA-enzym en buffer</td><td>Biotinyleringskit</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA-vrij</td><td>Reagens</td><td>Roche Group</td><td>11 836 170 001</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>Amicon Stirred Cell</td><td>Apparatuur</td><td>EMD Millipore</td><td>Model #8400</td><td>of equivalent</td></tr><tr><td>YM10 NMWL 10K ultrafiltratiemembraan</td><td>Filtratiemateriaal</td><td>EMD Millipore</td><td>13642</td><td></td></tr><tr><td>15 ml YM10 concentrator</td><td>Filtratiemateriaal</td><td>EMD Millipore</td><td>4411</td><td></td></tr><tr><td>AKTAFPLC</td><td>Apparatuur</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-200 16/60 resolutiekolom</td><td>Apparatuur</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Strepavidine PE</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>of equivalent</td></tr></tbody></table>

een protocol voor de productie van klrg1 tetrameer

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectine-like receptor G1 (KLRG1) is een type II transmembraan glycoproteïne remmende receptor die behoren tot de C-type lectine-achtige superfamilie. KLRG1 bestaat zowel als een monomeer en als een disulfide-linked homodimeer. Deze goed bewaard gebleven receptor is te vinden op het meest volwassen en recent geactiveerde NK-cellen als op een subset van effector / geheugen T-cellen. Met behulp van KLRG1 tetrameer evenals andere methoden, E-, N-en R-cadherines werden geïdentificeerd als KLRG1 liganden. Deze Ca 2 +-afhankelijke cel-cel adhesie moleculen bestaat uit een extracellulair domein met vijf cadherine herhalingen verantwoordelijk zijn voor cel-cel interacties, een transmembraan domein en een cytoplasmatisch domein dat gekoppeld is aan het actine cytoskelet. Generatie van de KLRG1 tetrameer was essentieel voor de identificatie van de KLRG1 liganden. KLRG1 tetrameer is ook een uniek hulpmiddel om de rollen cadherine en KLRG1 spelen toe te lichten bij het reguleren van de immuunrespons en weefsel integriteit.

Dit protocol beschrijft de productie van KLRG1 tetrameer, dat is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van KLRG1 liganden.

Een protocol voor de productie van KLRG1 tetrameer

Killer cell lectine-achtige receptor G1 (KLRG1) is een type II transmembraan glycoproteïne inhiberende receptor die behoort tot de C-type lectine-achtige superfamilie. ...

Hallo, ik ben Stephanie Resi van het laboratorium van Lauren Parce van de afdeling Moleculaire Microbiologie en Immunologie aan de Brown University. Vandaag tonen we u een procedure voor het genereren van K LRG one tetrameren. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om K LRG one coherente interacties te bestuderen.Laten we beginnen. Inoculeer eerst vier kolven van 500 milliliter met TB-buffer die de juiste antibiotica bevatten met bacteriën die het K LRG one plasmideconstruct tot expressie brengen en kweek deze bij 37 °C onder schudcondities. Wanneer de OD 0,6 bereikt bij 600 nm, induceer dan de expressie via de T7-promotor door toevoeging van 0,4 M IPTG en incubeer de cultuur nog vier uur terwijl deze wordt geschud bij 37 °C. Na de incubatie van vier uur worden de bacteriën overgebracht naar centrifugebuisjes en worden de culturen 20 minuten gecentrifugeerd bij 3000 RPM en 4 °C.Indien nodig kunnen de pellets op dit punt worden ingevroren bij -80 °C voor gebruik op een later tijdstip. Resuspendeer de geoogste cellen in 30 milliliter resuspensiebuffer. Voeg vervolgens de bacteriële resuspensies samen tot een volume van 60 milliliter in een polypropyleen bekerglas.Indien nodi

a-protocol-for-the-production-of-klrg1-tetramer

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

Biofysische en biochemische studies van interacties tussen membraan-ingebed eiwitdomeinen geconfronteerd met vele technische uitdagingen, waarvan de eerste is het verkrijgen van passende studiemateriaal. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren en zuiveren van disulfide-gestabiliseerde transmembraan peptide complexen die geschikt zijn voor structurele analyse door oplossing kernspinresonantie (NMR) en andere analytische toepassingen.

Productie van Disulfide gestabiliseerde Transmembrane peptidecomplexen voor structurele studies

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Kindlins fundamenteel celadhesie door integrines maar studies ervan werden gehinderd door de moeilijkheid erin recombinante expressie in bacteriële gastheren. We beschrijven hier werkwijzen voor de efficiënte productie in baculovirus-geïnfecteerde insectencellen.

Efficiënte productie en zuivering van recombinant muizen Kindlin-3 uit Insect Cellen voor Biofysische Studies

CRISPR-geassocieerd eiwit Cpf1 kan geleid worden door een speciaal ontworpen CRISPR RNA (crRNA) om dubbelstrengs DNA op gewenste plaatsen te kloppen, waardoor kleverige einden worden geproduceerd. Op basis van dit kenmerk werd een DNA-assemblage standaard (C-Brick) opgericht, en hier wordt een protocol beschreven waarin het gebruik ervan wordt beschreven.

Protocollen voor C-Brick DNA Standard Assembly met behulp van Cpf1

Hier presenteren we tekenreeks vergadering gRNA klonen (STAgR), een methode om gemakkelijk multiplex gRNA vectoren voor CRISPR/Cas9 benadert. STAgR maakt gRNA multiplex eenvoudig, efficiënt en klantgericht.

Een aanpasbare Protocol voor String vergadering gRNA klonen (STAgR)

Dit protocol wordt beschreven hoe een verslaggever systeem dat kan worden gebruikt voor het identificeren en kwantificeren van receptor-ligand interacties te stellen.

Een systeem van de BW verslaggever voor het bestuderen van de Receptor-Ligand interacties

Gepresenteerd hier is een protocol voor het uitvoeren van single-molecuul Förster resonantie energie overdracht te bestuderen HJ resolutie. Voor het bepalen van de dissociatieconstanten wordt tweekleurige alternerende excitatie gebruikt. Single-Color timelapse smFRET wordt vervolgens toegepast in real-time decolleté assays om de dwelltijd verdeling vóór HJ resolutie te verkrijgen.

Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis - en L. donovani-stammen die het gen voor eGFP tot expressie brengen als een stabiel geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. Getransfecteerde parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit in beide soorten werden geselecteerd voor verder gebruik in medicijnscreeningtests.

Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

In dit artikel wordt een stapsgewijs protocol gepresenteerd dat laat zien hoe modulair klonen (MoClo) kan worden aangepast voor het klonen van polycistronische operonen.

Gestandaardiseerde modulaire assemblage van polycistronische operons met modulair klonen (MoClo) met behulp van de In-Cloning toolkit

Deze studie stelde een methode vast die genetische code-uitbreiding gebruikt om lactyllysine (Klac) succesvol te integreren op specifieke locaties van de menselijke enolase-1 (hENO1) en superfolder GFP (sfGFP) in Escherichia coli - en zoogdiercellen.

Site-specifieke lysinelactylering via genetische code-expansie in E. coli - en zoogdiercellen

Leer de productie van KLRG1-tetrameren voor immunologisch onderzoek met behulp van bacteriële expressie en zuivering. Dit protocol maakt gedetailleerde analyse van KLRG1-ligand-interacties mogelijk.

Een protocol voor de productie van KLRG1 tetrameer

Meer video's verkennen