Undecalcified Bone Voorbereiding voor Histologie, histomorfometrie en fluorchroom Analyse

Histologie van gedecalcificeerd bot toont de microarchitectuur van het bot, waarbij zowel de gemineraliseerde als de cellulaire componenten zichtbaar zijn, wat essentiële informatie verschaft over de botomzetting of botvorming en botresorptie. Dit is van groot belang in diverse klinische en onderzoeksapplicaties. Het levert prachtige beelden op en maakt technieken mogelijk zoals fluorescentie-beoordeling en histo-optometrie.

Het uitvoeren van histologie van ondergecalcificeerd bot is technisch uitdagend, vooral bij specimens van grote omvang. Deze video demonstreert de technische moeilijkheden en de methoden om deze te overwinnen bij het verkrijgen van coupes van ondergecalcificeerd bot. De histomorfometrische beoordeling van deze coupes zal niet verder worden behandeld.

Hiervoor verwijzen wij u naar de volgende belangrijke publicatie. Deze video behandelt de preparatie en fixatie van het monster, het inbedden, het maken van coupes (zowel door slijpen als snijden), de preparatie van coupes op objectglazen en de kleuring na de weefselafname. Het monster.

In dit geval wordt de cervicale wervelkolom van het schaap geplaatst in een afgesloten, ondoorzichtige container met een 10% fosfaatgebufferde formule en oplossing. Er moet een minimale blootstelling aan licht zijn als er een fluorochroomanalyse moet worden uitgevoerd. Aangezien fluorochromen lichtgevoelig zijn, wordt het specimen vervolgens naar het laboratorium gebracht en op maat getrimd, wat de fixatie verbetert en ervoor zorgt dat het in een blok past.

Hoewel de oriëntatie van het weefsel op het objectglas op dit punt bekend moet zijn, zodat het blok in het juiste vlak kan worden geprepareerd. Veiligheid is zeer belangrijk en instrumenten moeten worden gebruikt zodat de handen uit de buurt van het mes blijven. Het gebied van interesse wordt nu op maat getrimd.

Vervolgens wordt de definitieve trimning uitgevoerd met een kleinere bandzaag, wat resulteert in minder weefselverlies. Zodra een blok op maat is gezaagd, wordt het geplaatst in een afgesloten, ondoorzichtige container met verse fixeeroplossing om de fixatie te voltooien. Het volume van de container moet ongeveer 10 keer de grootte van het specimen zijn.

Om een adequate fixatie te bereiken, moet het preparaat, afhankelijk van de grootte, één tot twee weken in de formule en oplossing blijven, waarna het wordt overgebracht naar 70% Ethanol. De verdere verwerking wordt vervolgens langzaam uitgevoerd, aangezien de grote omvang van de blokken en de lage permeabiliteit van bot zorgen voor een trage diffusie van oplosmiddelen. De dehydratie wordt vervolgens uitgevoerd met oplopende concentraties ethanol, gevolgd door inklaringsstap in butanol. Het preparaat wordt afgeschermd van het licht en onder constante agitatie gehouden.

We raden aan om ongeveer één week in elke oplossing door te brengen. De verwerking duurt daarom ongeveer vier tot zes weken. Dit proces mag niet worden versneld, omdat dit de uiteindelijke kwaliteit van de coupes in gevaar brengt.

Er zijn verschillende inbeddingsopties beschikbaar voor gecalcificeerd bot. De keuze voor hars of methacrylaat hangt af van wat er getest moet worden. Immunohistochemie is bijvoorbeeld niet mogelijk met alle soorten hars.

Epoxyharsen vereisen UV-licht voor uitharding, wat de fluorochroomanalyse zou verstoren. Wij raden aan om de specificaties van de fabrikant te raadplegen voordat u een zorgvuldige keuze maakt. Wij gebruiken TEVI 7, 100, aangezien ditten mooie gesneden en geslepen coupes mogelijk maakt voor lichtmicroscopie en fluorochroomanalyse en kosteneffectief is.

Een belangrijk aandachtspunt bij het inkapselen is dat de dichtheid van het bot en de dichtheid van het inkapselmedium nauw op elkaar moeten zijn afgestemd. Dit is essentieel voor het latere snijden van de blokken, in het bijzonder bij microtomie; het mengsel wordt bereid volgens de instructies van de fabrikant en krachtig geschud. Het kan nuttig zijn om een paar testmonsters in te kapselen om het protocol te optimaliseren.

In tegenstelling tot bij paraffine is dit een onomkeerbare stap. De blokken worden met het snijvlak naar beneden in de mal geplaatst. De mal is groter dan het blok om ondersteuning en stevigheid te bieden.

De infiltratie met methacrylaat moet langzaam worden uitgevoerd om een maximale infiltratie van het methacrylaat in het bot mogelijk te maken. Ook hier moet blootstelling aan licht tot een minimum worden beperkt. Na één week in de infiltratieoplossing wordt deze oplossing vervangen en wordt de hardingsoplossing toegevoegd.

Vervolgens wordt een steunplaat vervaardigd. Hiervoor maken wij gebruik van tevit 30 40. De mal wordt vervolgens verwijderd en het blok is nu klaar.

Slijpsneden leveren dikkere secties op met een dikte tussen 20 en 50 micron. Dit is nuttig voor fluorescentieanalyse, aangezien dikkere secties een helderdere fluorescentie geven. Voor het maken van de slijpsnede is een microtoom nodig, bij voorkeur met een diamantmes. Wij maken gebruik van een gebogen diamantmes van 0,6 millimeter.

Een smeermiddel is essentieel. Wij geven de voorkeur aan een smeermiddel op basis van aardolie, hoewel smeermiddelen op basis van siliconen ook goed werken. Het blok wordt vervolgens in de klem geplaatst.

Het wordt vastgezet in de macro-houder en het blok wordt naar het mes toe bewogen. De eerste doorsnee legt het snijvlak bloot en oriënteert de sectie. Deze dient te worden weggegooid.

Slijpen is een traag proces en mag niet worden overhaast. Er moet voor voldoende smering worden gezorgd wanneer de sectie wordt geslepen. Vervolgens wordt deze op een objectglas geplaatst.

Het kan naar behoefte worden gereinigd en gepolijst. De sectie heeft de neiging om krom te trekken, dus we raden aan om er een deel van een sandwichzakje overheen te plaatsen en het plat te houden met een ander objectglas dat er stevig op is geklemd.

Het geheel wordt vervolgens gedurende één uur in een incubator bij een temperatuur tussen 60 en 80 °C geplaatst. Dit verzacht het methacrylaat en helpt de sectie om vlak aan de objectglas te hechten. Hier zien we een samengestelde fluorescentie-afbeelding van drie verschillende fluorochromen die met maandelijkse tussenpozen zijn geïnjecteerd.

Dit maakt identificatie van de mineralisatieplaats op een specifiek tijdstip mogelijk. De doses en de bereiding van deze labels kunnen in de tekst worden gevonden. De micro-term levert dunne coupes, wat optimaal is voor lichtmicroscopie.

Het is een technisch uitdagend proces. Wij raden het gebruik van een sledge-microtoom aan vanwege de extra stevigheid die dit biedt bij het snijden van deze harde blokken. Er kan gebruik worden gemaakt van diverse messen, waaronder wolfraamcarbide messen.

Wij raden echter een roestvrijstalen mes aan, aangezien dit indien nodig gemakkelijk en regelmatig kan worden geslepen. Het mes moet zodanig worden georiënteerd dat het een hoek van 45 graden vormt met een blok. De dichtheid van het methacrylaat is gevoelig voor vele factoren, waaronder de relatieve vochtigheid in de ruimte.

Het blok dient daarom op een droge plek te worden bewaard. Indien nodig kan verzachting worden bereikt door een nat papiertje op het blok aan te brengen; het kan meerdere coupes kosten om de juiste snijcondities te verkrijgen voor een kwalitatieve coupe. Vervolgens worden het sandwichzakje en de extra objectglas vastgeklemd om de coupe vlak te maken voordat deze in de incubator wordt geplaatst.

De kleuring is vergelijkbaar met de standaard histologie van in paraffine ingebed weefsel, behalve dat het inbedden in was uiteraard niet nodig is. De veelgebruikte kleuringen voor bot omvatten VSA met saffraan-tegenkleuring, saffraan, ol lichtgroen en massa on gouden as trione. Het protocol hiervoor wordt in de tekst behandeld.

De reagentia worden geselecteerd en gefilterd vóór gebruik. Golden. De kleuring wordt veelvuldig gebruikt voor histo-optometrie. Wij raden aan om de kleuringen eerst te optimaliseren op testpreparaten.

Na elke stap kan het preparaat onder een microscoop worden bekeken om de juiste kleurintensiteit te controleren. Hierdoor kunnen de juiste tijden voor elke component van de kleuring worden bepaald. Zodra de kleurstandaard is geoptimaliseerd, worden alle preparaten uit het experiment gelijktijdig in een rek gekleurd volgens hetzelfde protocol, om te voorkomen dat variabiliteit in de kleuring de thermische geometrie beïnvloedt.

De objectglazen worden vervolgens op de standaardmanier gedekt. We wensen u veel succes met uw experiment.