Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences
16 juli 2010
We tonen onze aanpak voor het vinden van potentiële enhancer elementen uit de op ontwikkelingsgebied gereguleerde genen en evalueren van hun functie door middel van mozaïek zebravis transgenese.
Hallo, ik ben Erica Kgi van het laboratorium van Shannon Fisher in het Department of Cell and Development Biology aan de University of Pennsylvania. Ik ben Chris Weber, ook van het Fisher Lab. En ik ben Shannon Fisher.
Vandaag laten we u een procedure zien voor het analyseren van de functie van enhancer-elementen met behulp van zebravis-transgenese. We gebruiken deze procedure om transcriptionele regulaties van genen te bestuderen die belangrijk zijn voor skeletontwikkeling. Dus laten we beginnen.
Om niet-coderende sequenties rond kandidaatgenen te identificeren, gebruiken we het fast cons-algoritme, dat toegankelijk is als een track op de UC SC-genoombreviewer. We zijn vooral geïnteresseerd in genen die tot expressie worden gebracht tijdens skeletontwikkeling, maar dezelfde aanpak kan worden gebruikt om alle genen die tot expressie worden gebracht in vroege ontwikkeling te bestuderen. In het voorbeeld dat hier wordt getoond, hebben we geconserveerde sequenties geïdentificeerd.
In het interval rond het menselijke bumper-gen, onderzoeken we het hele interval tot de aangrenzende genen en bepalen we een lage specifieke logscore-cutoff die overeenkomt met ongeveer de top 5% van de niet-coderende sequentie. Na het selecteren van sequenties, ontwerpen we primers met behulp van primer drie om elke sequentie van menselijk genoom-DNA te versterken, primers moeten worden geselecteerd om het geconserveerde gebied plus 30 of meer basenparen aan beide kanten te versterken. Versterk het gebied van belang met behulp van hoogwaardig polymerase met behulp van menselijk genoom-DNA, gebruik standaard moleculaire biologieprocedures in het laboratorium om het versterkte product in een expressievector te klonen.
De vector die in dit protocol wordt gebruikt, is PG wc FOS GFPA gateway. Bestemmingsvector. Na het maken van de vector tot transpositie verteld.
Enzyme dat nodig is voor transpositie wordt eerst in vitro getranscribeerd met behulp van de M message M machine kit van Ambion en de PGB 600 plasmide vóór experimentele injecties. Test elke batch transposes op werkzaamheid door te injecteren met een bekende enhancer zoals de muis sokken. 10 versterker.
Om je voor te bereiden op injecties, trek de naalden die worden gebruikt voor micro-injectie uit 1,2 millimeter od filament glas op een Sutter P 97 micropipet puller. Gebruik een programma dat een sterke tip oplevert met een scherpe taps toelopende punt om intacte corion's te doorboren met een schone scheermes en micrometer-schuif. Breek de punten met de hand onder een stereomicroscoop af tot een buitendiameter van ongeveer 15 micrometer.
De naalden kunnen een dag worden bewaard in een afgedekte houderbak. Houd de zebravispopulatie op een regelmatige licht-donkercyclus met 14 uur licht onder standaard omstandigheden de dag voor het uitvoeren van micro-injecties. Bereid vissen voor op getimede paringen in kleine foktanks.
Plaats drie vrouwtjes of twee mannetjes per tank in parallelle rijen op de ochtend van de micro-injecties kort na het begin van de lichtcyclus. Combineer mannetjes en vrouwtjes in schoon systeem behandeld water voor eierproductie. Controleer de vissen regelmatig en verzamel de eieren binnen enkele minuten na productie om goed gesynchroniseerde batches te krijgen.
Onderhoud de eierproductie gedurende twee tot drie uur door door te gaan met het combineren van verse groepen vissen gedurende de ochtend met een breed glas past pipette van vijf en een kwart inch met een latex huls. Sorteer de verzamelde embryo's in 60 bij 15 millimeter petrischalen, gedeeltelijk gevuld met embryomedium in groepen van 50 embryo's. Markeer de tijd van verzameling op de deksel van elke schaal.
Voor elke leg van embryo's die wordt verzameld, bewaar een schaal van 50 embryo's voor de niet-geïnjecteerde controle tussen eierverzamelingen. Bereid verse injectieoplossingen voor door de volgende ingrediënten in een micro fuge buis te mengen en bewaar op ijs. Leg de injectienaalden in houderschalen en vul ze met 1,5 tot twee microliters injectieoplossing.
Door 500 nanoliter druppels op het brede uiteinde van elke naald te pipetten. De vloeistof wordt door capillaire actie naar de punt getrokken. Bereid ten minste twee naalden voor elke injectieoplossing voor.
Laad de gevulde naald in de handbediende naaldhouder van een pneumatisch pico-pomp of vergelijkbare drukinjector. Geconfigureerd en aangesloten op een stikstoftank volgens de instructies van de fabrikant. Calibreer injectievolumes door de diameter van druppels te meten die in mineraal olie op een micrometerschuif worden uitgestoten, meestal een injectietijd van 120 milliseconden.
Met een druk van 20 PS zal ik een druppel van ongeveer één nanoliter opleveren met behulp van een stereomicroscoop bij zes tot 10 x vergroting. Houd het embryo op zijn plaats met een paar fijne pincetten en duw de injectienaald met gelijkmatige druk door de corion in de dooier van een embryo in de eencellige of vroege tweecellige fase, plaats de naaldtip in de dooier net onder de blastomeren, spuug ongeveer één liter injectieoplossing en trek de naald terug voor elke construct waarvan we meer dan of gelijk aan 200 embryo's na voltooiing van de injectie injecteren. Sorteer de embryo's door onbevruchte eieren, beschadigde embryo's en mislukte injecties of embryo's zonder fenolrood in de blastomeren te verwijderen.
We incuberen vervolgens de embryo's en embryomedium bij 28,5 graden Celsius tot het juiste tijdstip voor observaties. Nu laten we u enkele representatieve resultaten zien van enhancer-elementen die weefselspecifieke patronen van GFP-expressie produceren in het zebravis-embryo. We bestuderen genen die tot expressie worden gebracht in bot of kraakbeen tijdens.
Hier is een voorbeeld van een enhancer-element stroomopwaarts van het acan-gen dat expressie reguleert in craniale gezichtscartilage drie dagen na bevruchting. Hier is nog een enhancer, deze keer van het bumper-gen dat expressie reguleert in botcellen. Na vijf dagen van de vele enhancers die we hebben geïdentificeerd, vinden we weinig correlatie tussen locatie ten opzichte van het gen en regulatie van expressie.
Bij het kiezen van sequenties om te testen, is het belangrijk om te onthouden dat een enhancer honderden kilobase
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert een procedure voor het analyseren van enhancer-elementen met behulp van transgenese bij zebravis. De focus ligt op het bestuderen van transcriptionele regulaties van genen die cruciaal zijn voor de skeletontwikkeling.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
- Zebravismodellen
Achtergrond
- Enhancer-elementen spelen een cruciale rol bij de genregulatie.
- Zebravissen zijn een waardevol model voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen.
- Inzicht in transcriptionele regulatie is essentieel voor het begrijpen van de skeletontwikkeling.
- Deze studie heeft tot doel enhancer-functies te identificeren en te evalueren.
Doel van de studie
- Om potentiële enhancer-elementen van ontwikkelingsgestuurde genen te identificeren.
- Om de functie van deze enhancers te evalueren via transgenese.
- Om het begrip van genregulatie bij skeletontwikkeling te vergroten.
Gebruikte methoden
- Mozaïek-transgenese techniek bij zebravis.
- Analyse van enhancer-elementen geassocieerd met specifieke genen.
- Evaluatie van transcriptionele activiteit in zebravismodellen.
- Experimenteel ontwerp gericht op genen voor skeletontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van belangrijke enhancer-elementen die gekoppeld zijn aan de skeletontwikkeling.
- Succesvolle implementatie van transgenese om de enhancer-functie te bestuderen.
- Inzichten in mechanismen van transcriptionele regulatie.
- Potentiële implicaties voor het begrip van de ontwikkelingsbiologie.
Conclusies
- Deze studie biedt een kader voor het analyseren van enhancer-elementen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van genregulatie tijdens de ontwikkeling.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methoden om andere ontwikkelingsprocessen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het evalueren van enhancer-sequenties in zebravis biedt een snel en kosteneffectief systeem voor de functionele validatie van niet-coderende regulatoire elementen uit menselijk DNA. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door sequentieconservatie te koppelen aan ruimtelijke en temporele genexpressie in een gewervde modelorganisme. Dit maakt mechanistische risicoreductie van enhancer-hypothesen mogelijk voordat er wordt geïnvesteerd in kostbare zoogdiermodellen of screeningscampagnes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Functionele beoordeling van enhancer-activiteit in een native chromatinecontext.
- Operationele waarde: High-throughput testen van menselijke niet-coderende sequenties via micro-injectie.
- Voorspellende waarde: Correlatie van sequentieconservatie met weefselspecifieke GFP-expressiepatronen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Een gestandaardiseerd micro-injectieprotocol maakt reproduceerbare screening van enhancers mogelijk.
- Kwantitatieve output: Ruimtelijke en temporele GFP-expressie dient als functionele readout.
- Schaalbaarheid: Capaciteit om >200 embryo's per construct te testen voor statistische betrouwbaarheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Enhancers van genen voor skeletontwikkeling (bijv. acan, bumper) dienen als model voor regulatiemechanismen bij weefselvorming.
- Translationele continuïteit: Expressiepatronen in zebravis informeren voorspellingen over de functie van enhancers bij zoogdieren.
- Risicobeperking: Vroege identificatie van niet-functionele sequenties vermindert het aantal fout-positieven in downstream-assays.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om de enhancerfunctie te beoordelen voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen, waarbij zebravis wordt gebruikt als een ziekterelavant systeem voor mechanistisch inzicht.
- Ontdekkingsbiologie: Test transcriptionele regulatie van ontwikkelingsbiologisch belangrijke genen via enhancer-klonering en transgenese.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling voor enhancer-activiteit mogelijk met GFP als kwantitatieve reporter.
- Analytiek: Ruimtelijke expressiepatronen ondersteunen comparatieve analyse van enhancer-sterkte en specificiteit.
- Translationeel onderzoek: Koppelt de functie van niet-coderende sequenties aan fenotypische resultaten in de skeletontwikkeling.
- Hergebruik in de sector: Het protocol is aanpasbaar aan elke menselijke niet-coderende sequentie voor cross-project evaluatie van enhancers.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van enhancer-hypothesen via directe functionele uitlezing.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde workflow van sequentieselectie tot embryo-injectie en imaging.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen over de prioritering van regulatoire elementen.
- Impact op portfolio: Verhoogt het vertrouwen in de selectie van niet-coderende targets voor therapeutische modulatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in moleculaire biologie met betrekking tot klonering en de preparatie van transposase.
- Toegang tot micro-injectieapparatuur en een zebravisfaciliteit.
- Standaardisatie van de embryonale stadia en het tijdstip van injectie.
- Aanpassing aan verschillende enhancer-constructen via primerontwerp en vector-klonering.
- Beperkingen omvatten mozaïekexpressie, waardoor embryo-sortering en fenotypische validatie noodzakelijk zijn.
