Name: Synthese en Kalibratie van Phosphorescent nanosondes voor zuurstof Imaging in Biological Systems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Leer de synthese en kalibratie van fosforescerende nanosondes voor zuurstofmeting in biologische systemen met platina- en palladiumporfyrine-dendrimers. Deze methode verbetert biologische beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteuning van de subsidies EB007279 en HL081273 van de NIH VS is dankbaar erkend.

1. Algemene beschrijving van zuurstof meetprotocol (Deze sectie heeft geen actie, maar is cruciaal voor het begrijpen van de rest van het papier. Het kan worden gefilmd, bijvoorbeeld als een opeenvolging van een aantal Power Point dia's, vergezeld van de stem.) 1.1) De sonde wordt geleverd in het medium van belang, bijvoorbeeld, geïnjecteerd in het bloed of interstitiële vloeistof van een dier. 1.2) Het object (oppervlak van het weefsel) wordt verlicht met het licht van de juiste golflengte om de sonde te bevorderen in de aangeslagen triplet toestand. Typisch excitatie vindt plaats via de een-foton-mechanisme. Echter, in het geval van speciale twee-foton-enhanced probes, kan excitatie worden gedaan via de twee-foton mechanisme, die het mogelijk maakt met behulp van de sondes in de hoge-resolutie microscopie toepassingen. Een-foton excitatie levert over het algemeen minder ruimtelijke resolutie, maar vereist eenvoudiger instrumentatie en kan gebruikt worden in single-point metingen met LED-gebaseerde glasvezel phosphorometers. 1.3) Fosforescentie uitgezonden door de sonde is afkomstig van de langlevende triplet toestand. De sonde molecule moet speciaal worden ontworpen om hoge quantum opbrengst van de triplet toestand te geven en uit te stoten fosforescentie in plaats van fluorescentie. Terwijl in de triplet toestand, kan de sonde ervaring botsing ontmoetingen met moleculen van zuurstof, wat kan de-activeren van de triplet state - ". Quenching" een proces genaamd In de afwezigheid van zuurstof, de levensduur van de triplet toestand, en dus van de fosforescentie verval, is τ 0. In de aanwezigheid van zuurstof, is de fosforescentie levensduur (τ), verkort als gevolg van het blussen. Er is een directe relatie tussen de levensduur van de triplet staat en de hoeveelheid zuurstof in het milieu. Dit is de bekende Stern-Volmer relatie, die de levensduur (τ) van de fosforescentie verbindt met zuurstof-concentratie [O 2] (of partiële zuurstofdruk pO 2): <img src="/files/ftp_upload/1731/1731equation.jpg" alt="Vergelijking" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="vergelijking"> In biologische systemen, zuurstof is veruit de meest effectieve quencher van fosforescentie, waardoor de fosforescentie blussen methode zeer selectief aan zuurstof. 1.4) Met het oog op de levensduur t te meten, worden de uitgezonden fotonen fosforescerende weggegooid in de tijd. Bijvoorbeeld, na de excitatie puls, kan 200 fotonen worden verzameld in de eerste 15 microseconden, 150 fotonen verzameld in de komende 15 microseconden, en zo verder, totdat er geen fotonen worden verzameld. De nummers in de bakken uitgezet tegen de tijd te geven de fosforescentie verval, dat wordt geanalyseerd om de levensduur τ opbrengst. In beeldvorming, wordt deze procedure toegepast in elke pixel van het beeld, wat resulteert in fosforescentie leven kaarten. Metingen van levens ongevoelig zijn voor de heterogeniteit van de sonde verdeling over het object, dat is gebruikelijk voor biologische monsters. Dus levens rapport alleen op zuurstof. Levensduur τ worden omgezet in zuurstof concentraties met behulp van de Stern-Volmer relatie. 2. Bouw van fosforescerende sondes Fosforescerende sondes voor zuurstof metingen in biologische systemen bestaan ​​uit fosforescerende chromoforen (cores), ingekapseld in kooien gebouwd van dendrimeren - zeer regelmatige hypervertakte polymeren [3]. Dendrimeren de bescherming van de kernen van interacties met de omgeving en de controle van de snelheid van zuurstof diffusie van de kernen, waardoor het mogelijk is om de gevoeligheid en dynamisch bereik van de sondes (k q in het Stern-Volmer relatie) te optimaliseren. De uiteinden van de dendrimeren worden gewijzigd met chemisch inert hydrofiele polyethyleenglycol (PEG) groepen, waardoor de probes sterk oplosbaar in water en het voorkomen van hun interacties met biologische macromoleculen. Fosforescerende kernen van de sondes zijn Pt of Pd complexen van porfyrinen en π-uitgebreid porfyrinen. π-Uitgebreide porfyrinen zijn porfyrinen waarin pyrrool ringen zijn versmolten met externe aromatische fragmenten. π-uitbreiding maakt afstelling van de sondes spectroscopische eigenschappen te voldoen aan de eisen van een bepaalde beeldvorming toepassing (bijvoorbeeld microscopie versus tomografie). Als voorbeeld beschrijven we de synthese van Pd tetaaryltetrabenzoporphyrins (PdAr 4 TBP) [4]. PdAr 4 TBP's hebben krachtige absorptiebanden in het verre-rode deel van het spectrum en sterke fosforescentie, zeer geschikt voor biologische zuurstof metingen. De synthese van PdAr 4 TBP's bestaat uit de volgende stappen: 2.1) Voorbereiding van tetraaryltetracyclohexenoporphyrins (Ar4TCHP) door Lindsey condensatie [5] van tetrahydroisoindole met gesubstitueerde benzaldehyden. Om een ​​0,01 M oplossing van tetrahydroisoindole (1 eq) in CH &lt;sub&gt; 2 CL 2 de aromatische aldehyde (1 eq) werd toegevoegd onder argon. Het reactiemengsel werd geroerd gedurende 10 minuten in het donker bij RT BF 3 xEt 2 O (0,2 eq) werd toegevoegd en het reactiemengsel werd geroerd bij rt voor een extra 2 uur DDQ (1 eq) werd toegevoegd en het mengsel werd gedurende een nacht onder voortdurend roeren. De oplossing werd gewassen met 10% aq Na 2 SO 3, 10% aq Na 2 CO 3, 5% aq HCl en uiteindelijk met pekel. De organische fase werd gedroogd over Na 2 SO 4, vervolgens geconcentreerd in vacuüm. Het residu werd gekristalliseerd uit CH 2 Cl 2 - tert-butyl ether mengsel aan te geven Ar 4 TCHP als groene poeder. De opbrengsten zijn ongeveer 50%. 2.2) Het inbrengen van Pd naar PdAr 4 TCHPs te verkrijgen. Free-base porfyrines (1 eq) werden behandeld met PdCl2 of Pd (OAc) 2 (1,2 eq) in refluxerende CH3CN in de aanwezigheid van een overmaat van Et3N (20 eq). De conversie werd gevolgd door de UV-vis spectroscopie (oplosmiddel CH 2 Cl 2-AcOH) en beschouwd als volledig na de Soret band van het dictaat bij 468-472 nm verdwenen. Het mengsel werd afgekoeld zijn, verdund met CH 2 Cl 2 en gefilterd door een dunne laag van Celite naar Pd (0) te verwijderen. Het oplosmiddel werd verdampt en het residu werd gezuiverd door chromatografie op silicagel kolom met behulp van CH 2 Cl 2 als oplosmiddel. Donker rood fractie werd verzameld, werd het oplosmiddel verdampt te geven doelgroep PdAr 4 TCHPs in vrijwel kwantitatieve opbrengst. 2.3) PdAr 4 TBP werden bereid door oxidatie van PdAr 4 TCHPs met de 2-voudige overmaat van DDQ (16 eq) in gerefluxed THF. Tijdens refluxen, de kleur veranderd van donker-rood tot diep-groen. Het oplosmiddel werd verdampt, het residu werd verdund met CH 2 Cl 2, gewassen met 10% aq Na 2 SO 3, water en pekel. De organische fase werd gedroogd over Na 2 SO 4 en geconcentreerd in vacuüm. Het residu werd gezuiverd door chromatografie op silicagel (eluens CH 2 Cl 2). De eerste donkergroene fractie werd verzameld, geconcentreerd in vacuüm tot 85-90% van de als blauw-groene poeder PdAr4TBP's geven. 2.4) Perifere ester groepen van Pd tetrakis-(3,5-dibutoxycarbonylphenyl)-tetrabenzoporphyrin (PdAr4TBP) werden gehydrolyseerd met behulp van 10-voudige overmaat van KOH in 1% (v / v) water / THF bij kamertemperatuur. Het oplosmiddel werd gedecanteerd van de neerslag van de gevormde kaliumzouten van carbonzuur derivaten van PdAr4TBP's. De vaste stoffen werden opgelost in water, geroerd voor extra 2 uur, aangezuurd met conc. HCl tot pH ~ 4-5. De verkregen precipitaat werd geïsoleerd door centrifugeren, gewassen met water en gedroogd in vacuüm. Het beschermen van dendronen. Elke afzonderlijke tak van de dendrimeer heet dendron. Het beschermen van dendronen zijn opgebouwd uit aryl-glycine (AG) bouwstenen. AG dendronen kan gemakkelijk worden gesynthetiseerd uit goedkope grondstoffen en geïsoleerd in hoge zuiverheid en de opbrengst door chromatografie-vrije methoden. Synthese van generatie 2 (G2) AG-dendron bestaat uit de volgende stappen: 2.4) Synthese van de bouwstenen, Boc-beschermd 3,5-dicarboxyphenyl glycineamide en 3,5-dibutoxycarbonylphenyl glycineamide, met behulp van de Fischer haloacyl halogenide-methode. 2.5) Koppeling van de bouwstenen met CDMT / NMM peptide-koppeling chemie. 2.6) protectie het middelpunt aminogroep door roeren de oplossing van de G2 dendron in TFA gedurende 2 uur bij RT 2.7) Voor de montage van de hogere generatie dendronen, zijn koppeling / ontscherming stappen herhaald. Dendrimeer assemblage wordt bereikt door koppeling van de ontschermd dendronen om PdAr4TBP (of andere porfyrine) met de HBTU / DIPEA koppeling chemie. 2.8) Eerst worden de Boc-beschermende groepen verwijderd van de dendron. Bijvoorbeeld, was Boc-beschermd G3 dendron (0,58 g) opgelost in TFA (15 ml), en het mengsel werd overgelaten aan bij RT reageren 2u. Het zuur werd verwijderd door roterende verdamping, waardoor de dendron als de TFA-zout. Het residu werd opgelost in droge NMP (10 ml) en een paar druppels van DIPEA werden toegevoegd, om de sporen van TFA lessen. 2.9) Voordat de koppeling reactie, is het essentieel om volledig op te lossen de porfyrine. Zo werd Pt tetracarboxyphenylporphyrin (0.061 g) opgelost in droge NMP (65 ml) onder verhitting bij 140 ° C gedurende 10 min, onder stikstof stroom. 2,10) De oplossing werd afgekoeld tot kamertemperatuur, werd HBTU (0,211 g) toegevoegd en het mengsel werd geroerd gedurende 5 minuten. 2,11) DIPEA (0,35 ml) werd toegevoegd aan het mengsel in een portie, onmiddellijk gevolgd door de toevoeging van de solutieen van TFA-zout van de dendron in NMP (zie 2.8), en het mengsel werd gelaten 's nachts onder roeren. 2,12) Het mengsel werd uitgegoten in 3% aq. NaCl (350 ml), en het resulterende precipitaat werd verzameld door centrifugatie en gewassen met water, MeOH, en Et 2 O door repetitieve vering / centrifugeren om het doel porfyrine-dendrimeer opbrengst. 2,13) ​​naar de perifere estergroepen hydrolyseren, was het dendrimeer eerst behandeld met NMe 4 OH (~ 5 mm) in DMSO / MeOH gedurende 20-60 min, gevolgd door de volledige verwijdering van het oplosmiddel. Deze procedure liet ons toe om dendrimeren te genereren met een voldoende aantal carboxylaatgroepen om oplosbaarheid in water te geven. Ter voltooiing van de hydrolyse, was de dendrimeer behandeld met 0,1 N waterige NaOH ('s nachts). Als gevolg hiervan kon pure porfyrine-dendrimeer carbonzuren worden afgezonderd in een 80-95% rendement. Wijziging van de dendrimeer periferie. Op dit punt, uitgaande van dezelfde porfyrine-dendrimeer, ofwel een-of twee-foton sondes kunnen worden gesynthetiseerd. In het eerste geval worden alle de perifere carboxylgroepen gemodificeerd met PEG-eenheden - een methodologie die bekend staat als PEGylering. In het laatste geval worden meerdere carboxylgroepen eerst gekoppeld met twee-foton antenne chromoforen (Cumarine-343), gewijzigd met ethyleendiamine (EDA) linkers, gevolgd door PEGylering van de resterende carboxyls [6]. Dendrimeren waren gePEGyleerde met behulp van monomethoxyoligoethyleneglycolamine (m-PEG-NH 2, Av. MW 1000) met behulp van HBTU / DIPEA koppeling chemie. 2,14) Aan een oplossing van de dendron in NMP (of DMF) (1-10 mm) 1,25-voudige overmaat van HBTU werd toegevoegd en het reactiemengsel werd geroerd bij kamertemperatuur 10 minuten. 6,25-voudige overmaat van DIPEA werd toegevoegd, gevolgd door de directe toevoeging van 1,25-voudige overmaat van m-PEG-NH2. Het reactiemengsel werd geroerd gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur. Diethylether werd toegevoegd aan het reactiemengsel, werd de gevormde neerslag gescheiden door centrifugeren en opnieuw neergeslagen uit THF door het toevoegen van diethylether. 2,15) Final zuivering werd bereikt met size-exclusion chromatografie door het verzamelen van de eerste fase van front. GePEGyleerde porfyrine-dendrimeer werd opgelost in een kleine hoeveelheid THF (~ 15 ml) en geladen op de top van een chromatografische kolom gevuld met polystyreen SEC fase (Biorad, Biobeads S-X1). De kolom werd geëlueerd met pure THF, en de donkere gekleurde band bewegen met de voorkant werd verzameld. 2,16) THF werd verwijderd op een roterende verdamper, waarna het resterende materiaal werd gedroogd in een vacuüm. 3. Probe karakterisering Fotofysische karakterisering omvat metingen van absorptie en emissie van de sonde spectra, fosforescentie levens τ 0 en Stern-Volmer zuurstof quenching constanten k q onder fysiologische omstandigheden. 3.1) De absorptie en emissie spectra worden verkregen onder omgevingsomstandigheden met behulp van standaard instrumenten (spectrofotometer en gestage fluorometer). ~ 1 uM oplossingen van de sonde wordt gebruikt. 3.2) Vervolgens wordt de Stern-Volmer kalibratie plot verkregen. Dit is de meest belangrijke meting, omdat het ons toelaat om de levensduur van de sonde hebben betrekking op de zuurstofconcentratie. 3.3) Een oplossing van de sonde in PBS-buffer (pH 7,2) is geplaatst in een speciale cilindrische cuvet, die is geplaatst in de temperatuur gecontroleerde ruimte, bevindt zich in een licht-ondoorlaatbare kooi met poorten voor excitatie en emissie optische vezels. De vezels worden gebracht in nauw contact met de cuvet in de kamer in de juiste hoek geometrie. 3.4) De cuvette wordt afgesloten met een stop, waarin een zeer gevoelige Clark-type zuurstof elektrode (CK-zuurstof elektrode) is geplaatst. De stop bevat ook twee naald-poorten voor inlaat en uitlaat van argon. De elektrode wordt ondergedompeld in de oplossing, terwijl de naalden alleen maar zorgen voor de stroom van de gasstroom boven de oplossing oppervlak. In eerste instantie is argon niet aangesloten op de inlaat. 3.5) De temperatuur wordt ingesteld op de gewenste waarde (meestal 36-37 ° C) en de oplossing is gelaten onder roeren gedurende evenwicht. 3.6) De excitatie vezel is aangesloten op de excitatie-poort van een digitale phosphorometer, bediend door een PC. De lichtbron in de phosphorometer is een high-power LED, waarvan de productie wordt gecontroleerd door een 333 kHz D / A-board. De emissie vezel is verbonden met een andere optische poort van de phosphorometer, die is gekoppeld aan een uiterst gevoelige infrarood-APD (lawine fotodiode). De uitgang van de diode wordt versterkt en gevoed in de A / D-kanaal van dezelfde controle bestuur, dat synchronisatie tussen de excitatie en emissie-kanalen mogelijk maakt. 3.7) De controle software aldieptepunten generatie van excitatie pulsen van elke gewenste lengte (bijvoorbeeld 5 of 10 ms), gevolgd door verzameling van fosforescentie verval tijdens een willekeurig gekozen periode (meestal 2-3 ms). Tijd die nodig is voor een enkel leven meting is typisch 0.5-1 s, echter, kan de metingen zo snel worden verkregen als 10-20 per seconde. 3.8) De uitgang van de zuurstof elektrode wordt versterkt en gericht in een andere A / D-board op dezelfde pc. Dit is een lage frequentie board (1 kHz max), die wordt gebruikt om de elektrode stroom op een bepaalde tijdsspanne te nemen. Het programma voor het opnemen van de elektrode gegevens loopt gelijktijdig met de phosphorometer software. 3.9) Zodra de oplossing temperatuur evenwicht, worden zowel de phosphorometer en de elektrode programma's geïnitialiseerd op hetzelfde moment uit te voeren metingen elke 10 s. Hun uitgangen zijn synchroon ingelogd in twee afzonderlijke bestanden. Daarna wordt argon aangesloten op de inlaat-poort van de cuvet stop. 3.10) Omdat argon stroomt over het oppervlak van het geroerde oplossing, vervangt geleidelijk aan zuurstof. Dit resulteert in een afname van de elektrode de huidige en een toename van de fosforescentie leven, die wordt gemeten door de phosphorometer. Meestal wordt zuurstof verdrongen vormen de oplossing volledig na ongeveer 2 uur, gedurende welke tijd de gegevens volledig worden automatisch gelogd in bestanden. 3.11) Na het einde van de titratie uitgevoerd, worden de elektrode gegevens en de fosforescentie levens geïmporteerd in een standaard analyse programma (bijv. Miocrocal Origin). De elektrode huidige lineair afhankelijk zuurstofconcentratie, en voor de elektrode wordt gebruikt is het praktisch nul op nul zuurstof. Bij atmosferische druk, is pO 2 bekend (ongeveer 150 mm Hg). Zo kan de elektrode gegevens rechtstreeks worden omgezet in de zuurstof-schaal, en de plot van inverse fosforescentie leven vs pO 2 kan worden geconstrueerd. Dit perceel is voorzien van een rechte lijn met behulp van de kleinste kwadraten methode om de zuurstof quenching constant kq als de helling te geven. Fosforescentie levensduur t0 wordt verkregen uit dezelfde passen (als het omgekeerde van de intercept), of direct van de meting bij nul-zuurstof. 3.12) Indien nodig, de titratie wordt herhaald met een oplossing van de sonde in de aanwezigheid van albumine - een eiwit aanwezig in het bloed plasma in hoge concentraties, - in om de voorwaarden na te bootsen ontmoetten elkaar in het echte experimentele systeem (het bloed van een dier in vivo). Het verkrijgen van Stern-Volmer percelen moet identiek zijn als de dendrimeer is het beschermen van de sonde goed en PEG groepen te isoleren van de sonde van de contacten met albumine. Anders zal de sonde en de eiwitten in het bloed interactie, en dat zal leiden tot een gewijzigde Stern-Volmer plot, waardoor onduidelijkheid in zuurstof metingen. Aldus verkregen calibratie constanten worden gebruikt in de beeldvorming experimenten waarbij de zuurstof concentraties a priori onbekend.

<ol><li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+on+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based on quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+A+novel+method+for+measuring+the+distribution+of+oxygen+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring the distribution of oxygen in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Lebedev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+phosphorescent+probes+for+oxygen+Imaging+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dendritic phosphorescent probes for oxygen Imaging in biological systems.</a> Acs Applied Materials and Interfaces. 1, 1292-1304 (2009).</li>
<li>Finikova, O. S., Cheprakov, A. V., Beletskaya, I. P., Carroll, P. J., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+versatile+synthesis+of+substituted+tetrabenzoporphyrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins.</a> Journal of Organic Chemistry. 69, 522-535 (2004).</li>
<li>Lindsey, J. S., Schreiman, I. C., Hsu, H. C., Kearney, P. C., Marguerettaz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rothemund+and+Adler-Longo+Reactions+revisited%3A+Synthesis+of+tetraphenylporphyrins+under+equilibrium+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rothemund and Adler-Longo Reactions revisited: Synthesis of tetraphenylporphyrins under equilibrium conditions.</a> Journal of Organic Chemistry. 52, 827-836 (1987).</li>
<li>Lebedev, A. Y., Troxler, T., Vinogradov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+metalloporphyrin-based+dendritic+nanoprobes+for+two-photon+microscopy+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Porphyrins+and+Phthalocyanines%22%5BJournal%5D)">Design of metalloporphyrin-based dendritic nanoprobes for two-photon microscopy of oxygen.</a> J. Porphyrins and Phthalocyanines. 12, 1261-1269 (2008).</li>
</ol>

<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"&gt;<tr<td<strong&gt; Afkorting</strong<strong</strong</td&gt;<td<strong&gt; Volledige naam</strong<strong</strong</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMP</td&gt;<td&gt; N-methylpyrrolidinone</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; TFA</td&gt;<td&gt; Trifluorazijnzuur</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DIPEA</td&gt;<td&gt; Diisopropylethylamine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; HBTU</td&gt;<td&gt; 2 - (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfaat</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; DMSO</td&gt;<td&gt; Dimethylsulfoxide</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; CDMT</td&gt;<td&gt; CDMT = 1-chloor-3 ,5-dimethoxytriazine</td&gt;</tr&gt;<tr<td&gt; NMM</td&gt;<td&gt; NMM = N-methylmorfoline</td&gt;</tr&gt;</table

synthese en kalibratie van phosphorescent nanosondes voor zuurstof imaging in biological systems

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Zuurstof meting door fosforescentie afschrikken [1, 2] bestaat uit de volgende stappen: 1) de sonde wordt geleverd in het medium van belang (bijv. bloed of interstitiële vloeistof), 2) het object wordt verlicht met het licht van de juiste golflengte te prikkelen de sonde in zijn triplet toestand, 3) de uitgezonden fosforescentie wordt verzameld, en het tijdsverloop is geanalyseerd om de fosforescentie levensduur, die wordt omgezet in de zuurstofconcentratie (of de partiële druk, PO opbrengst<sub&gt; 2</sub&gt;). De sonde moet geen interactie met de biologische omgeving en in sommige gevallen te worden 4) uitgescheiden uit het medium op het einde van de meting. Elk van deze stappen stelt eisen aan de moleculaire ontwerp van de fosforescerende sondes, die de enige invasieve component van het meetprotocol vormen. Hier bespreken we het ontwerp van dendritische fosforescerende nanosensoren voor zuurstof metingen in biologische systemen. De sondes bestaan ​​uit Pt of Pd porfyrine-based polyarylglycine (AG) dendrimeren, perifeer gemodificeerd met polyethyleenglycol (PEG&#39;s) residuen. Voor een effectieve twee-foton excitatie, kan termini van de dendrimeren worden aangepast met twee-foton antenne chromoforen, die de excitatie-energie op te vangen en het kanaal naar de triplet kernen van de sondes via intramoleculaire FRET (Förster Resonance Energy Transfer). We beschrijven de belangrijkste fotofysische eigenschappen van de sondes en de huidige gedetailleerde kalibratie protocollen.

We presenteren de beginselen van zuurstof metingen door fosforescentie afschrikken en herziening ontwerp van porfyrine-op basis van dendritische nanosensoren voor zuurstof imaging in biologische systemen.

Synthese en Kalibratie van Phosphorescent nanosondes voor zuurstof Imaging in Biological Systems

Zuurstofmeting via fosforescentie-quenching [1, 2] bestaat uit de volgende stappen: 1) de probe wordt gebracht in het medium van belang (bijv. bloed ...

We presenteren het ontwerp van fosforescerende probes voor zuurstof op basis van platina- en palladiumporfyrine-DER's. De probes bestaan uit metaalporfyrinekernen die een dendron inkapselen en een perifere hydrofiele polyethyleenglycolaag; de constructie van de probes en hun kalibraties worden in dit artikel toegelicht. Hallo, mijn naam is Luis Sinks.Ik werk samen met professor Sergei OV hier op de afdeling Biochemie en Biofysica aan de University of Pennsylvania. Ik ben Emmanuel Losis, ook van de Vina. Ik ben Sergei V. Metingen van biologisch zuurstofgehalte via fosfor-quenching maken gebruik van exogene fosforsondes, die direct in het betreffende medium worden geïntroduceerd.Bloed- of interstitiële vloeistofprobes zijn de enige invasieve componenten van het meetschema die speciale aandacht vereisen bij hun ontwerp. Vandaag tonen we u een procedure voor de synthese en kalibratie van dendritische fosforescerende nanoprobes voor zuurstofmetingen en biologische systemen. We gebruiken deze procedure om probes te synthetiseren en te karakteriseren voor semi- en tweevoudige zuurstofmetingen.Laten we beginnen. Voordat we de probes gaan vervaardigen, bespreken we eerst de basisprincipes van probe-fosforescentie. Fosforescentie is afkomstig van de langlevende triplettoestand.Het sondemolecuul moet zo worden ontworpen dat het een hoge kwantumopbrengst van de triplettoestand geeft en fosforescentie uitstraalt in plaats van fluorescentie. Excitatie van de sondes vindt plaats via het één-foton-mechanisme of, in het geval van speciale twee-foton-versterkte sondes, via het twee-foton-mechanisme. Eén-foton-excitatie biedt over het algemeen een lagere ruimtelijke resolutie, maar vereist eenvoudigere instrumentatie en kan worden gebruikt bij enkelpuntsmetingen met LED-gebaseerde glasvezel-fosforimeters.Wanneer de probe zich in de triplettoestand bevindt, kan deze botsingsinteracties ondergaan met zuurstofmoleculen, wat de triplettoestand kan deaktivaten; dit proces wordt quenching genoemd. Bij aanwezigheid van zuurstof wordt de fosforescentie-levensduur daarom verkort. Als gevolg van deze quenching wordt de afhankelijkheid van de levensduur van de triplettoestand van de hoeveelheid zuurstof in de omgeving gekenmerkt door de Stern-Volmervergelijking.In in vivo experimenten wordt de probe toegediend in het bloed of het interstitiële vocht van een dier, waarna het weefseloppervlak wordt belicht met licht van een geschikte golflengte om de probe in zijn aangeslagen triplettoestand te brengen. Om de fosforescentieleftijd te meten, worden de uitgezonden fosforescentiefotonen in de tijd gebind. Bijvoorbeeld: na de excitatiepuls kunnen er 3.609 fotonen worden verzameld in de eerste vijf microseconden, 1.421 fotonen in de volgende vijf microseconden, enzovoort, totdat er geen fotonen meer worden verzameld.De getallen in de bins uitgezet tegen de tijd geven het fosforescentie-verval weer, dat wordt geanalyseerd om de fosforescentie-levensduur te bepalen. Bij beeldvorming wordt deze procedure op elke pixel van het beeld toegepast, wat resulteert in fosforescentie-levensduurkaarten. Metingen van levensduur zijn ongevoelig voor heterogeniteiten in de distributie van de probe door het object, wat gebruikelijk is bij biologische monsters.Laten we nu bekijken hoe de probes worden geconstrueerd. Start de syntheseprocedure door een aromatisch aldehyde toe te voegen aan een 0,01 molaire oplossing van tetrahydroisoindole. Roer het reactiemengsel 10 minuten lang in het donker bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens boortrifluoride-diethyletheraat toe en blijf nog twee uur roeren. Voeg daarna dichloorcyanbenzoquinon of DDQ toe, waardoor de kleur verandert van lichtrood naar donkergroen. Laat het mengsel een nacht onder voortdurend roeren staan. Was en droog de oplossing de volgende dag en concentreer deze vervolgens in een vacuüm.Herhaalde kristallisatie van het residu levert het doelproduct op als een groen poeder. De opbrengsten liggen doorgaans rond de 50%. Behandel vervolgens de vrije base porfyrine met palladiumacetaat. Controleer de conversie via UV-vis spectroskopie.De conversie is voltooid wanneer de zeepband van de Dion tussen 468 en 472 nanometer verdwijnt. De porfyrine wordt geïsoleerd door middel van kolomchromatografie op silicagel. Om palladium-tetrabenzo-porfyrine te bereiden, wordt het palladium-tetracyclo-porfyrine geoxideerd.Tijdens het refluxeren verandert de kleur van donkerrood naar diepgroen; laat het oplosmiddel verdampen, verdun het residu met dichloormethaan, was, droog en concentreer de organische fase in vacuüm. Isoleer na chromatografie op silicagel palladium-tetrabenzoporfyrine als een blauwgroen poeder. Hydrolyseer vervolgens de perifere estergroepen van het palladium-tetrabenzoporfyrine.Behandel eerst de tetrabenzoporfyrinester met een base in tetrahydropyran. Zet vervolgens de hydrolyse voort met een waterige base, sla de porfyrine neer door toevoeging van zoutzuur en droog deze in vacuüm. Hiermee is de synthese van de porfyrine voltooid.Laten we nu bekijken hoe entrons gesynthetiseerd worden. Voordat de probes worden samengesteld, moeten de entrons, die de takken van de Denmark vormen, vooraf worden gesynthetiseerd. We maken gebruik van aero gly, dezelfde DERs, die op eenvoudige wijze kunnen worden geprepareerd uit goedkope startmaterialen met behulp van chromatografievrije methoden.Theronen met aminogroepen op hun brandpunten worden vervolgens bevestigd aan de carilgroepen op de fy, waarvan we zojuist hebben laten zien hoe ze gemaakt moeten worden. Vervolgens worden de estergroepen aan de periferie van de DME gehydrolyseerd, op soortgelijke wijze als de carboxylgroepen aan de periferie van het porfyrine. Op dit punt kunnen, uitgaande van het porfyrine DME polycarboxylzuur, één of twee foton-sondes worden gesynthetiseerd om de tweefoton-sondes te verkrijgen.Bevestig eerst divergent enkele twee-foton antennefragmenten aan verschillende carboxylgroepen aan de periferie van de demer. Ga nu verder met de modificatie van de resterende carbonzuurresiduen op de demer. Begin met het toevoegen van een 1,25-voudig overschot HBTU aan een sterk geconcentreerde oplossing van de porfyrine-rimer en roer het reactiemengsel 10 minuten bij kamertemperatuur.Voeg nu di-isopropylethylamine en methoxypolyethyleenglycolamine toe. Roer het reactiemengsel twee dagen bij kamertemperatuur en voeg vervolgens ethylether toe. Scheid het gevormde neerslag via centrifugatie en precipiteer dit een aantal keren opnieuw uit tetrahydrofuraan door diethylether toe te voegen.Zuiver tenslotte de probe door middel van grootte-uitsluitingschromatografie op polystyreenkralen met tetrahedran als oplosmiddel. Laten we nu kijken naar de karakterisering en kalibratie van de probe. De absorptie- en emissiespectra van de probe worden verkregen met behulp van probe-oplossingen van 1 µM onder omgevingscondities met een standaard spectrophotometer en een steady-state fluorimeter.Om vervolgens de Stern-Volmer-kalibratiegrafiek te verkrijgen, waarmee we de levensduur van de probe kunnen relateren aan de zuurstofconcentratie, plaatst u een oplossing van de probe in een speciale cilindrische cuvet. De cuvet wordt geplaatst in een temperatuurgecontroleerde kamer binnen een lichtdichte kooi met poorten voor excitatie- en emissie-optische vezels. Sluit de cuvet af met een stop waar een zeer gevoelige zuurstofelektrode van het Clark-type in is geplaatst.De stopper heeft ook twee naaldpoorten voor de in- en uitlaat van argon. Stel de temperatuur in op 36 tot 37 °C en laat de oplossing roeren tot het evenwicht is bereikt. Verbind de excitatievezel met de excitatiepoort van een door een pc aangestuurde digitale fosforimeter.De lichtbron en de phos perimeter bestaan uit een krachtige LED, waarvan de output wordt aangestuurd door een digitaal-naar-analoogbord van 333 kilohertz. De emissievezel is verbonden met een andere optische poort van de phos perimeter, die is gekoppeld aan een infraroodgevoelige avalanche-fotodiode. De output van de diode wordt versterkt en naar het ad-kanaal van hetzelfde aansturingsbord gevoerd, waardoor synchronisatie tussen de excitatie- en emissiekanalen mogelijk is.De zelfgeschreven aansturingssoftware genereert excitatiepulsen van elke gewenste lengte, gevolgd door de registratie van het fosforescentie-verval. De output van de zuurstofelektrode wordt versterkt en geleid naar een ander analoog-digitaal bord op dezelfde pc. Dit is een laagfrequent bord, met een maximum van één kilohertz, dat wordt gebruikt om de elektrodestroom op geselecteerde tijdstippen te registreren, doorgaans 10 keer per seconde.Zodra de temperatuur van de oplossing is geëquilibreerd, worden zowel het phos perimeter- als het elektrodeprogramma gelijktijdig geïnitieerd. Om elke 10 seconden metingen uit te voeren, worden hun outputs synchroon gelogd in twee afzonderlijke bestanden. Daarna wordt Argonne aangesloten op de inlaatpoort van de vetstopper.Terwijl argon over het oppervlak van de geroerde oplossing stroomt, vervangt het geleidelijk de zuurstof. Dit resulteert in een afname van de elektrodestroom en een toename van de fosforlevensduur, die wordt gemeten met de fosforperimeter. Meestal wordt de zuurstof volledig uit de oplossing verdreven.Ongeveer twee uur na de titratiestrun worden de elektrodedata en de fosforlevensduuren geïmporteerd in een standaard analyseprogramma, dat een plot maakt van de inverse fosforlevensduur tegenover de zuurstofpartiële druk. Deze plot wordt met een rechte lijn gefit via de methode van de kleinste kwadraten om de zuurstofquenchingsconstante als helling te bepalen. De fosforescerende levensduur wordt verkregen uit dezelfde fit of direct uit de meting bij nul zuurstof.De titratie kan worden herhaald met een oplossing van de probe in aanwezigheid van albumine, een eiwit dat in het bloedplasma voorkomt, om de condities na te bootsen die in vivo in het bloed van een dier worden aangetroffen. De verkregen Stern-Volmer-plots moeten identiek zijn als de ER de probe beschermt en de peg-groepen de probe isoleren van contact met albumine.Hier worden suggesties gegeven voor geselecteerde stappen in de synthese van zuurstof, gevolgd door de behandeling van probes en hun kalibratie. Bij het uitvoeren van de kalibratie is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de condities zo dicht mogelijk aansluiten bij die van het biologische systeem dat wordt onderzocht.Het is belangrijk om er zeker van te zijn dat het sondemolecuul niet wordt beïnvloed door biomoleculen, zoals albumine. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

synthesis-calibration-phosphorescent-nanoprobes-for-oxygen-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een experimentele procedure voor het meten van de partiële druk van zuurstof (pO2) in cerebrale vaatstelsel op basis van zuurstof-afhankelijke quenching van fosforescentie. Dier voorbereiding en beeldvormende procedures werden uiteengezet voor zowel grote beeldveld van CCD-gebaseerde beeldvorming van pO2 in ratten en twee-foton excitatie gebaseerde beeldvorming van de pO2 in muizen.

Cerebral Blood Oxygenatie meting op basis van zuurstof-afhankelijke Afschrikken van Fosforescentie

Dit protocol beschrijft een methode voor micronschaal drie-dimensionale beeldvorming van zuurstofconcentratie in de directe omgeving van levende cellen door electron spin resonantie microscopie.

Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

Fluorescerende nanodeeltjes geproduceerd in ons lab wordt gebruikt voor beeldvorming ion concentraties en fluxen ion in biologische systemen zoals cellen tijdens de signalering en interstitiële vloeistof tijdens fysiologische homeostase.

Fluorescerende Nanodeeltjes voor het meten van Ion Concentratie in Biological Systems

NADPH oxidase is de belangrijkste bron van reactieve zuurstof species (ROS) in fagocyten. Vanwege de vluchtigheid van ROS is moeilijk te meten en te controleren ROS levels in levende dieren. Een minimaal invasieve methode voor seriële kwantificering van ROS in levende muizen beschreven.

Bioluminescentie beeldvorming van NADPH-oxidase activiteit in verschillende diermodellen

Dit manuscript presenteert protocollen voor de toepassing van nieuwe genetisch gecodeerde stikstofmonoxide (NO•) sondes (geNOps) om NO• schommelingen in één cel in real-time te monitoren met behulp van fluorescentiemicroscopie. De Ca2+-getriggerde NO• vorming op het niveau van individuele endotheelcellen werd gevisualiseerd door geNOps te combineren met een chemische Ca2+ sensor.

Toepassing van genetisch gecodeerde Fluorescent stikstofoxide (NO •) Probes, de geNOps, voor real-time beeldvorming van NO • Signalen in afzonderlijke cellen

Hier presenteren we een methode van de spectroscopische karakterisering van organische moleculen door middel van time-resolved fotoluminescentie spectroscopie op de nanoseconde-naar-milliseconde tijdschaal in zuurstofvrije omstandigheden. Methoden voor het efficiënt verwijderen zuurstof uit de monsters en, dus, beperken luminescentie blussen worden ook beschreven.

Time-resolved fotofysische karakterisering van Triplet-oogst organische verbindingen in een zuurstofvrije omgeving met behulp van een iCCD Camera

We beschrijven het gebruik van een nieuwe, frequentie-domein luminescentie Lifetime camera voor het in kaart brengen van 2D O2 -distributies met optische sensor folies. Het camerasysteem en beeldanalyse procedures worden beschreven samen met de voorbereiding, kalibratie en toepassing van sensor folies voor het visualiseren van de O2 micro-omgeving in de rizosfeer van waterplanten.

Luminescentie Lifetime beeldvorming van O2 met een op frequentiedomein gebaseerd camera systeem

Het protocol beschrijft high-throughput sferoïde generatie voor bioprinting met behulp van de multi-parametrische analyse van hun oxygenatie en celdood op een standaard fluorescentiemicroscoop. Deze aanpak kan worden toegepast om de levensvatbaarheid van de sferoïden te controleren en standaardisatie uit te voeren, wat belangrijk is bij het modelleren van 3D-weefsel, tumormicro-omgeving en succesvolle (micro)weefselbiofabricage.

Betaalbare zuurstofmicroscopie-geassisteerde biofabricage van meercellige sferoïden

Dit artikel beschrijft het gebruik van een nieuwe, snelle optische imager voor de macroscopische fotoluminescentie lifetime imaging van monsters die lang verval uitzenden. De integratie-, beeldacquisitie- en analyseprocedures worden beschreven, samen met de voorbereiding en karakterisering van de sensormaterialen voor de beeldvorming en de toepassing van de imager bij het bestuderen van biologische monsters.

Fluorescentie Lifetime Macro Imager voor biomedische toepassingen

We presenteren een protocol om metabole activiteiten in cellen gereguleerd door aminozuren direct te visualiseren met behulp van deuteriumoxide (zwaar water D2O) gesondeerde gestimuleerde Raman-verstrooiing (DO-SRS) microscopie, die is geïntegreerd met twee-foton excitatie fluorescentiemicroscopie (2PEF).

Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

Dit protocol presenteert een methode voor het vervaardigen van een dubbellaagse microfluïdische chip en het analyseren van microbiële groei onder snelle zuurstofoscillaties. De prestaties van het apparaat werden gevalideerd door middel van zuurstofdetectie in vloeistofkanalen en microbiële teelt.

Het creëren van snelle zuurstofoscillaties in microbiële eencellige groeianalyse met behulp van een microfluïdisch dubbellaags apparaat

Leer de synthese en kalibratie van fosforescerende nanosondes voor zuurstofmeting in biologische systemen met platina- en palladiumporfyrine-dendrimers. Deze methode verbetert biologische beeldvorming.

Synthese en Kalibratie van Phosphorescent nanosondes voor zuurstof Imaging in Biological Systems

Meer video's verkennen