Name: Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Leer een methode voor het kwantitatief analyseren van GFP-expressie in plantencellen met behulp van een op maat gemaakt robotsysteem. Dit protocol maakt semi-continue beeldverzameling mogelijk gedurende 100 uur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Salarissen en ondersteuning van het onderzoek werden door de Verenigde Soja Board, en door de staat en federale fondsen toegerekend aan de Ohio State University / Ohio Agricultural Research and Development Center. Dit onderzoek werd ook gedeeltelijk ondersteund door een beurs van CONACYT, Mexico, aan CMHG. Vermelding van handelsmerk of eigen producten vormt geen garantie of waarborg van het product door OSU / OARDC en impliceert geen goedkeuring aan de uitsluiting van andere producten die ook geschikt kunnen zijn. Tijdschriftartikel Geen HCS 09-17.

De volgende methode schetst een protocol voor het imago van de analyse van genexpressie met behulp van een geautomatiseerd systeem voor het verzamelen afbeelding. Voor het gemak van uitleg, was de algehele aanpak opgesplitst in vier stappen: 1) zaad voorbereiding, 2) gen introductie met behulp van deeltjesbombardement, 3) robot beeldcollectie, en 4) beeldanalyse. Hoewel deze algemene methodiek kan worden gebruikt voor een breed scala van andere toepassingen, zijn de huidige sets van protocollen gebaseerd op het gebruik van het groen fluorescerend eiwit (GFP) gen, dat is een handig reporter gen voor het bijhouden van genexpressie in hetzelfde stuk van levend weefsel in de tijd. I. Seed Voorbereiding <ol><li> Lima boon (. Phaseolus lunatus cv Henderson-Bush) zaden kunnen worden gekocht, of idealiter geoogst van planten gekweekt in een groeikamer (50% relatieve vochtigheid, 16 / 8 uur licht: donker, 25/23 ° C dag / nacht). Na de oogst zaden kwaliteit kan worden gehandhaafd door het opslaan van zaden bij -20 ° C. </li><li> Bereid Magenta GA7 containers voor kiemende zaden. Vouwen filter papier of papieren handdoeken te passen in de bodem van Magenta dozen. Voeg ~ 25 ml gedeïoniseerd water om elke container op papier handdoeken bevochtigen, en uit niet-geabsorbeerde giet water. Autoclaaf papier-bevattende boxen bevochtigd gedurende 20 minuten. </li><li> Met behulp van 50 ml voor eenmalig centrifugebuizen, steriliseren zaden in een 10% commercieel bleekmiddel-oplossing (20 zaden in 20-40 ml) gedurende 20 min met schudden op een tolbrekers shaker bij 60 rpm. Opmerking: Alle van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. </li><li> Spoel zaden 4-7 keer met steriel gedemineraliseerd water met een zacht schudden 30 seconden tijdens elke spoelen. </li><li> Plaats 5-6 steriele zaden tussen laagjes van gevouwen papier zich in elke steriele Magenta box. </li><li> Incubeer zaden voor 4 dagen onder de volgende voorwaarden: 25 ° C, 16 / 8 uur licht: donker en 40 μEm -2 s -1. </li></ol> II. Gene Inleiding met deeltjesbombardement <ol><li> Bouw genconstructen met behulp van uw favoriete expressievector met een reporter-gen die kunnen worden gecontroleerd in levende weefsels. Wij hebben een hoog kopie-aantal expressievector nuttig voor de promotor en promotor element analyses. Deze vector bevat het GFP-gen die wordt gebruikt om promoter / promotor element functie in getransformeerde weefsel te visualiseren. </li><li> Ongeveer 1-2 uur voor bombardement, accijnzen lima bonen zaadlobben van kiemen zaailingen en verwijder het zaad jassen. Zaadlobben geschikt voor het bombardement moet worden geel aan het licht groen, vlak en vrij van enige schade die zou kunnen interfereren met verdere beeldanalyse. </li><li> Plaats zaadlobben op OMS kweekmedium met MS-zouten een, B5 vitaminen 2, 3% sucrose en 0,2% Gelrite (pH 5,7) onmiddellijk na het weggesneden. </li><li> Neerslaan van de DNA-construct op M10 wolfraam deeltjes (Sylvania, Towanda, PA, USA). In een 0,6 ml microfugebuis, voeg 25 ul wolfraam deeltjes (deeltjes zijn geresuspendeerd in steriel water, 100 mg ml -1, vlak voor gebruik), 5 ul DNA (1 ug ul -1), 25 pi 2,5 M calciumchloride (Sigma -Aldrich Cat. C3881-500G) en 10 pi 100 mM spermidine (Sigma Cat. S-2626). Vortex kort om goed te mengen alle componenten. </li><li> Incubeer de DNA voorbereiding op ijs gedurende 5 minuten. Dan, te verwijderen en gooi 50 ul supernatans. </li><li> Resuspendeer de DNA-gecoate deeltjes door vortexen en onmiddellijk verwijderen van een 2 pi aliquot deel. Herhaal deze vortexen stap iedere keer een hoeveelheid wordt verwijderd uit de buis. Gecoate deeltjes moeten worden bewaard in ijs en binnen 15 minuten. </li><li> Door de bovenkant van een injectiespuit filter, plaats 2 pi gecoate deeltjes in het midden van het filter scherm. Plaats het filter met de gecoate deeltjes in het filter holding unit binnen het deeltje pistool kamer. </li><li> Plaats een lima boon zaadlob adaxial kant naar boven op een baffle en plaats de baffle in het deeltje pistool kamer. De baffle, die bestaat uit een scherm gesmolten op de bodem van een beker, wordt gebruikt als een platform om weefsels te ondersteunen tijdens het bombardement. </li><li> Bombarderen de weefsels met behulp van een Particle Gun (in deze methodiek, gebruiken we een eenvoudige en goedkope Particle Instroom Gun 3, PIG, ontworpen in ons laboratorium) als volgt uit: a) de klep die naar de stofzuiger om de kamer te ontruimen, b) open na het vacuüm bereikt 760 mm (30 in) Hg, activeer de solenoïde en laat de helium om de deeltjes te drijven, c) na deeltjesbombardement, sluit het vacuüm lijn kraan en laat het vacuüm met behulp van de uitlaatklep. De helium druk gebruikt om de deeltjes te versnellen is 50 PSI. </li><li> Nadat het vacuüm wordt vrijgegeven, open de deur naar de kamer gebombardeerd zaadlobben op te halen en tot de terugkeer van de zaadlob, adaxial kant, om OMS kweekmedium. Opmerking: Voor kwantificering en genexpressie, we meestal bombarderen een minimum van drie zaadlobben voor elke DNA-construct. Een positieve controle, wat meestal een DNAconstruct dat geeft een goed bestudeerde gen-expressie profiel, is opgenomen als een referentie. </li></ol> III. Geautomatiseerde Image Collection <ol><li> Zet de kwiklamp en wacht tot 30 minuten voor de lamp is opgewarmd. </li><li> Schakel de stroom bronnen voor de Spot-RT CCD-camera (Diagnostic Instruments Inc, Sterling Heights, MI, USA) en de robotica platform motor controller, die de beweging van de robotica platform drives. </li><li> Stel het filter voor GFP-detectie (GFP2 filter in te stellen,.. Ex 480/40 nm, Em 510 LP) op een MZFLIII dissectiemicroscoop (Leica, Heerbrugg, Zwitserland). </li><li> Steriliseer de verdikte polycarbonaat petrischaal deksels door te besproeien met 70% ethanol. De gespecialiseerde deksels, gebruikt ter dekking van de petrischaal basis condensatie te voorkomen tijdens fotocollectie 4. </li><li> Plaats de platen met gebombardeerd zaadlobben op de robotica platform (Arrick Robotica, Hurst, TX, USA) van de geautomatiseerde fotocollectie systeem. De robotica platform wordt aangedreven door een stappenmotor set en bestaat uit een tabel voor de bevestiging van 8 petrischalen. Het platform is opgebouwd uit polycarbonaat, polypropyleen en aluminium. Platen zijn bevestigd in positie door het aandraaien van een laterale plastic set-schroef. </li><li> Open de aangepaste software applicatie die zowel de robotica platform en beeldacquisitie controles. Ook, opent u de software witte licht controller schakelaar. </li><li> In de "motor motion" tab, klik op "motor" en "motor home". Nadat de software richt het platform om de uitgangspositie, we zijn klaar om te beginnen met het invoeren posities voor elke zaadlob. </li><li> In de "motor motion" tab, selecteer de eerste plaat. Het platform zal de positie van de midden van de petrischaal onder de doelstelling van de microscoop. Met behulp van de bewegende afstand knoppen, juist positie de eerste zaadlob voor beeld collectie. Met het witte licht controller op, kan het doelgebied worden waargenomen door de computer monitor door het aanzetten van de "live-modus"-functie. </li><li> Voor de eerste zaadlob, stelt u de focus en vergroting (1,6 x vergroting heeft de voorkeur) met behulp van de handleiding knoppen op het ontleden microscoop. Focus aanpassingen voor de resterende zaadlobben op dezelfde plaat worden gemaakt met behulp van drie nivelleerschroeven zich onder elk bord, op de robotica platform. </li><li> Zodra het gebied van belang is ingesteld, klikt u op de "add deze positie" te klikken. De software voegt de coördinaten van deze regio naar een positie schema bestand en het platform zal terugkeren naar het midden van de plaat. </li><li> Stel posities en focus voor alle resterende zaadlobben op de borden met de bewegende afstand knoppen en handmatige nivelleerschroeven. Na alle coördinaten van alle de zaadlobben zijn ingevoerd, slaat u de positie schema coördinaten. </li><li> Voer de fotocollectie parameters. In het "beeld instelling" tab, selecteer het type licht gewenst, wit of blauw. Voor GFP detectie, alleen het blauwe licht worden gebruikt. Ook voert u de belichtingsinstelling. Hoewel we kunnen de tijd van de blootstelling onafhankelijk van rode, blauwe en groene kleur te wijzigen, wij gebruiken meestal dezelfde instellingen voor het GFP foto-documentatie (20, 14 en 14 seconden voor rood, groen en blauw kanalen, respectievelijk) waardoor we om directe en consistente vergelijking tussen de verschillende DNA-constructen. </li><li> In dezelfde "beeldinstelling" tab, geef een lege map waarin de afbeeldingen worden opgeslagen. Elke serie beelden worden opgeslagen in deze hoofdmap in onafhankelijke mappen, genummerd opeenvolgend volgens de volgorde van de posities ingeschreven voor zaadlobben. </li><li> Ga naar de "capture time control" tab en stel het beeld overname tijdsinterval en het totale aantal cycli van het beeld collectie. Beelden worden meestal verzameld elk uur voor 100 uur, het genereren van goed gedefinieerde genexpressie profielen. </li><li> Begin beeldacquisitie door te klikken op de "run schema!" knop in het "positie schema" tabblad. </li><li> Aan het einde van de 100 h afbeelding verzameling, overdracht al de beelden van de computer regelen van de robot op een grote capaciteit harde schijf of computer voor verdere beeldanalyse. Beelden met hoge resolutie (1600 x 1200 pixels) worden verzameld als TIF-bestanden te meten ~ 5 Mb per stuk. </li></ol> IV. Beeldanalyse <ol><li> Monteer de 100 opeenvolgende beelden van elke map met behulp van Adobe ImageReady. <ol><li> Open ImageReady en importeer al de opeenvolgende beelden samenstellen van een reeks als frames. </li><li> Resize originele foto's op 800 x 600 pixels. Verzamelde beelden zijn hoge resolutie, die grote bestanden die kan maken beeldverwerking langzaam genereert. </li><li> Blader door de beelden en zoek een plek (s) zichtbaar in de meeste afbeeldingen. </li><li> Zoom tot 300% op de geselecteerde plek (s). Uitlijning van beelden met behulp van een hogere vergroting zorgt voor een nauwkeuriger registratie. </li><li> Plaats een laag op de top van alle beelden en zorg ervoor dat is zichtbaar in alle frames. Markeer de plek (s) locatie met behulp van de "penseel" tool. </li><li> Beginnen met de aanpassing alle frames met de "move" tool en het nemen van de markeringen op de laag als een referentie. </li><li> Als voltooiing van de aanpassing is, verwijdert de laag gebruikt als een referentie en afbeeldingen opslaan als een enkele "psd" bestand. Ook export alle frames als een enkele "mov" bestand met de hoogste resolutie. Handmatige uitlijning van elk beeld series duurt ~ 10 minuten. </li></ol></li><li> Voer kwantificering van genexpressie met behulp van ImageJ. <ol><li> Open ImageJ software en open de "mov" bestand dat is opgeslagen eerder in ImageReady. </li><li> Met behulp van de te selecteren gereedschap, kies een 400 x 300 pixels gebied en de afbeelding bijsnijden. Dit nieuwe bestand moet worden opgeslagen als een "avi" bestand. </li><li> Scheiden de opeenvolgende beelden, gelegen in het nieuwe "avi" bestand in de rode, blauwe en groene kanalen door te klikken op "beeld", "kleur" en "RGB split" in ImageJ. </li><li> Trek de achtergrond fluorescentie van alle afbeeldingen in de groene en rode kanalen. Met behulp van het groene kanaal fotoserie, selecteert u een 20 x 20 pixels gebied van een regio met niet-expressie brengen en op te nemen de ligging in de "ROI Manager" tool, zodat het hetzelfde gebied worden geselecteerd in beide kanalen. Met de 20 x 20 pixels vierkant actief in de groene kanaal, ga naar de "plugins" commando in de taakbalk van ImageJ en klik vervolgens op de "trek gemeten ROI voor elk segment" plugin-tool. </li><li> In ImageJ, klik dan op "Image", "aanpassen" en dan "drempel" te definiëren of het segment van de GFP expressie pixels. Pas de drempel niveaus door het slepen van de bar in de drempel venster om een ​​gemiddelde puntgrootte van 20-30 pixels te verkrijgen. </li><li> Bepaal GFP expressie met behulp van een plugin die we ontworpen voor het meten van de gemiddelde grijswaarde per pixel en het totale aantal van GFP-expressie pixels. </li><li> Kopieer de gemiddelde uitvoer grijswaarden in ImageJ en plakken in Microsoft Office Excel. Bereken de GFP uitdrukking voor elk kanaal (rood en groen) door vermenigvuldiging van de gemiddelde grijswaarde per pixel door het totale aantal van GFP-expressie pixels voor elk kanaal. De som van meningsuiting waarden voor beide kanalen geeft de GFP expressie. Waarden kunnen worden gebruikt om de gen-expressie profielen te illustreren en maken directe vergelijkingen. Time-laps films kunnen ook worden gegenereerd met behulp van "mov" of "avi" bestanden, die een unieke en duidelijke visualisatie van het gen expressie profiel. </li></ol></li></ol> V. representatieve resultaten De robot afbeelding verzamelen en analyseren procedure (afb. 1) hier gerapporteerde maakt de aanschaf van een grote hoeveelheid kwantitatieve gegevens over genexpressie in een korte periode. Voor de plant promotor karakterisering het gebruik van de GFP-gen, deze methodiek is niet alleen nuttig om voorbijgaande expressie profielen aan te maken (afb. 2), maar ook om bij te houden in een gedetailleerde manier GFP-expressie in tijdelijk en stabiel getransformeerde plant weefsels 5,6. Korte time-lapse animatie gegenereerd met de verzamelde opeenvolgende beelden zijn een waardevol instrument voor diepgaande analyses van genexpressie na verloop van tijd in plantaardige weefsels. Deze methodologie heeft ook grote applicatie op factoren die rechtstreeks van invloed zijn genexpressie te evalueren. Zo heeft voorbijgaande GFP expressie onder de aanwezigheid van verschillende onderdrukkers van silencing van virale oorsprong met succes bestudeerd met behulp van onze geautomatiseerde imago verzamelen en analyseren van het systeem 7,8. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Beeldanalyse procedure bestaat uit vier stappen. (A) Overname van het beeld-serie met behulp van de robot afbeelding inzamelsysteem, (B) scheiding van beelden in de rode, blauwe en groene kanalen, (C) segmentatie van het uiten van pixels door het aanpassen van de drempelwaarden, en (D) het verkrijgen van de uitgang resultaten met de grijswaarden en het GFP-expressie richten tellen. <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Grafiek verschillende transiënte expressie profielen gedreven door plant promotors gefuseerd met GFP. De gegevens werden verzameld met behulp van onze robot imago opvangsysteem en geanalyseerd met ImageReady en ImageJ software.

<ol><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li>
<li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li>
<li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss+Org%22%5BJournal%5D)">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li>
<li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li>
<li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+two+highly+active+soybean+%28Glycine+max+%28L.%29+Merr.%29+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li>
<li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li>
<li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li>
</ol>

Het gebruik van robotica is een enorme toepassingen in verschillende aspecten van het menselijk leven, in het bijzonder robots werden effectief gebruikt om activiteiten uit te voeren in gevaarlijke omgevingen, tot vervelend en complexe activiteiten te automatiseren en uit te voeren taken in een meer nauwkeurige manier. In de moleculaire biologie, en specifiek genexpressie analyses, kunnen robots helpen track niet alleen functies van genen, maar ook weefsel groei en ontwikkeling in de tijd. Veel biologische verschijnselen optreden dynamisch, die mogelijk moeilijk te volgen met behulp van een tijdstip waarnemingen. Het gebruik van de GFP-gen voor expressie studies biedt extra voordelen voor het observeren van weefsel respons en groei. Voor onze experimentele procedures, GFP laat ons toe om genexpressie te volgen in hetzelfde stukje weefsel in de tijd als GFP-detectie is een niet-destructief. Bovendien is onze versie van het GFP-eiwit is voldoende stabiel om detectie, maar ook laat zien wat de omzet te minimaliseren accumulatie in plantenweefsels, zodat we zowel de opkomst en ondergang van genexpressie te volgen. We hebben al gebruik gemaakt onze robot imago verzamelen en analyseren van het systeem voor een breed scala aan toepassingen. Wij voorzien een hoog potentieel voor vele biologische toepassingen waar een dynamisch begrip van een fenomeen is gewenst. Zo kan bijvoorbeeld de groei en de ontwikkeling van plantaardige weefsels worden gevolgd met behulp van ons systeem geeft een waardevol inzicht / informatie over deze processen. Ook de dynamiek van eiwit vervoer met reportergenen zoals GFP, kan eenvoudig worden gevisualiseerd met behulp van time-lapse animaties. De methodologie in dit rapport beschreven is technisch ingewikkeld, maar conceptueel eenvoudig. Onze resultaten zijn robuust en nieuwe toepassingen worden voortdurend ontdekt.

<table><tbody><tr><td>ImageJ</td><td>Software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>&lt;een link naar=&quot;http://www.rsb.info.nih.gov/ij/&quot;&gt;http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

robotica en dynamic image analysis voor studies van genexpressie in plantenweefsels

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Genexpressie in plantenweefsels is meestal bestudeerd door destructieve extractie van verbindingen uit plantaardige weefsels voor<em&gt; In vitro</em&gt; Analyses. De methoden die hier gebruik maken van het groen fluorescerend eiwit (<em&gt; GFP</em&gt;) Gen voor continue monitoring van genexpressie in dezelfde stukken van weefsels, in de tijd. De<em&gt; GFP</em&gt; Gen werd geplaatst onder regelgevend toezicht van de verschillende promotors en geïntroduceerd in lima bonen cotyledonary weefsels via deeltjesbombardement. Zaadlobben werden vervolgens geplaatst op een robot foto collectie bestaat, welke van een fluorescentie dissectiemicroscoop bestond met een digitale camera en een 2-dimensionale robotica platform speciaal ontworpen om veilige bevestiging van de cultuur gerechten mogelijk te maken. Beelden werden verzameld uit cotyledonary weefsels elk uur 100 uur tot expressie profielen genereren voor elke promotor. Elke verzamelde serie van 100 beelden werd voor het eerst onderworpen aan een manuele beelduitlijning met behulp van ImageReady om er zeker van dat GFP-expressie foci consequent werden bewaard worden in geselecteerde terreinen van de analyse. Specifieke regio&#39;s van de serie meet 300 x 400 pixels, werden vervolgens geselecteerd voor verdere analyse om GFP Intensity metingen met behulp van ImageJ software aan te bieden. Batch beelden werden gescheiden in de rode, groene en blauwe kanalen en GFP-expressie gebieden werden geïdentificeerd met behulp van de drempel kenmerk van ImageJ. Na aftrek van de achtergrond fluorescentie (aftrekken van de grijswaarden van de niet-expressie pixels van elke pixel) in de respectieve rode en groene kanalen, werd GFP intensiteit berekend door vermenigvuldiging van de gemiddelde grijswaarde per pixel door het totale aantal van GFP-expressie pixels in elk kanaal, en vervolgens toe te voegen deze waarden voor zowel de rode en groene kanalen. GFP Intensity waarden werden verzameld voor alle 100 punten tijd tot expressie profielen opleveren. Variaties in GFP expressie profielen gevolg van verschillen in factoren als promotor sterkte, de aanwezigheid van een suppressor zwijgen, of de aard van de promotor. Naast de kwantificering van GFP intensiteit, waren de foto-serie ook gebruikt om time-lapse animaties met behulp van ImageReady te genereren. Time-lapse animatie is gebleken dat de duidelijke meerderheid van de cellen een relatief snelle stijging van de GFP expressie, gevolgd door een langzame afname weergegeven. Sommige cellen af ​​en toe verschijnt een plotseling verlies van fluorescentie, die gepaard kan gaan met een snelle celdood. Schijnbare transport van GFP over het membraan en celwand naar aangrenzende cellen werd ook waargenomen. Time lapse animaties verstrekte aanvullende informatie die anders niet kon worden verkregen met behulp van GFP Intensity profielen of enkel tijdstip beeldcollecties.

We brengen verslag uit een methode voor de introductie, tracking en kwantitatieve analyse van de GFP expressie in plantencellen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen robotica systeem voor semi-continue foto collectie van grote aantallen monsters, in de tijd. We tonen ook aan het gebruik van ImageJ en ImageReady voor de analyse van foto-serie.

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Genexpressie in plantenweefsels wordt doorgaans bestudeerd via destructieve extractie van verbindingen uit plantenweefsels voor in vitro-analyses. De methoden ...

In deze procedure wordt de dynamiek van genexpressie in plantenweefsels over tijd in beeld gebracht met behulp van robotica; eerst worden limobonen zaden gesteriliseerd en voor kieming tussen vochtige papieren handdoeken in een weefselkweekcontainer geplaatst. Na vier dagen worden de cotylodonen verwijderd en gebombardeerd met een DNA-construct bestaande uit een promotor gefuseerd aan GFP. De in Petri-schalen geplaatste cotylodonen worden gemonteerd op een op maat ontworpen tweedimensionaal robotisch systeem voor beeldverzameling. De robot is geprogrammeerd om elke uur gedurende 100 uur beelden van elk weefselstuk vast te leggen.Afbeeldingen worden onderworpen aan beeldanalyse, wat kwantitatieve gegevens oplevert over de intensiteit van de GFP-expressie in de loop van de tijd. Hallo, ik ben John Finer, directeur van het Plant Transformation Laboratory van de afdeling Horticulture and Crop Science aan de Ohio State University. Ik ben Carlos Herandez Garcia, PhD-student in het laboratorium van de Ohio State University.Vandaag zal Carlos het protocol laten zien dat we hebben ontwikkeld voor de analyse van genexpressie in plantenweefsels met behulp van het groen fluorescerende eiwit. We gebruiken deze in het laboratorium ontwikkelde procedure om de activiteit van de OD-stam te meten. Hiervoor hebben we de promoter stroomopwaarts van het GFP-gen geplaatst, dat fungeert als ons reportergen.Ik zal u laten zien hoe we promotercontrole introduceren in de stengelvaten van de liaupoon en hoe we een toepassing uitvoeren op ons op maat gemaakte robotische systeem voor beeldvastlegging. Ik zal afsluiten met een bespreking van ons protocol voor beeldanalyse. Laten we beginnen. Voor deze procedure worden liaupoonzaden oppervlakte-gesteriliseerd volgens standaardprocedures.Plaats de gesteriliseerde zaden in magenta GA zeven-containers tussen lagen vochtige papieren handdoeken en incubeer ze gedurende vier dagen bij 25 °C. Hier gebruiken we een expressievector met een hoog kopieaantal, die nuttig is voor analyses van promoters en promoterelementen. Deze vector bevat het GFP-gen, dat wordt gebruikt om de functie van de promoter of het promoterelement in getransformeerde weefsels te visualiseren, ongeveer één tot twee uur voor de bombardement.Snijd de CU-leidingen van de zaadhulzen van de tuinbon uit. CU-leidingen die geschikt zijn voor bombardement moeten geel tot lichtgroen zijn, plat zijn en direct na uitname vrij zijn van enige beschadiging die verdere beeldanalyse kan beïnvloeden; plaats 12 CU-leidingen in een Petrischaal met OMS-kweekmedium dat MS-zouten B, vijf vitaminen, 3% sucrose en 0,2% gelrate bevat bij een pH van 5,7. Precipiteer vervolgens het DNA-construct op M 10 wolfraamdeeltjes. Resuspendeer de deeltjes vlak voor gebruik eerst in steriel water tot een concentratie van 100 milligram per milliliter.Voeg vervolgens in een centrifugeerbuisje van 0,6 milliliter 25 µL partikels, 5 µL DNA met een concentratie van 1 µg/µL, 25 µL 2,5 M calciumchloride en 10 µL 100 mM spermine toe. Incubeer de DNA-preparatie vijf minuten op ijs, verwijder daarna 50 µL van de oplossing boven de partikels en gooi deze weg. Resuspendeer de met DNA gecoate partikels die onderin de buis zijn gebleven door middel van vortexen.Verwijder direct na het vortexen twee µL Eloqua. Herhaal deze vortexstap. Telkens wanneer Eloqua wordt verwijderd, moeten de gecoate deeltjes op ijs worden bewaard en binnen 15 minuten worden gebruikt.Nu het DNA op de deeltjes is gecoat, brengt u twee µL deeltjes aan via de bovenkant van een spuitfilter in het midden van een filterscherm. Plaats vervolgens de spuitfilter in de filterhouder binnen de particle inflow gun of PIG-kamer. Plaats een lima bean co leadin met de axiale zijde naar boven op een baffle, bestaande uit een scherm dat aan de bodem van een bekerglas is gesmolten.Plaats het schot, dat dient als platform om weefsels te ondersteunen tijdens het bombardement in de kamer van het partikelkanon. Om het weefsel te bombarderen, wordt eerst de klep naar het vacuüm geopend om de kamer te evacueren. Wanneer het vacuüm 760 millimeters kwik bereikt, wordt de magneetspoel geactiveerd en het helium vrijgegeven om de partikels voort te stuwen.De heliumdruk die wordt gebruikt om de deeltjes te versnellen, bedraagt 50 tot 60 PSI. Sluit na de bestraling de vacuümleidingkraan en laat het vacuüm ontsnappen via de afvoerkraan. Wanneer het vacuüm is opgeheven, open dan de kamerdeur om de bestraalde co leadin te verwijderen en plaats de co leadin terug aan de dal-zijde.Gebruik OMS-kweekmedium voor kwantificering en expressieprofilering. Bombardeer minimaal drie co-leden voor elk DNA-construct. Er is ook een positieve controle opgenomen, die een goed bestudeerd genexpressieprofiel geeft.De co-leads zijn nu klaar voor beeldvorming. Zet de kwiklamp aan en wacht 30 minuten tot de lamp is opgewarmd. Schakel de stroombronnen in voor de SPOT R-T-C-C-D camera en de motorcontroller, die de beweging aanstuurt van het op maat ontworpen robotplatform waarin acht platen zijn geplaatst.Stel de filterset voor GFP-detectie in door de GFP-twee filterset te selecteren bij 480 nanometer excitatie en 510 nanometer emissie op een MZ L drie dissectiemicroscoop. Steriliseer vervolgens de verdikte polycarbonaat petrischaaldeksels door ze te besproeien met 70% ethanol. De gespecialiseerde deksels die worden gebruikt om de bodem van de petrischaal af te dekken, voorkomen condensatie tijdens het vastleggen van beelden.Plaats de platen met de gebombardeerde cuan op het robotplatform en draai de zijdelingse stelschroef aan om ze op hun plaats te fixeren. Open nu de aangepaste softwareapplicatie die zowel het robotplatform als de beeldacquisitie aanstuurt. Schakel via de software ook de schakelaar voor de witte lichtcontroller in en oriënteer het platform naar de home-positie.Dit wordt uitgevoerd voordat de posities worden ingevoerd. Selecteer voor elke coddle-instelling in het motortabblad de eerste plaat. Het platform positioneert het midden van de Petrischaal onder het objectief van de microscoop.Positioneer de eerste CU LEADIN nauwkeurig voor beeldcollectie met behulp van de knoppen voor verplaatsingsafstand. Verplaats de cuddle leaden naar het juiste gezichtsveld via de live-modusfunctie. Gebruik voor de eerste cuddle leaden de handmatige knoppen op de dissectiemicroscoop om de focus in te stellen en zet de vergroting op 1.6 x. Zodra het interessegebied is bepaald, klikt u op de knop om deze positie toe te voegen.De software voegt de coördinaten van dit gebied toe aan een bestand met het positieschema en het platform keert terug naar de centrumposities van de plaat voor alle overige coens op de platen. Gebruik de knoppen voor de verplaatsingsafstand en de drie handmatige nivelleringsschroeven onder elke plaat op het robotplatform om de focus voor de overige coan op dezelfde plaat aan te passen. Zodra alle coördinaten van alle coan zijn ingevoerd, dient u de coördinaten van het positieschema op te slaan.Voer de parameters voor de beeldcollectie in, zoals het type licht (blauw voor GFP) en de belichtingsinstelling, en specificeer waar de beelden moeten worden opgeslagen, zoals beschreven in het bijbehorende geschreven protocol. Ga naar het tabblad voor de tijdregeling van de acquisitie en stel het tijdsinterval voor de beeldacquisitie en het totale aantal cycli van de beeldcollectie in. Beelden worden doorgaans elke uur gedurende 100 uur verzameld.Het genereren van goed gedefinieerde genexpressieprofielen. Start de beeldacquisitie door het tabblad met het positieschema te openen en vervolgens op de knop 'run schedule' te klikken. Isoleer het beeldcollectiesysteem van extern licht aan het einde van de 100 uur durende beeldcollectie.De beelden met hoge resolutie van ongeveer vijf megabyte per stuk zijn klaar voor beeldanalyse. Gebruik ImageReady om de 100 opeenvolgende beelden uit elke map samen te voegen. Importeer alle opeenvolgende beelden als frames en schaal ze naar 800 bij 600 pixels om de beeldbewerking te versnellen.Gebruik vervolgens markeringen op een nieuw geïntroduceerde laag, die in alle frames zichtbaar is en gebruikmaakt van geselecteerde GFP-spots in de referentieafbeelding. Lijn elke afbeelding handmatig uit; wanneer de uitlijning voltooid is, verwijdert u de laag die als referentie is gebruikt en slaat u het bestand op als één enkel PSD-bestand. Exporteer daarnaast alle frames als één enkel MOV-bestand met de hoogste resolutie.De bestanden zijn nu gereed om te beginnen met de GFP-kwantificering. Gebruik ImageJ om het MOV-bestand te openen en snijd een gebied van 400 bij 300 pixels uit. Scheid vervolgens de opeenvolgende beelden in rode, blauwe en groene kanalen met behulp van de RGB-splittool voor de rode en groene kanalen.Trek de achtergrondfluorescentie af met behulp van de 'subtract measured ROI for each slice' plugin-tool. Bereken de GFP-expressie door de drempelwaarden aan te passen en een plugin te gebruiken die is ontworpen om de gemiddelde grijswaarde per pixel en het totale aantal GFP-exprimerende pixels te meten. Kopieer de outputwaarden in ImageJ. Plak tot slot de outputwaarden voor de groene en rode kanalen in Microsoft Office.Excel voor verdere datamanipulatie om een beeld te geven van de resultaten van de beelduitlijning. Deze eerste animatie toont de onnauwkeurigheid van de herpositionering van het robotplatform tijdens het experiment van 100 uur. De beweging van de stip is een artefact als gevolg van het onvermogen van het robotplatform om na handmatige beelduitlijning op elk tijdstip naar exact dezelfde positie terug te keren; de GFP-expresserende cellen kunnen gemakkelijk worden waargenomen en de unieke kenmerken van dit trackingsysteem zijn eenvoudig te visualiseren.Terwijl deze animatie zich herhaalt, let op de omcirkelde GFP-expresserende cellen: de cel die in het rood is omcirkeld, vertoont een zeer snelle afname in expressie tussen 18 en 20 uur na bombardement, terwijl de cel die in het wit is omcirkeld, een vertraagde start van de GFP-expressie vertoont. Naast de animaties maakt deze procedure een snelle kwantificering van de GFP-expressie over tijd in het doelweefsel van de limoenboon mogelijk. Deze representatieve resultaten tonen de vergelijkende kwantificering van de promoterintensiteit met gebruik van de CAMV 35 S-promoter en vier verschillende sojapromoters.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe DNA kan worden geïntroduceerd in de cotyledonen van kiemplanten. De Lima-boonzaden worden geplaatst op de cotyledon, er worden beelden verzameld voor beeldanalyse en deze beelden worden vervolgens geanalyseerd. We gebruiken deze procedure routinematig in ons laboratorium voor het valideren van promoter-klonen in planten.Men kan een grote hoeveelheid gegevens genereren door de introductie van verschillende plantpromotoren. Deze procedure is echter complex en bevat vele stappen die mis kunnen gaan; bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met verse bonenzaden of in ieder geval kwaliteitszaden te gebruiken die correct zijn bewaard. Het is daarnaast belangrijk om het bombardeer-deksel snel uit te snijden en op de robot te plaatsen, en om het dikke petrischaaldeksel te gebruiken om condensatieproblemen te minimaliseren.En tot slot dient u erop te letten dat het GFP dat wij gebruiken een andere versie is genaamd SGFP, afkomstig van het Gen HIN Lab aan de Harvard University. Dit GFP is niet erg stabiel en is mogelijk geschikter voor het volgen van snelle veranderingen in genexpressie. Dat was alles, bedankt voor het kijken.En veel succes met uw experimenten.

robotics-dynamic-image-analysis-for-studies-gene-expression-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan ​​dat vergemakkelijkt de behandeling...

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten

Er wordt een methode gepresenteerd voor goedkope beeldvorming van planten om fenotypes te meten, samen met best practices voor het vastleggen van afbeeldingen en een pijplijn voor beeldanalyse voor het kwantificeren van planteigenschappen. Deze methoden werden toegepast om de fenotypes van maïs (Zea mays) te meten onder hitte, droogte en gecombineerde abiotische stressomstandigheden.

Beeldvorming en analyse voor het kwantificeren van maïs (Zea mays) abiotische stressfenotypes

Dit proces maakt gebruik van confocale microscopie in combinatie met een fluorescerend gelabelde kern- en chromatinemarkerlijn in Arabidopsis thaliana om gelijktijdig de kern- en chromatinedynamiek in Arabidopsis-wortels vast te leggen en veranderingen in deze dynamiek te onderzoeken als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen.

Kwantitatieve levende celbeeldvorming van kernvorm en chromatinedynamiek tijdens ontwikkeling en omgevingsstress bij Arabidopsis thaliana-wortel

Leer een methode voor het kwantitatief analyseren van GFP-expressie in plantencellen met behulp van een op maat gemaakt robotsysteem. Dit protocol maakt semi-continue beeldverzameling mogelijk gedurende 100 uur.

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Meer video's verkennen