Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Bij deze procedure wordt de dynamiek van genexpressie in plantweefsels in de loop van de tijd gevisualiseerd met behulp van robotica, eerst worden limabonenzaden gesteriliseerd en geplaatst tussen bevochtigde papieren handdoeken in een weefselkweekcontainer voor kieming. Na vier dagen worden de coan verwijderd en gebombardeerd met een DNA-construct dat een promotor bevat die gefuseerd is met GFP. Coan geplaatst in petrischalen worden gemonteerd op een tweedimensionaal op maat ontworpen robotica-beeldverzamelsysteem. De robot is geprogrammeerd om elk weefstukje elke uur gedurende 100 uur te fotograferen.

Beeldmateriaal wordt onderworpen aan beeldanalyse, waardoor kwantitatieve gegevens worden verkregen over de intensiteit van GFP-expressie in de loop van de tijd. Hoi, ik ben John Finer, de directeur van het Plant Transformation Laboratory in het Department of Horticulture and Crop Science aan de Ohio State University. Ik ben Carlos Herandez Garcia, PhD-student in het laatste laboratorium aan de Ohio State University.

Vandaag zal Carlos u het protocol laten zien dat we hebben ontwikkeld voor de analyse van genexpressie en plantweefsels met behulp van het groene fluorescente eiwit. We gebruiken deze procedure die we in het laboratorium hebben ontwikkeld voor het meten van de spanning van OD-activiteit. Om dit te doen, gebruiken we onze eerste kroon stroomopwaarts van het GFP-gen, dat onze reportergenen zijn.

Ik zal u laten zien hoe we de promotorcontrole in Lima vein Catal introduceren en een app op ons op maat ontworpen robotische beeldvastleggingssysteem verzenden. Ik zal afsluiten door ons protocol voor beeldanalyse door te nemen. Dus laten we beginnen. Om deze procedure te starten, steriliseert u limabonenzaden met standaardprocedures.

Plaats de gesteriliseerde zaden in magenta GA zeven containers tussen lagen vochtige papieren handdoeken en incubeer ze gedurende vier dagen bij 25 graden Celsius. Hier gebruiken we een expressievector met een hoog kopienummer, handig voor promotor- en promotorelementanalyses. Deze vector bevat het GFP-gen, dat wordt gebruikt om de functie van promotor of promotorelement in getransformeerde weefsels rond één tot twee uur vóór bombardement te visualiseren.

Snijd lima bonen CU leadin uit de zaadhuid. CU leadin die geschikt is voor bombardement moet geel tot lichtgroen zijn, plat en vrij van enige schade die de verdere beeldanalyse zou kunnen verstoren. Plaats onmiddellijk na de uitvoering 12 cu leadin in een petrischaal met OMS-kweekmedium dat MS-zouten B vijf vitamines, 3% sucrose en 0,2% gel bevat bij een pH van 5,7. Vervolgens wordt het DNA-construct geprecipiteerd op M 10 tungsteendeeltjes. Hersuspenseer eerst de deeltjes in steriel water voor gebruik tot een concentratie van 100 milligram per milliliter.

Voeg vervolgens in een fugebuis van 0,6 milliliter 25 microliter deeltjes toe, vijf microliter DNA bij één microgram per microliter, 25 microliter 2,5 mola calciumchloride en 10 microliter 100 milimolar spermaïne. Incubeer de DNA-voorbereiding op ijs gedurende vijf minuten, verwijder en gooi vervolgens 50 microliter van de oplossing bovenop de deeltjes weg. Hersuspenseer de DNA-gecoate deeltjes die aan de bodem van de buis blijven zitten door te vortexen.

En verwijder onmiddellijk na het vortexen twee microliter Eloqua. Herhaal deze vortexstap. Elke keer dat een Eloqua wordt verwijderd, moeten de gecoate deeltjes op ijs worden bewaard en binnen 15 minuten worden gebruikt.

Nu het DNA op de deeltjes is gecoat, plaatst u twee microliter deeltjes door de bovenkant van een spuitfilter in het midden van een filterscherm. Plaats vervolgens het spuitfilter in de filterhoudereenheid in de partijkinvoerpistool- of PIG-kamer. Plaats een lima bonen co leadin met de axiaalzijde omhoog op een afscherming die bestaat uit een scherm dat is gesmolten op de bodem van een beker.

Plaats de afscherming, die wordt gebruikt als een platform om weefsels tijdens bombardement in de partijkamer te ondersteunen. Om het weefsel te bombarderen, opent u eerst de klep die leidt naar het vacuüm om de kamer te evacueren. Wanneer het vacuüm 760 millimeter kwik bereikt, activeert u de solenoïde en laat u het helium vrij om de deeltjes te voortstuwen.

De heliumdruk die wordt gebruikt om deeltjes te versnellen is 50 tot 60 PSI. Na het bombardement met deeltjes sluit u de klep van de vacuümleiding en laat u het vacuüm vrij met behulp van de uitlaatklep. Wanneer het vacuüm is vrijgegeven, opent u de kamerdeur om het gebombardeerde co leadin op te halen en brengt u het co leadin terug naar de dalzijde.

Voor kwantificering en expressieprofilering op OMS-kweekmedium. Bombardeer minimaal drie co leadin voor elke DNA-construct. Een positieve controle, die een goed bestudeerd genexpressieprofiel oplevert, is ook inbegrepen.

De co leadin zijn nu klaar voor beeldvorming. Zet de kwiklamp aan en wacht 30 minuten tot de lamp is opgewarmd. Zet de voedingsbronnen aan voor de SPOT R-T-C-C-D-camera en de motorcontroller, die de beweging van het op maat ontworpen roboticaplatform aanstuurt, dat acht platen bevat.

Stel de filterset in voor GFP-detectie door de GFP twee-filterset te selecteren bij 480 nanometer excitatie en 510 nanometer emissie op een MZ L drie disserterende microscoop. Steriliseer vervolgens de verdikte polycarbonaat petrischaalluiden door ze met 70% ethanol te bespuiten. De gespecialiseerde luiken die worden gebruikt om de bodem van de petrischaal te bedekken, voorkomen condensatie tijdens beeldverzameling.

Plaats de platen met gebombardeerde cuan op het roboticaplatform en draai de zijschroef vast om ze op hun plaats te bevestigen. Open nu de aangepaste softwaretoepassing die zowel het roboticaplatform als de beeldacquisitie bestuurt. Open ook de software witlichtcontrollerschakelaar met behulp van de software, richt de platform naar de startpositie.

Dit wordt gedaan voordat u posities invoert. Voor elke coddle leadin in het motortabblad, selecteert u de eerste plaat. Het platform zal het centrum van de petrischaal onder het objectief van de microscoop positioneren.

Gebruik de