Name: Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-05T17:30:09.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Leer CD40-activatie en expansie van murine B-cellen uit splenocyten van C57BL/6 muizen. Deze methode genereert antigeen-presenterende cellen voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Clemens Wendtner voor het aanbieden van tmuCD40-Ligand-HeLa cellijn.

Het protocol voor het genereren van muizen CD40-geactiveerde B-cellen (mCD40B) van splenocyten is verdeeld in twee delen: deel A toont de bereiding van de muizen-CD40 ligand (CD40L) uitdrukken HeLa cellen (tmuCD40L HeLa), die zal worden gebruikt als plaat- gebonden feeder cellen. Deel B beschrijft de actuele muis CD40-B cultuur. A. Bereiding van feeder-cellen (tmuCD40L HeLa) De tmuCD40L HeLa is een aanhanger menselijke epitheel cellijn, die nooit zou moeten worden volledig confluent. De cellen zijn dan ook twee keer gesplitst per week. Het kweken van meer dan 6 weken wordt niet aanbevolen. <ol><li> Verwijder oude medium van de primaire cultuur met een steriele pipet en was cellen met 10 ml 1x PBS. Zuig het PBS na het wassen. </li><li> Voeg 4 ml 1x trypsine / EDTA in een 75 cm 2 fles gedurende 10-15 minuten bij 37 ° C. Gebruik zachte tikken om de cellen los te maken. </li><li> Voeg 10 ml van de wild-type medium en draai voorzichtig om de spijsvertering te stoppen met trypsine. </li><li> Breng de celsuspensie in een 50 ml buis met een steriele pipet en de spin de cellen neer op 265 xg gedurende 7 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 10 ml van wild type medium. Tel het aantal cellen van een aliquot van de celsuspensie en voor te bereiden drie 50 ml buizen met het juiste aantal cellen: <ol><li> 2,5 x 10 6 cellen voor subcultuur </li><li> 0,4 x 10 6 cellen / goed voor bestraling gebruikt voor de muis CD40-B-cel cultuur </li><li> rest te bevriezen (indien nodig). </li></ol></li><li> Spin de cellen neer op 265 xg gedurende 7 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant. <ol><li> Voor subcultuur: resuspendeer 2,5 x 10 6 cellen in 10 ml selectie medium in een 75 cm 2 celkweek kolf (celdichtheid 2,5 x 10 5 cellen / ml) en incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO 2. Splits de cellen twee keer per week. </li><li> Voor de muis CD40-B-cel cultuur: U moet 2,4 x 10 6 cellen voor een 6-wells plaat. Resuspendeer de tmuCD40L HeLa-cellen in wild type medium bij een dichtheid van 0,2 x 10 6 cellen / ml en bestralen ze op 78 Gy. Plaat 2 mL van de celsuspensie in elk putje en incubeer ze op 37 ° C met 5% CO 2. Gebruik deze voorbereid platen voor B-cel stimulatie bij tmuCD40L HeLa cellen aanhanger (minstens 4 uur: check hechting met behulp van de microscoop, wacht niet meer dan 24 uur tot B-cel stimulatie te starten). (Ga verder met B.) </li></ol></li></ol> B. muizen CD40-B-cel cultuur I. Voorbereiding van splenocyten voor CD40-stimulatie (dag 0): Let op: voordat u verder gaat vergewissen dat feeder cellen aanhanger zijn. Voeg altijd verse oplossingen van muriene interleukine-4, β-mercapto-ethanol en ciclosporine A aan het groeimedium onmiddellijk voor gebruik. <ol><li> Ontleden milt van C57BL / 6 muizen (haplotype H-2b) en tweemaal was het in 10-20 ml DMEM aangevuld met Gentamycine [15μg/mL] door de overdracht van het met een 10 ml pipet tip van een tube naar de andere. Voorkomen dat de overdracht van verontreinigingen (zoals haar) van de muis. Mince milt door het door een zeef cel (100 urn) en spoel filter met nog eens 10 ml medium. Spin down splenocyten op 265 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur, opnieuw in suspensie ze in 7ml muCD40-B-cel medium, en een aparte lymfocyten door Ficoll dichtheid centrifugeren. Om dit te doen laag cellen op 5 ml Mouse-Pancoll (voorverwarmd op kamertemperatuur) in een 15 ml buis en centrifugeer bij 450 xg gedurende 30 min zonder rem bij kamertemperatuur. </li><li> Teken het grootste deel van de bovenste laag, waardoor de lymfocyten laag ongestoord aan de interface. Overdracht lymfocyten laag op een verse 50 ml tube, een keer wassen met 30 ml DMEM met Gentamycine [15μg/mL] door te stoppen met draaien op 265 xg gedurende 7 minuten naar andere cellen te verwijderen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml mCD40-B wassen medium. Bepaal het aantal cellen in een hoeveelheid van de celsuspensie. Bepaal het aantal cellen door het tellen van een aliquot van de celsuspensie. </li><li> Spin down de benodigde hoeveelheid van de cellen op 265 xg gedurende 7 minuten. Voor een 6-wells plaat 5 x 10 6 cellen / putje nodig zijn, dus 30 x 10 6 cellen per plaat. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de lymfocyten bij 1,25 x 10 6 cellen / ml in mCD40-B kweekmedium vers aangevuld met een U / mL van interleukine-4 als groeifactor, 100 uM β-mercapto-ethanol en 0,63 ug / ml ciclosporine A om te voorkomen dat uitgroei van T-cellen (gegeven concentraties verwijzen naar een ml kweekmedium!). </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de 6-wells plaat pre-geïncubeerd met tmuCD40L HeLa-cellen. </li><li> Voorzichtig Voeg 4 ml van de lymfocyt suspensie (1.25 x 10 6 cellen / ml) aan elk putje van de 6-wells plaat. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C met 5% CO 2. </li> Op dag 3 reculture de cellen (Ga verder met II.1.). </ol> II. Subcultuur van mCD40B cellen (dag 3 en vervolgens twee keer per week): <ol><li> Oogst mCD40B cel cluster door krachtig en neer te pipetteren met een 10 ml pipet en het zwembad ze in een 50 ml buis. </li><li> Spin neer op 265 xg gedurende 7 minuten en volledig de supernatant te vervangen door mCD40-B wassen medium. Terwijl het tellen van de cel hoeveelheid van een hoeveelheid, draai de cellen neer op 265 xg gedurende 7 minuten. Resuspendeer mCD40B cellen in mCD40-B kweekmedium bij een concentratie van 0,75 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Voeg verse oplossingen van muriene interleukine-4 in een concentratie van 1 U / ml, 100 uM β-mercapto-ethanol en 0,63 ug / ml ciclosporine A aan het medium. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof uit een 6-wells plaat vooraf geïncubeerd met bestraalde tmuCD40L HeLa-cellen. </li><li> Voorzichtig Voeg 4 ml van de mCD40B celsuspensie (0,75 x 10 6 cellen / ml) aan elk putje van de 6-wells plaat. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Weer subcultuur van de cellen om de 3-4 dagen om te eindigen met een zeer zuivere murine CD40-geactiveerde B-cellen na een totaal van 14 dagen. </li></ol> C. Trouble-shooting: Wat gebeurt er als CD40-B-cellen niet groeien? <ol><li> Heb je gecontroleerd of CD40 ligand expressie van feeder-cellen? </li><li> Zijn de plaat-gebonden feeder cellen die worden gebruikt voor de stimulatie die ouder zijn dan 24 uur? </li><li> Is er een besmetting met mycoplasma? </li><li> Was de interleukine-4-oplossing voor de suppletie vers ontdooid en deed het over de juiste biologische activiteit? </li><li> Was β-mercapto-ethanol en ciclosporine A toegevoegd in de juiste concentratie? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1a.jpg" alt="Figuur 1 a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1 een"> Figuur 1a. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1b.jpg" alt="Figuur 1 b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1 b"> Figuur 1b. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig1d.jpg" alt="Figuur 1 d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1 d"> Figuur 1d. <img src="/files/ftp_upload/1734/1734fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100 (11), 2757-2765 (1997).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, e1464-e1464 (2008).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+using+retrovirally+transduced+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40-activated B cells.</a> J Immunol. 169 (4), 2164-2171 (2002).</li>
<li>Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+CD40-activated+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human CD40-activated B cells.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107 (7), 2786-2789 (2006).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63 (11), 2836-2843 (2003).</li>
<li>Ahmadi, T., Flies, A., Efebera, Y., Sherr, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Ligand-activated%2C+antigen-specific+B+cells+are+comparable+to+mature+dendritic+cells+in+presenting+protein+antigens+and+major+histocompatibility+complex+class+I-+and+class+II-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">CD40 Ligand-activated, antigen-specific B cells are comparable to mature dendritic cells in presenting protein antigens and major histocompatibility complex class I- and class II-binding peptides.</a> Immunology. 124 (1), 129-140 (2008).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. S. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99 (9), 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155 (2), 249-256 (2009).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25 (12), 659-664 (2004).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+are+associated+with+poor+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations are associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 107 (2), 742-751 (2006).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15 (13), 955-965 (2008).</li>
</ol>

De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale en Europese richtlijnen voor het houden van proefdieren. Verwijzing van de Duitse dierenwelzijnswet de dieren werden regelmatig gecontroleerd door de juiste instanties.

Wijzigingen van dit protocol zijn mogelijk, vooral wat betreft de oorsprong van CD40-stimulus en het type muizenstam gebruikt, ook in waardoor een efficiënte generatie muizen CD40-geactiveerde B-cellen. Ahmadi et al.. hebben gelijkwaardige resultaten getoond voor muizen fibroblasten getransfecteerd met murine CD40-ligand. In deze context presentatie van xeno-antigeen kan met zekerheid worden uitgesloten, maar intensieve studies met betrekking tot de veiligheid en toxiciteit in vivo gaf geen tekenen van ontsteki...

A. Bereiding van Media: <table border="1"><tbody><tr><td> Feeder cel wild-type medium </td><td> Feeder celselectie medium </td><td></td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td></td><td> RPMI 1640 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 300 ug / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 300 ug / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Hygromycine B </td><td> 0,2 mg / ml </td></tr></table><table border="1"><tbody><tr><td> mCD40-B wassen medium </td><td> mCD40-B kweekmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr></tr><tr><td> D-MEM </td><td> </td><td> D-MEM </td><td> </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 580 ug / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 580 ug / ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td><td> Glucose </td><td> 4,5 mg / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> MEM </td><td> 0,1 mm (1x) </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Diverse Reagentia: <table border="1"><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Volgnummer </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 21875 </td></tr><tr><td> D-MEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 41965 </td></tr><tr><td> Dulbeccos PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Geen kat H15-011 </td></tr><tr><td> Gencin </td><td> Delta Select </td><td> Art No 7395800 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> Geen kat DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES Buffer </td><td> PAA </td><td> Geen kat S11-001 </td></tr><tr><td> MEM NEAA </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 11140 </td></tr><tr><td> Hygromycine B </td><td> PAA </td><td> Geen kat P02-015 </td></tr><tr><td> Recombinant muizen Interleukine-4 </td><td> Immunotools </td><td> Geen kat 12340045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Geen kat NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> REF 15400-054 </td></tr></table> C. diverse benodigdheden: <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Volgnummer </td></tr><tr><td> Steriele pipet tips </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-well plaat </td><td> NUNC </td><td> Geen kat 140675 </td></tr><tr><td> 50ml conische buis </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Geen kat 352070 </td></tr><tr><td> Weefselkweek fles </td><td> Sarstedt </td><td> Geen kat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

muizenmodel van cd40-activatie van b-cellen

Murine Model of CD40-activation of B cells

Onderzoek naar de B-cellen heeft aangetoond dat CD40 activatie van hun antigeen presentatie vermogen verbetert. Wanneer gestimuleerd met interleukine-4 en CD40 ligand (CD40L), kunnen menselijke B-cellen worden uitgebreid zonder de moeilijkheden van kleine hoeveelheden van perifeer bloed binnen 14 dagen de tijd om zeer grote hoeveelheden van zeer zuivere CD40-B-cellen (&gt; 10<sup&gt; 9</sup&gt; Cellen per patiënt) van gezonde donoren en patiënten met kanker<sup&gt; 1-4</sup&gt;. CD40-B-cellen express belangrijk lymfeklier homing moleculen en kan aantrekken T-cellen<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Verder zijn ze efficiënt opnemen, verwerken en presenteren antigenen aan T-cellen<sup&gt; 6,7</sup&gt;. CD40-B-cellen werd aangetoond dat niet alleen de prime naïef, maar ook uit te breiden geheugen T-cellen<sup&gt; 8,9</sup&gt;. Daarom is CD40-geactiveerde B-cellen (CD40-B-cellen) zijn bestudeerd als een alternatieve bron van immuno-stimulerende antigen-presenterende cellen (APC) voor cel-gebaseerde immunotherapy1, 5,10. Om verdere onderzoeken of CD40-B-cellen effectief T-cel responsen te induceren in vivo en de onderliggende mechanisme dat we een celcultuur ingevoerde systeem voor het genereren van muizen CD40-geactiveerde B-cellen te bestuderen. Met behulp van splenocyten of gezuiverd B-cellen van C57BL / 6 muizen voor CD40-activering, werden optimale condities geïdentificeerd als volgt: Vanaf splenocyten van C57BL / 6 muizen (haplotype H-2b) lymfocyten worden gezuiverd door dichtheidsgradiënt centrifugatie en co-gekweekt met HeLa cellen die recombinant muizen CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)<sup&gt; 11</sup&gt;. Cellen worden recultured elke 3-4 dagen en de belangrijkste componenten zoals CD40L, interleukine-4,-mercaptoethanol en ciclosporine A worden aangevuld. In dit protocol hebben we laten zien hoe je volledig geactiveerd muis CD40-B-cellen (mCD40B) te verkrijgen met vergelijkbare APC-fenotype van de menselijke CD40-B-cellen (Fig 1a, b). CD40-stimulatie leidt tot een snelle uitgroei en uitbreiding van zeer zuiver (&gt; 90%) CD19 + B-cellen binnen 14 dagen na celkweek (afb. 1c, d). Om te voorkomen dat besmetting met niet-getransfecteerde cellen, expressie van de muizen-CD40-ligand op de transfectanten moet regelmatig worden gecontroleerd (afb. 2). Muizen CD40-geactiveerde B-cellen kunnen worden gebruikt voor het B-cel activatie en differentiatie, alsook onderzoek om hun potentieel te onderzoeken om te functioneren als APC in vitro en in vivo. Bovendien, zij vertegenwoordigen een veelbelovend instrument voor het vaststellen van de therapeutische of preventieve vaccinatie tegen tumoren en zal helpen om vragen met betrekking tot veiligheid en immunogeniciteit van deze aanpak te beantwoorden<sup&gt; 12</sup&gt;.

In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Onderzoek naar B-cellen heeft aangetoond dat CD40-activatie hun vermogen tot antigeenpresentatie verbetert. Wanneer ze worden gestimuleerd met interleukine-4 en CD40-ligand ...

Hoi, mijn naam is Tanya Wig en ik ben een PhD-student die werkt in het laboratorium voor tumorimmunologie en transplantatie-immunologie aan het Universitair Ziekenhuis van Keulen. Mijn onderzoek richt zich voornamelijk op humane CD 40-geactiveerde B-cellen en hun vermogen om immuunresponsen in vivo te induceren. Oorspronkelijk werden humane CD 40 B-cellen gegenereerd als alternatieve antigeenpresenterende cellen voor dendritische cellen.Deze cellen zijn bedoeld voor immunotherapeutische doeleinden. In klinische settings worden CD 40 B-cellen gegenereerd onder CD 40-signalering en stimulatie met IL-4. Volgens dit systeem kunnen ze gedurende meerdere weken worden uitgebreid. Na het optimaliseren van de generatie van menselijke CD 40 B-cellen uit PBMC in ons lab, hebben we dit principe succesvol overgebracht naar muizen en dat is wat ik u vandaag wil laten zien.Uitgaande van de milt genereren we mariene CD40-geactiveerde B-cellen binnen 14 dagen celkweek. De belangrijkste stappen zijn de preparatie van feeder-cellen; hiervoor gebruiken we een mariene CD40-ligand getransfecteerde feeder-cellijn, die adherent is, wordt bestraald met 78 gray en wordt uitgeplaat op zeswellplaten. Ten twee

murine-model-of-cd40-activation-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

In this video, we demonstrate the activation of bone marrow-derived macrophages in response to bacterial lipopolysaccharide and intravenous immunoglobulin.

Activation of Mouse Bone Marrow-Derived Macrophages in Response to Antibodies

Hier presenteren we een protocol om colonontsteking bij muizen te induceren door adoptieve overdracht van syngeneïsche CD4+CD45RBhigh T-cellen naar ontvangers zonder T- en B-cellen. Klinische en histopathologische kenmerken bootsen inflammatoire darmziekten bij mensen na. Deze methode maakt de studie van de initiatie van colonontsteking en de progressie van de ziekte mogelijk.

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

De overdracht van bm12-lymfocyten naar een C57BL/6-ontvanger is een gevestigd model van systemische lupus erythematosus. Hier beschrijven we hoe de ziekte kan worden geïnitieerd met behulp van dit model en hoe T-folliculaire helpercellen, germinale centrum B-cellen en plasmacellen kunnen worden gekenmerkt door middel van flowcytometrie.

De bm12 Induceerbare model van systemische lupus erythematosus (SLE) in C57BL / 6 muizen

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Hier presenteren we een protocol voor de in vivo bepaling van naïeve CD4 T cel (T-cel) activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door GM-CSF beenmerg (BM)-afgeleide dendritische cellen (DC's). Dit protocol beschrijft Daarnaast BM en T-cel isolatie, DC generatie en DC en T-cel adoptief overdracht.

Een muismodel In Vivo maatregel naïef CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door het beenmerg-afgeleide dendritische cellen

Het protocol Details een in vitro muriene carcinoom model van niet-genetische defecte transcriptie rek. Hier wordt chronische remming van CDK9 gebruikt voor het onderdrukken van productieve verlenging van RNA Pol II langs pro-inflammatoire respons genen om na te bootsen en bestuderen van de klinisch overgediend TEzeker fenomeen, aanwezig in ongeveer 20% van alle soorten kanker.

Een Muriene cellijn gebaseerd model van chronische CDK9 remming om wijdverbreide niet-genetische transcriptionele rek defecten te bestuderen (TEzeker) in kankers

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Leer CD40-activatie en expansie van murine B-cellen uit splenocyten van C57BL/6 muizen. Deze methode genereert antigeen-presenterende cellen voor immunologisch onderzoek.

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Meer video's verkennen