Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel I: Lignine
11 maart 2010
Plantaardige biomassa is een belangrijke koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof die gebruikt kunnen worden voor de productie van biobrandstoffen. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een structureel complex composietmateriaal genoemd lignocellulose. Hier beschrijven we een protocol voor een uitgebreide analyse van de inhoud en de samenstelling van de polyfenolische lignine.
Het bepalen van het ligninegehalte en de samenstelling van plantencellenwanden begint met gedroogd plantaardig materiaal, dat wordt onderworpen aan verschillende extracties. Het resulterende materiaal bestaat alleen uit celwanden en wordt vervolgens gesplitst om het ligninegehalte te bepalen. Het wandmateriaal wordt onderworpen aan hydrolyse door acetylbromide en de gesolubiliseerde mono als worden gekwantificeerd door UV-spectrometrie voor de bepaling van de ligninesamenstelling.
Wandmateriaal wordt gehydrolyseerd door cytolyse. De gesolubiliseerde ligninecomponenten worden vervolgens gederiveerd tot hun vluchtige trimethylsalinederivaten, die gescheiden en gekwantificeerd kunnen worden met behulp van gaschromatografie in combinatie met massaspectrometrie. De bepaling van de samenstelling van matrixpolysachariden en het cellulosegehalte wordt gedemonstreerd in een andere video getiteld Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part Two Carbohydrates.
Hallo, ik ben Marcus Pauley, hoofd van de Wall Analytical-faciliteit bij het Great Lakes Bioenergy Research Center hier aan de Michigan State University. Ik ben Cliff Foster, manager van de analytische celwandfaciliteit. We laten u de procedure zien om het gehalte en de samenstelling van plantaardige biomassamonsters te bepalen.
Planten zetten lichtenergie van de zon om in chemische energie zoals biomassa. Plantaardige biomassa bestaat voornamelijk uit celwanden, een complex netwerk van verschillende polymeren die alle plantencellen omringen. Hier bepalen we de samenstelling van plantencelwandmaterialen om het potentieel te beoordelen voor het omzetten van deze lignine Cellose X, die een zeer overvloedige hernieuwbare bron is, in biobrandstoffen.
Vandaag zullen we ons concentreren op de polyfenol lignine in een andere video getiteld Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part two carbohydrates. We zullen ons concentreren op de polysacharideanalyse. Om deze procedure te beginnen, voegt u drie 5,5 millimeter roestvrijstalen ballen toe aan een twee milliliter sared schroefdopbuis en ongeveer 60 tot 70 milligram lucht of vriesgedroogd plantaardig materiaal.
Het materiaal kan tot een fijn poeder worden gemalen met behulp van eyewall, een malende en doseerrobot. De eyewall neemt de buis en schudt deze gedurende 30 seconden, waarbij door de metalen ballen het materiaal tot een fijn poeder wordt gemalen, waarna het gemalen, maar compacte plantenpoeder wordt losgemaakt. Een alternatieve niet-robotische laagdoorvoerprocedure. Een retro-facilitair wordt gepresenteerd in deel twee, voeg 1,5 M van 70% aqueuze ethanol toe aan het gemalen materiaal, vortex grondig en centrifugeer bij kamertemperatuur.
Deze behandeling solubiliseert de meeste eiwitten en celorganellen, aspireer het supernatant en voeg een een-op-een volume-op-volume toe. Chloorform methanol oplossing tot het alcohol onoplosbare pellet, schud grondig om het pellet te respin en centrifugeer. Het chloorform methanol extraheert de hydrofobe verbindingen zoals lipiden na centrifugatie, aspireer het supernatant en resuspendeer het pellet en 500 microliter aceton.
Om het monster te drogen, verdampt u het oplosmiddel met een stroom lucht bij 35 graden Celsius tot het droog is, de gedroogde monsters kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard tot verdere verwerking. Om het verwijderen van zetmeel uit het monster te initiëren, hervat u het pellet en 1,5 mils van 0,1 molair natriumacetaat pH vijf, dop de buizen en verwarm ze in een verwarmingsblok om het zetmeel te gelatiniseren. Na het afkoelen van de suspensie op ijs, voegt u het zetmeel afbrekende enzymmengsel toe, dop de buis en vortex grondig, incubeer de suspensie een nacht lang.
In de shaker bij 37 graden Celsius zorgt een rotatieschakelaar voor een goede menging. Na de nachtelijke incubatie, beëindigt u de vertering door te verwarmen in een verwarmingsblok op 100 graden Celsius gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens en gooi het supernatant weg, dat een gesolubiliseerde zetmeel bevat.
Was het resterende pellet drie keer met 1,5 mils water elke keer door te vortexen, centrifugeren en decanteren zoals eerder is aangetoond. Ten slotte resuspendeert u het pellet in 500 microliter aceton en verdampt u het oplosmiddel met een stroom lucht bij 35 graden Celsius tot het droog is. De gedroogde monsters die geïsoleerde celwand of leg, geen celluloses bevatten, zijn klaar voor verdere analyse en kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard.
Begin met het wegen van één tot 1,5 milligram bereid celwandmateriaal. Het materiaal kan met de hand worden gewogen of op een geautomatiseerde manier met de oogwand, zoals in deel twee is aangetoond. Spoel de buiswanden met 250 microliter aceton om het celwandmateriaal op de bodem van de buis te verzamelen en verdampt u het aceton zeer voorzichtig onder luchtstroom.
Nadat het aceton is verdampt, voegt u voorzichtig 100 microliter vers gemaakt 25%volume op volume acetylbromide toe in ijsaftige azijnzuur langs de twee wanden. Om spatten te voorkomen, breekt een subtiel bromide het ligninepolymeer af in zijn geacetyleerde mono's. Vervolgens dekt u de volumetrische kolf af en verwarmt u gedurende twee uur op 50 graden Celsius.
Verwarm een extra uur met vier texting elke 15 minuten, en koel ten slotte af op ijs. Bij kamertemperatuur na het koelen van de kolf, voegt u 400 microliter twee molaire natriumhydroxide en 70 microliter vers bereide 0,5 molaire hydroxylaminehydrochloride toe, vortex de volumetrische flessen. Neutraliseer vervolgens de oplossing door de volumetrische fles exact tot de twee milliliter markering te vullen met ijsaftige azijnzuur, dop en draai vervolgens om om te mengen. Pipetteer 200 microliter van de oplossing die de gehydrolyseerde en gesolubiliseerde mono lals bevat in een UV-specifiek 96-wellsplaat en lees de plaat in een plaatlezer bij 280 nanometer. Lees de plaat ten minste drie keer en gemiddel de absorptie omdat deeltjes een lichte variatie in absorptiewaarden kunnen veroorzaken.
Bepaal het percentage van een subtiel bromide-oplosbaar lignine of A BSL met behulp van de juiste plantcoëfficiënt met de formule die in het geschreven protocol wordt gepresenteerd. Lignine is een polyfenolnetwerk dat voornamelijk bestaat uit drie subeenheden, P hydroxyfenol, gua ACell en spring roll-eenheden om de samens
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het analyseren van de inhoud en samenstelling van polyfenolisch lignine in plantbiomassa. Lignine is een complex polymeer dat voorkomt in plantencelwanden en een cruciale rol speelt bij de potentiële conversie van biomassa naar biobrandstoffen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Biomassa-analyse
- Productie van biobrandstoffen
Achtergrond
- Plantenbiomassa is een hernieuwbare bron voor de productie van biobrandstoffen.
- Lignocelluloses, die hoofdzakelijk uit lignine bestaan, zijn structureel complex.
- Inzicht in de samenstelling van lignine is essentieel voor het benutten van biomassa.
- Protocollen voor lignineanalyse kunnen bijdragen aan onderzoek naar biobrandstoffen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor de analyse van ligninegehalte en -samenstelling.
- Om de beoordeling van plantbiomassa voor toepassingen in biobrandstoffen te vergemakkelijken.
- Om het begrip van de rol van lignine in plantencelwanden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Extractie van lignine uit gedroogd plantmateriaal.
- Hydrolyse van wandmateriaal met behulp van acetylbromide.
- Kwantificering van gesolutiseerde ligninecomponenten via UV-spectrometrie.
- Gaschromatografie en massaspectrometrie voor lignineanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie en kwantificering van lignine uit plantmonsters.
- Gedetailleerde methodologie voor het isoleren van celwandcomponenten.
- Inzichten in de samenstelling van lignine-subunits.
- Vestiging van een betrouwbaar protocol voor toekomstige studies.
Conclusies
- Het protocol bepaalt effectief het ligninegehalte en de samenstelling.
- Inzicht in lignine is essentieel voor het optimaliseren van de productie van biobrandstoffen.
- Deze studie draagt bij aan het bredere veld van biomassaonderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige kwantificering van lignine en compositionele analyse zijn essentieel voor het evalueren van plantbiomassa als hernieuwbare grondstof in bio-gebaseerde industrieën. Deze methodologie ondersteunt de validatie van doelwitten door het mogelijk maken van mechanische risicoreductie van biomassaconversieprocessen via gedetailleerde subunit-profilering. De gegenereerde gegevens onderbouwen het voorspellende vertrouwen bij de identificatie van lead-compounds voor ontwikkelingspijplijnen van biobrandstoffen en biocomposieten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt analyse van de samenstelling van lignine-subunits (S-, G- en H-eenheden) mogelijk om structurele hypothesen over de recalcitrantie van biomassa te verduidelijken.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde workflows voor solubilisatie met acetylbromide en GC-MS voor reproduceerbare ligninekwantificering over verschillende monstersets.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de triage van biomassa door de ligninesamenstelling te koppelen aan de verwachte deconstructie-efficiëntie bij downstream-verwerking.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve gegevens over het ligninegehalte en de samenstelling, die essentieel zijn voor het standaardiseren van screeningscampagnes voor biomassa.
- Schaalbaarheid: Ontworpen voor analyses met een middel- tot hoge doorvoersnelheid, waardoor evaluatie van diverse plantensoorten en weefseltypen mogelijk is.
- Hergebruik van het platform: De resultaten dienen als input voor workflows voor koolhydraatanalyse (Deel II) voor een geïntegreerde lignocellulose-karakterisering.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Gegevens over de ligninesamenstelling verbinden de beoordeling van grondstoffen in de ontdekkingsfase met de optimalisatie van het preklinische proces.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van voorspellingen over de recalcitrantie van lignine.
- Afstemming van biomarkers: S/G/H-ratio's dienen als mechanistische biomarkers voor het voorspellen van de opbrengsten van enzymatische hydrolyse.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol voor lignine-analyse vindt plaats binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en levert compositionele gegevens die bijdragen aan de selectie van biomassa en de procesoptimalisatie voor de ontwikkeling van biobrandstoffen en bioproducten.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-toetsing over de rol van lignine bij de integriteit en recalcitrantie van de celwand via subunit-specifieke kwantificering.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve lignine-output die vergelijking tussen biomassagrondstoffen mogelijk maakt.
- Analytics: UV-spectrometrie en GC-MS leveren nauwkeurige metingen van het ligninegehalte en de S/G/H-unitverhoudingen voor vergelijkende analyses.
- Translational Research: Verbindt ligninesamenstelling met de voorspelde hydrolyse-efficiëntie, wat de selectie van grondstoffen voor procesontwikkeling bevordert.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar analytisch platform voor ligninekarakterisering dat toepasbaar is in meerdere biomassaprojecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in biomassa-recalcitrantie door de bijdragen van lignine-subeenheden te definiëren.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays door middel van gevalideerde stappen voor extractie, hydrolyse en derivatisering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door datagedreven selectie van grondstoffen mogelijk te maken en het aantal mislukte opschalingspogingen te verminderen.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van biomassabronnen op basis van ligninesamenstelling en voorspelde omzetbaarheid.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de preparatie van plantencelwanden en ligninechemie.
- Toegang tot UV-spectrometers, GC-MS-systemen en derivatiseringsreagentia (acetylbromide, BF3/ETSH) is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van de monstervoorbereiding (ontzetmeling, drogen) over verschillende teams heen voor de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen vereist validatie van de efficiëntie van de lignine-extractie voor variërende mate van recalcitrantie.
- Praktische beperkingen omvatten gevaren van oplosmiddelen (dioxaan, chloroform) en de noodzaak van het werken in een zuurkast tijdens de derivatisering.
