Name: De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Leer de squash-techniek voor het prepareren van Drosophila polyteencromosomen voor antilichaamlabeling. Deze methode omvat het kweken van larven, dissectie van speekselklieren en fixatie voor microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken mevrouw V. Lephart voor het onderhoud van de vlieg voorraden Dit werk werd ondersteund door National Institutes for Health-subsidie ​​(GM62916) en de National Science Foundation subsidie ​​(MCB0817107).

Het volgende protocol voor polytheen chromosoom squash voorbereiding is een bewerking van de procedure beschreven in Johansen et al.. (2009). 1. Cultuur van de derde instar Drosophila larven Met het oog op een optimale polytheen chromosomen voor hoge kwaliteit squash voorbereidingen te verkrijgen, uncrowded kweekomstandigheden zijn essentieel (dat wil zeggen, plaats rond 20 eierleggende vrouwtjes in een standaard 4 "fly fles en veranderen in een nieuwe fles per dag). Selecteer de dikste individuen van de eerste oogst van het klimmen 3e instar larven, terwijl ze nog steeds zwerven, maar vlak voor het verpoppen. We routinematig cultuur bij 21 ° C, maar 18 ° C zal opleveren dikker chromosomen die meer geschikt zijn voor bepaalde doeleinden, zoals bijvoorbeeld zijn wanneer band / interband regio's moeten worden gevisualiseerd met een hoge resolutie. 2. Polytheen squash materialen <ul><li> Drummond dissectie pincet (2) </li><li> Petrischalen (60 x 15 mm) </li><li> Frosted objectglaasjes (Fisher No 12-544-3) (poly-lysine-coated) </li><li> 22 x 22 mm nr. 15 dekglaasjes (Fisher nr. 12-520B) (gecoat met Sigmacote; Sigma # SL2) </li><li> 22 x 40 mm nr. 15 dekglaasjes (Fisher nr. 12-530B) </li><li> Kim-doekjes </li><li> Fase contrast microscoop met 20X doel </li><li> Kleine Dewar (bijv. thermoskan of thermos fles) </li><li> Lange pincet </li><li> Scheermesjes </li><li> Coplin Jar </li><li> Rubber-Maid of Tupperware lade (of gelijkwaardig afsluitbare lade) </li><li> Parafilm (gesneden in 22 mm vierkantjes) </li><li> 175 g gewichten </li></ul> 3. Fixeermiddelen en oplossingen <ol><li> 5x formaldehyde voorraad. Bereid een verse oplossing van 0,74 g paraformaldehyde in 4,0 ml van dH 2 O en met 28 ul van 1N KOH. Warm tot 65 ° C om de paraformaldehyde op te lossen en vervolgens op te slaan op ijs. </li><li> Fixeermiddel 1. Bereid een verse oplossing van 0,5 ml 10X PBS, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH 2 O en 1,0 ml van een 5x formaldehyde voorraad. Warm aan de Triton X-100 te verspreiden en binnen een uur te gebruiken. </li><li> Fixatief 2. Bereid een verse oplossing van 1,5 ml dH 2 O, 2,5 ml ijsazijn en 1,0 ml van een formaldehyde 5X voorraad en binnen 1 uur. </li><li> Lactoacetic zure oplossing. Bereid een oplossing van 1 ml melkzuur, 2 ml dH 2 O, en 3 ml azijnzuur. </li></ol> 4. Polytheen chromosoom squash voorbereiding: <ol><li> Spoel larven met water en over te dragen aan PBS in een weefselkweek schotel voor dissectie. </li><li> Pak het uiteinde van de mond haken met een pincet, houdt het lichaam ongeveer 2 / 3 van de weg naar beneden met het andere paar, en trek op de mond haken, zodat de speekselklieren worden blootgesteld. Scheiden de speekselklieren van de hersenen en in het oog antennale schijven, en ontleden weg het vet het lichaam en alle andere omliggende weefsels van de klieren. </li><li> Voeg 200 microliter van Fixatief 1 tot en met het eerste putje van een twee goed depressie slide en 200 tot 300 microliter van Fixatief 2 tot en met goed twee. Overdracht een paar speekselklieren op een tijd om Fixatief een in goed een en incubeer gedurende de hoeveelheid tijd die nodig is voor de doel-epitoop, meestal ongeveer 1-2 minuten. (Let op: sommige epitopen, zoals voor de meeste van de histon modificaties, kan 5 minuten of langer fixatie.) </li><li> Met behulp van een tang overdracht van de speekselklieren te Fixatief twee in goed twee en incubeer gedurende twee minuten. </li><li> Breng de klieren om 10 tot 30 ul van Lactoacetic zure oplossing op een schone Sigmacoted dekglaasje aan. Voorzichtig zakken een polylysine-coated microscoopglaasje op het dekglaasje en, zonder toepassing van verticale druk, pak het dekglaasje, zodat de klieren zijn tussen de glijbaan en het dekglaasje. Onmiddellijk cel lysis en chromosomale verspreiden vergemakkelijken door voorzichtig vast te pakken de dekglaasje met een tang op een rand en voorzichtig te bewegen een beetje heen en weer, proberen om elke verticale druk op het weefsel te minimaliseren. U kunt ook gebruik maken van de gum kant van een potlood of zelfs een vingertop om voorzichtig te verplaatsen van de dekglaasje heen en weer. Merk op dat elke vertraging bij het bewegen van de dekglaasje heen en weer zal waarschijnlijk afnemen verspreiding van de chromosomale armen zullen ze de neiging om meer rigide geworden na blootstelling aan de Lactoacetic zure oplossing. Vertroebeling van de oplossing is vaak een goede indicatie van de cel scheiding. Voorzichtig tikken op de dekglaasje schuin (de verticale druk te vermijden) met de gum kant van een potlood een paar keer kan ook helpen bij het chromosomale verspreiden. </li><li> Die onverwijld onderzoekt het weefsel onder een fase contrast microscoop met een 20 of 40X doel om te bepalen of de chromosomen zijn goed verspreid. </li><li> Wanneer de chromosomale spreiding voldoende is, de schuif naar beneden ingesteld met het dekglaasje kant op een stapel schone Kim-doekjes. Plaats een tweede Kim-wipe aan de bovenkant en plat chromosomen door het plaatsen van uw duim over waar het dekglaasje is geplaatst en stevig op te drukken, het vermijden van een horizontale beweging van het dekglaasje dat zou shearde chromosomen. </li><li> Onderzoek de schuif opnieuw onder de microscoop om te bepalen of het preparaat geschikt is voor het beoogde doel. Als chromosomen hebben een heel eind op kneuzingen, gebruik minder volume van Lactoacetic zure oplossing in uw verdere voorbereidingen. Herhaal de stappen 4.1-4.8 totdat een voldoende aantal geschikte dia's zijn verkregen. Plaats 175 g gewichten op het dekglaasje van de dia's. </li><li> Vul een klein Dewar (bijv. thermosfles fles) met vloeibare stikstof. Met behulp van een lange tang, dip glijden in vloeibare N 2 totdat het koken stopt, verwijder glijbaan, en onmiddellijk de rand van een schoon scheermesje gebruiken op de ene hoek naar flip-off van de dekglaasje aan. Als slide zal onmiddellijk worden gebruikt, in een Coplin pot met PBS bij 4 ° C. Anders verzamel de dia in een Coplin pot gevuld met 95% ethanol. Onderzoek de dekglaasje zodra de vorst is weg gesublimeerde om te bevestigen dat het weefsel gehandeld op grond van de dia en niet blijven bij de dekglaasje aan. Herhaal dit met de rest van de dia's totdat alle dia's worden opgeslagen in PBS (voor gebruik binnen enkele uren) of ethanol (voor langere termijn opslag). </li></ol> Representatieve resultaten De eerste kritieke stap voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit polytheen squash voorbereiding is om vet larven groeien met grote speekselklier kernen. De tweede is een goede techniek met de verspreiding procedure, die enige oefening kan nemen. Een tip voor een betere verspreiding van het succes is de minimale volume van de lactoacetic zure oplossing te vinden tijdens het pletten stap. Dit zal de voldoende spreiding van de chromosomen, zonder buitensporig hoge streaming krachten die weg kan wassen chromosoom armen. Het is ook vermeldenswaard dat elke vertraging bij het verplaatsen van het dekglaasje heen en weer zullen verminderen verspreiding van de chromosomale armen naarmate ze meer rigide bij blootstelling aan de Lactoacetic zure oplossing. Als alles goed gaat, moet er worden tal van goed verdeeld polytheen chromosomen. Figuur 1 toont een voorbeeld van een dergelijke voorbereiding, dubbele gelabeld met een marker voor interband regio's in het groen en met een kleurstof die vlekken de gestreepte regio's in het blauw. Als er onvoldoende spreiding wordt verkregen, zal de chromosomen zien eruit als kleine bolletjes, zoals weergegeven in figuur 2. Aan de andere kant, als er teveel verspreiden zich heeft voorgedaan, zal de chomosomes te dun en uitgebreid of in sommige gevallen versnipperd in kleine stukjes, zoals aangegeven in figuur 3. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Polytheen squash voorbereiding dubbel gelabeld met antilichaam tegen de JIL-een histon H3S10 kinase (in rood) en Hoechst (blauw). <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Polytheen squash met onvoldoende verspreiden. <img src="/files/ftp_upload/1748/1748fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Polytheen squash met te veel verspreiden.

<ol><li>Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-mediated+transcription+at+active+loci+does+not+require+histone+H3S10+phosphorylation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila.</a> Development. 135, 2917-2925 (2008).</li>
<li>DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+GFP-fusion+proteins+on+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Dros.+Inf.+Serv%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes.</a> Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).</li>
<li>Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+transcription+and+epigenetic+chromatin+modification+in+Drosophila+polytene+chromosome+squash+preparations+using+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies.</a> Methods. 48, 387-397 (2009).</li>
</ol>

De opname van azijnzuur en melkzuur in de conventionele squash fixatie-protocollen faciliteert zowel interband resolutie en chromosomale arm verspreiden, maar helaas sommige epitopen niet overleven deze behandeling. Een voorbeeld van een dergelijke epitoop is H3S10ph (Cai et al.., 2008). Omdat behandeling met zuur heeft ook het nadeel dat het de inherente fluorescentie van GFP-gemerkte eiwitten, Dimario et al. lest. (2006) recent ontwikkelde een formaldehyde-based &quot;zuurvrij squash techniek&quot; d...

de voorbereiding van drosophila polytheen chromosoom pompoenen voor antilichaam labeling

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila is al lang een favoriet modelsysteem voor het bestuderen van de relatie tussen de structuur van chromatine en genregulatie als gevolg van de cytologische voordelen die door de reus speekselklieren polytheen chromosomen van de derde instar larven. In dit weefsel worden de chromosomen ondergaan vele ronden van replicatie in de afwezigheid van celdeling die aanleiding geven tot ongeveer 1000 exemplaren. Het DNA blijft uitgelijnd na elke replicatieve cyclus resulteert in sterk vergroot chromosomen die een unieke kans om chromatine morfologie correleren met de lokalisatie van specifieke eiwitten te verstrekken. Bijgevolg is er een hoge mate van interesse in het definiëren van de epigenetische modificaties aanwezig op verschillende genen en in verschillende stadia van het transcriptie proces. Een belangrijk instrument voor een dergelijk onderzoek is de etikettering van polytheen chromosomen met antistoffen tegen het enzym, transcriptie factor, of histon-eiwitten van belang. Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium om Drosophila polytheen chromosomen voor te bereiden voor antilichaam labeling.

Deze video protocol illustreert de squash techniek die gebruikt wordt in de Johansen laboratorium voor te bereiden<em&gt; Drosophila</em&gt; Polytheen chromosomen voor antilichaam labeling.

De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling

Drosophila is al lange tijd een favoriet modelsysteem voor het bestuderen van de relatie tussen chromatinestructuur en genregulatie vanwege de cytologische ...

Deze procedure begint met het kweken van vette, kruipende drosophila derdelingslarven in een vliegenfles. Met behulp van twee pincetten worden de speekselklieren uit de larven gedissekeerd. De speekselklieren worden vervolgens gefixeerd in twee verschillende fixatievloeistoffen in een objectglas met twee putjes.Ten slotte worden de klieren in een lacto-azijnzuuroplossing platgedrukt tussen een dekglas en een microscoopglas. Hallo, ik ben dr. Kristen Johansen van de afdeling biochemie, biofysica en moleculaire biologie aan de Iowa State University. Hallo, ik ben een promovendus in het laboratorium van Johansen.Vandaag laten we u een procedure zien voor het maken van squash-preparaten van polytene chromosomen van drosophila die geschikt zijn voor antilichaamlabeling. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om epigenetische histonmodificaties en de relatie tot de chromatinestructuur en genexpressie te bestuderen. Laten we beginnen.Om optimale polytane chromosomen te verkrijgen voor hoogwaardige squash-preparaten, zijn ongehinderde kweekcondities essentieel. Plaats ongeveer 20 eieren Legendre vrouwelijke vliegen in een standaard vliegenfles van vier inch en ververs deze dageli

preparation-drosophila-polytene-chromosome-squashes-for-antibody

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor het uitvoeren van fluorescentie DNA in situ hybridisatie (DNA ISH) om repetitieve heterochromatische sequenties op op glaasjes gemonteerde chromosomen te visualiseren. De methode vereist minimale reagentia en is veelzijdig voor gebruik met korte of lange sondes, verschillende weefsels en detectie met fluorescentie of niet-fluorescentie gebaseerde signalen.

Eenvoudige methode voor fluorescentie DNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie aan Geplette Chromosomen

Dit protocol beschrijft hoe je een Drosophila S2-cellijn genereert die gevoelig is voor kleine molecuulremmers van kinesin-5. Het gebruik van deze cellen in een op cellen gebaseerde foutcorrectie-assay wordt ook geschetst.

Het genereren van een &quot;gehumaniseerde&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 cellijn Gevoelig voor farmacologische remming van Kinesin-5

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Het keldermembraan is essentieel voor weefsel- en orgaanmorfogenese tijdens de ontwikkeling. Om de mechanismen die leiden tot de juiste plaatsing van deze structuur beter te begrijpen, beschrijft het gepresenteerde protocol methoden om de intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten in epitheelcellen te visualiseren en te karakteriseren met behulp van confocale en superresolutiemicroscopie.

Confocale en superresolutie beeldvorming van gepolariseerde intracellulaire handel en secretie van keldermembraaneiwitten tijdens Drosophila Oogenesis

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

In deze studie stellen we een gedetailleerd protocol op voor op TurboID gebaseerde nabijheidslabeling (PL) in de eierstok van D. melanogaster , dat stappen omvat van biotinesuppletie en eierstokdissectie tot validatie van transgenexpressie en verrijking van gebiotinyleerde peptiden voor massaspectrometrie.

In vivo Toepassing van op TurboID gebaseerde nabijheidsetikettering in Drosophila melanogaster

Dit artikel beschrijft een efficiënt protocol voor beeldende schijfdissectie en antistofkleuring dat zuinig is met reagentia en het hanteren van imaginale schijven in kleine aantallen vergemakkelijkt.

Kleinschalige dissectie en antilichaamkleuring van oog-antenne en vleugelbeeldschijven van Drosophila melanogaster

Leer de squash-techniek voor het prepareren van Drosophila polyteencromosomen voor antilichaamlabeling. Deze methode omvat het kweken van larven, dissectie van speekselklieren en fixatie voor microscopie.

De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling

Meer video's verkennen