Christopher Hughes: Een in vitro model voor de Studie van angiogenese (Interview)

Hallo, mijn naam is Dr. Christopher Hughes. Ik ben professor aan de University of California Irvine, en mijn lab werkt aan angiogenese. En we zijn vooral geïnteresseerd in de genen die het proces van angiogenese reguleren.

We hebben een in vitro-assay geoptimaliseerd op basis van het werk van Nelson en, en in deze assay kunnen we alle verschillende processen bekijken die tijdens angiogenese plaatsvinden. We coaten tedex-kralen, kleine kralen met endotheelcellen. Dan bedden we deze in fibrinegels. We zorgen voor groeifactoren.

En in de loop van enkele dagen ontspruiten de endotheelcellen uit de kralen. Ze migreren, ze lijnen op, ze prolifereren, ze maken buisjes, ze vertakt en ze vormen anastomosen. Dus tegen ongeveer 10 dagen hebben we een compleet capillair-achtig netwerk in cultuur.

Welnu, sommige van de problemen met envivo en angiogenese-assays, bijvoorbeeld die welke in muizen worden gedaan, is dat het veel, het niet erg gemakkelijk is om het systeem te manipuleren. Het is moeilijk om te visualiseren wanneer je dit binnen een dier hebt, je kunt de angiogenese niet echt zien gebeuren. En als je het systeem in onze in vitro-culturen wilt manipuleren, is het heel gemakkelijk om de endotheelcellen genetisch te manipuleren, genen aan te zetten en uit te zetten, en de effecten daarvan op ontluikende angiogenese te bekijken.

En het is veel moeilijker om dat in het hele dier te doen. Je moet knockouts of knockins maken. Dus dat zijn de twee belangrijkste voordelen.

Het is gemakkelijk te manipuleren en het is gemakkelijk te visualiseren. Dus door de jaren heen zijn er een aantal verschillende in vitro-angiogenese-assays ontwikkeld en ze hebben allemaal hun voor- en nadelen. En een bekende is de matrixgel-assay waarbij endotheelcellen op deze extracellulaire matrix genaamd matrigel worden geplaatst.

En het probleem daar is dat de, de endotheelcellen koord-achtige structuren maken, maar ze maken nooit echt goede gealuminiseerde vaten. Je ziet geen ontluikende, je ziet geen anastomose. Er zijn collageengelmodellen, die goed kunnen zijn.

Er zijn er veel van. Je ziet geen proliferatie van de endotheelcellen. Je ziet meestal geen anastomose. De fibrinegel-assay die we hebben ontwikkeld is, is gebaseerd op een model van Nelson Kar gepubliceerd in het midden van de jaren negentig.

En we hebben dat nu dramatisch verbeterd, zodat we alle stadia van angiogenese kunnen zien. We kunnen de aanvankelijke ontluiking bekijken, de migratie. We zien proliferatie van cellen, we zien lumenvorming, we krijgen vertakt en we krijgen uiteindelijk anastomose om een compleet vaatnetwerk in vitro te vormen.

Dus deze assay is, we geloven dat dit de beste in vitro-systeem is als je al die verschillende stadia van angiogenese wilt bekijken. Een ander voordeel dat we hebben met deze in vitro-assay is dat we laser capture, microdissectie kunnen doen, we kunnen de cultuur plat draaien, en dan het laser capture microdissectie microscoop gebruiken. We kunnen eigenlijk individuele cellen eruit halen en we zijn vooral geïnteresseerd in de tip-cellen.

En dus snijden we die eruit en we kunnen de genregulatie bekijken, vooral in de tip-cellen versus de stamcellen, de cellen die eigenlijk het lumen maken. En onze hypothese is dat er differentiële genregulatie zal zijn tussen die twee populaties cellen. We kunnen dat bekijken, het zou vrijwel onmogelijk zijn om dat in een in vivo-systeem te doen.

Dus we denken dat dit nog een belangrijk voordeel is van het gebruik van deze in vitro-assay. Het vroege werk dat in dit, zoals ik zei door Nelson Recon, werd gedaan, gebruikten ze microvasculaire endotheelcellen. En er is veel gedacht dat microvasculaire endotheelcellen, de cellen die je zou willen gebruiken voor een assay als deze, want in vivo is het de microvasculaire EC die echt nieuwe vaten vormt.

We besloten om dit met ve te proberen. Dit zijn humane navelstrengveneuze endotheelcellen om een paar redenen. Een daarvan is dat deze cellen erg gemakkelijk te verkrijgen zijn.

Je kunt naar het ziekenhuis gaan, je kunt navelstrengjes krijgen van de verloskamers, en je kunt de cellen heel gemakkelijk isoleren. En ook deze cellen zijn al vele jaren in cultuur gebruikt. Ze zijn zeer goed gekarakteriseerd.

Dus we hebben deze assay opgezet en geoptimaliseerd zodat we deze cellen om die redenen konden gebruiken. En interessant genoeg blijken deze vex, deze grote vaatendotheelcellen, de vorm van microvasculaire endotheelcellen aan te nemen in cultuur. Ze verliezen veel genen die normaal gesproken door grote vaatec worden geëxprimeerd en ze beginnen genen te gaan uitdrukken die normaal gesproken worden geassocieerd met microvasculaire endotheelcellen.

En ze zijn volkomen in staat om capillairachtige ontluikingen te vormen, lumens te maken en te laten zien wat de wereld als echte capillairen in cultuur lijkt. Dus ze zijn gemakkelijk te gebruiken, ve zijn gemakkelijk te gebruiken, en ze doen wat we van ze willen. Ze ontluiken en ze maken goede gealuminiseerde vaten.

Wanneer we deze assay willen kwantificeren, zijn er echt een paar manieren waarop we kunnen gaan. We kunnen kijken naar echt kwantitatieve criteria zoals het aantal ontluikingen, de lengte van de ontluikingen, de diameter van de ontluikingen, het aantal vertakkingspunten, het aantal anastomosen, maar we kijken ook naar kwalitatieve criteria. En dus kunnen we kijken of ze lumens vormen?

En dat is waarschijnlijk echt waar we het meest in geïnteresseerd zijn. In veel van de assays die we doen, is de eigenlijke lumenvorming. En dat is echt meer een kwalitatieve beoordeling, hoewel naarmate de vaten groter worden, kan men eigenlijk de diameter van die lumens ook meten.

Dus we gebruiken fibroblasten in deze culturen. We bedden de kralen in het fibrinegel in en we platen fibroblasten bovenop het gel. De fibroblasten zijn absoluut essentieel voor een goede ontluiking en lumenvorming.

Bij afwezigheid van fibroblasten krijgen we wat ontluiking. Echter, de endotheelcellen blijven niet echt aan elkaar gehecht. Wat er gebeurt is, ze