Name: Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer een verbeterde methode voor RNA-isolatie uit Loblolly Pine (Pinus taeda) en andere naaldbomen. Deze techniek overwint problemen met fenolen en polysacchariden voor genomisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de volgende personen, zonder wiens hulp het verzamelen van dennen weefsels zou niet mogelijk zijn geweest bedanken: Dr Joe Nairn, Matt Bryman, Michael Bordeaux, Ujwal Bagal, Huizhe Jin, en Amanda Bouffier.

Deel 1: Boom Harvest Nadat de boom is geselecteerd en gekapt, is het belangrijk om te werken als zorgvuldig en zo snel mogelijk. Aangezien elke ander weefseltype wordt geoogst, moeten ze onmiddellijk worden geplaatst in hun eigen vloeibare stikstof vaartuigen om elke kruisbesmetting van het monster materiaal te voorkomen. Deze RNA-isolatie protocol is schaalbaar. <ol><li> Snijd bouten in lengten van ca. 0,5-0,75 m en met een kettingzaag de schors score in twee of drie plaatsen naar aanleiding van de lengte-as van de bout. </li><li> Met behulp van een houten beitel, het werk van de rand van de regio scoorde totdat de schors begint af te scheiden van het hout en het werken van de beitel terwijl u terug op het gedeelte van schors blijven totdat het volledig scheidt van de stam. </li><li> Secundaire xyleem is geoogst met een rechte rand, enkelzijdig scheermes door schrapen langs de lengte-as van de bout die is ontdaan van de bast. Draag latex handschoenen om besmetting van het weefsel te minimaliseren. </li><li> Floëem, die is gelegen aan de binnenzijde van de schors secties, is gemakkelijk geoogst door handmatig pellen. </li><li> Reactie hout is verzameld uit de onderkant van de ledematen na het markeren met verf op hun oorspronkelijke oriëntatie geven ten opzichte van de grond. </li><li> Ledematen zijn gesneden in bouten van 1-2 m en scoorde aan weerszijden langs de lengteas op basis van de geschatte locaties van de twee soorten reacties hout: tegenover hout (aan de bovenkant van de ledemaat) en de compressie hout (aan de onderkant kant van de ledematen). De schors is gescheiden van de ledemaat, zoals hierboven beschreven, behalve dat alleen de schors met betrekking tot elk type reactie hout wordt verwijderd in een keer. Secundaire xyleem of floëem wordt dan verzameld zoals hierboven beschreven en geplaatst in vloeibare stikstof. </li><li> Andere monsters, zoals naalden, schiet tips en jonge kegels, kunnen worden geoogst met de hand of met behulp van snoeischaren als nodig is. </li><li> Verzamelde monsters ingevroren in vloeibare stikstof moet worden geplaatst in gemarkeerd zakken of geschikte containers en verpakt in droog ijs voor verzending naar het laboratorium. </li></ol> Deel 2: Vriezer Mill verwerking van de monsters <ol><li> Vul de Spex 6850 vriezer molen reservoir met vloeibare stikstof en het milieu-effectenrapport bar in een van de schuren flacons en te vullen met vloeibare stikstof om pre-chill. Giet vloeibare stikstof en voeg het monster toe aan de injectieflacon. </li><li> Zorg dat er geen overtollige vloeibare stikstof blijft in de maalkamer en dat een teveel stikstof gas is volledig ontlucht voor het einde dop zit aan de kamer verzegelen. </li><li> Plaats de flacon malen in de transporteur en te sluiten. </li><li> Molen bosrijke monsters voor twee cycli van 1 minuut / cyclus bij een snelheid instelling van 14. </li><li> Gebruik een vloeibare stikstof gekoelde spatel om de gemalen monster (houtmeel) te verwijderen in een bekerglas dat is pre-gekoeld en bevat een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof. </li><li> Giet de vloeibare stikstof / monster slurrie in een opslagcontainer en plaats bij -80 ° C totdat het nodig is. </li></ol> Deel 3: RNA isolatie, Dag 1 <ol><li> Plaats 20 ml van RNA isolatie Buffer in een 50 ml Falcon buis bedekte en voeg 400 ul β-mercapto-ethanol, vortex kort en warmte in een 60 ° C waterbad. </li><li> Voeg 4 g van bevroren weefsel aan elke buis. Dop en schud krachtig met de hand, gevolgd door vortexen gedurende 10 seconden. </li><li> Voeg een gelijk volume van chloroform aan de buis en het omkeren voorzichtig om te mengen. Plaats de buis op een draaiend wiel en laat end-over-end mengen gedurende 5 minuten. </li><li> Giet het mengsel in een 50 mL Oak Ridge buis en centrifugeer op 12.000 (17.200 xg) tpm in een SS34 vaste-hoek rotor gedurende 5 minuten. </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuwe Oak Ridge buis en voeg een half-volume van de chloroform. </li><li> Vortex gedurende 1 minuut en verder mixen op een roterend wiel gedurende 5 minuten. Centrifugeer bij 12.000 tpm (17200 xg) in een vaste hoek rotor SS34 gedurende 5 minuten. </li><li> Breng de waterige fase in de frisse Oak Ridge buis en voeg een half-volume van de chloroform. Vortex gedurende 1 minuut. Centrifugeer bij 12.000 tpm (17200 xg) in een vaste hoek rotor SS34 gedurende 10 minuten. </li><li> Breng de waterige fase naar een 50 ml met hoge snelheid polypropyleen buis. Centrifugeer bij 10.000 tpm (11900 xg) in een vaste hoek rotor SS34 gedurende 20 minuten. </li><li> Giet supernatant in 50 ml Falcon buis en voeg een kwart-volume 10 M LiCl oplossing voor supernatant. Kort vortex en plaats bij 4 ° C voor overnachting neerslag. </li></ol> Deel 4: RNA isolatie, Dag 2 <ol><li> Warmte SSTE buffer in een 65 ° C waterbad voorafgaand aan het starten. </li><li> Giet de LiCl-neergeslagen monster in een polypropyleen buis en pellet het RNA door centrifugeren bij 11000 rpm in een SS34 vaste hoek rotor (14.450 xg) gedurende 30 minuten bij 4 ° C. </li><li> Na het centrifugeren,Giet af en gooi de vloeistof, en draai de buisjes op Kimwipes voor ongeveer 1 minuut. Pipetteer uit de resterende supernatant. </li><li> Resuspendeer elke pellet in 800 ui van verwarmde SSTE met een pipet om grondig te mengen van de monsters. Overdracht de geresuspendeerde monster 2 ml Ambion RNAse-vrij microcentrifuge buizen. </li><li> Warmte monsters bij 65 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door krachtige vortexen om volledige resuspensie te verzekeren. </li><li> Voeg een gelijk volume fenol-chloroform, pH8, aan elk monster buis. Vortex elk monster gedurende 30 seconden en dan draaien in een microfuge bij 14.000 rpm gedurende 3 minuten </li><li> Breng de waterige fase naar een nieuw 2 ml Ambion RNAse-vrij microfugebuizen buizen, en voeg een gelijk volume van chloroform. Vortex elk monster gedurende 30 seconden en spin in het microfuge bij 14.000 rpm gedurende 3 minuten. </li><li> Overdracht waterige fase naar fase-Lock Gel buizen die eerder zijn opgesteld door microfuging bij 11.000 rpm gedurende 2 minuten. Voeg een half-volume van chloroform en voorzichtig pipet te mengen. </li><li> Centrifugeer bij 11.000 rpm gedurende 5 minuten en breng de waterige fase in de frisse 2 ml Ambion RNAse-vrij microcentrifuge buizen. </li></ol> Deel 5: RNA Neerslag en Ethanol Wash <ol><li> Voeg 50 uL 3,0 M natriumacetaat, pH 4,8, en 1 ml 100% ethanol aan de waterfase. Vortex en neerslag in de -80 ° C gedurende 30 minuten of overnacht bij -20 ° C. </li><li> Microfuge monsters bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, en zorgvuldig aspireer uit het supernatans. Niet verstoren van de pellet. </li><li> Was de RNA-pellets met een mL -20 ° C 70% (v / v) ethanol. Microfuge bij 14.000 rpm gedurende 1 minuut en zuig af van de ethanol. </li><li> Herhaal stap 5.3. </li><li> Haal het beschermkapje van de buizen en drogen aan de lucht pellets op de bank voor 3-5 minuten. </li></ol> Deel 6: Final resuspensie en kwantificering <ol><li> Resuspendeer elke pellet in 100 ui DEPC-behandeld water. En door vortexen gemengd en incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 2 minuten voordat u op ijs. Herhaal indien nodig om te proeven resuspensie te verzekeren. </li><li> Pool zoals monsters, indien gewenst en maak 50 ul van een 1:10 verdunning in 10 mM Tris, pH 7,5, voor spectrofotometrische kwantificering. Absorptie ratio's voor 260/280 en 260/230 zijn meestal groter dan 2.1 en 2.2, respectievelijk. RNA-isolatie opbrengst varieert van 60-120μg / g bevroren weefsel. </li><li> Analyseren van monsters door het uitvoeren van 1.5-2.5 microgram RNA op een 1% agarosegel in TAE buffer. Voor meer kritische monsters, het analyseren van de RNA met behulp van een Agilent 2100 Bioanalyzer volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> Representatieve resultaten: RNA-isolatie opbrengsten van de verschillende weefsels conifeer range 60 tot 120 ng / g bevroren weefsel met houtachtige monsters typisch waardoor ongeveer 70-80g / g bevroren weefsel. Diagnostische verhoudingen van 260/280 en 260/230 zijn beide doorgaans hoger dan 2,1, en zijn goede indicatoren die de RNA-monster is vrij van elke significante fenol-of koolhydraten besmetting respectievelijk. Monsters geanalyseerd met behulp van agarose gelelektroforese gevolgd door EtBr kleuring moet blijken drie verschillende bands voor 25S, 18S en 5S RNA (figuur 1). Het bepalen van de stoichiometrie van de 28S aan 18S op agarose gels is enigszins subjectief, en factoren zoals hardlopen voorwaarden voor de gel, vlekken, en sample belasting kan hebben allemaal een effect hebben. In het algemeen, de 28S: 18S verhouding zal blijken te zijn&gt; 1,5. Echter, sommige coniferen monsters hebben een lagere ratio's. Bijvoorbeeld het volgen van Agilent 2100 analyse hebben we gezien een aantal voorbeelden van coniferen monsters uit verschillende weefseltypen, waar de stoichiometrie dichter bij 1,2:1. Zo, een schijnbaar geringe 28S: 18S doet stoichiometrie door agarosegelelektroforese niet noodzakelijkerwijs op een slechte kwaliteit monster. Leaf, schieten, en kegel monsters hebben vaak extra verschillende bands aanwezig zijn als gevolg van ribosomaal RNA's chloroplastic. EtBr-gekleurde materialen die niet migreren van het monster goed of hoog moleculair gewicht bands (&gt; 80 tot 10 kb) duiden er meestal op genomisch DNA contaminatie (figuur 2). Met een laag moleculair gewicht uitstrijkjes in de buurt van of onder de 5S band en een verminderde ribosomaal band vlekken of een schijnbare 18S&gt; 28S stoichiometric is een goede indicator dat RNA degradatie heeft plaatsgevonden (figuur 3). In de Agilent 2100 electropherogram analyse, de basis lijn moet een laag en relatief glad zijn met grote pieken die overeenkomen met 18S en 28S ribosomaal RNA's met 28S: 18S verhoudingen variërend overal 1,2 tot 2,0. De Agilent RNA Integrity Number (RIN) waarde kan een betere voorspeller van RNA kwaliteit zijn en moet minimaal 7 of hoger voor het RNA dat moet worden gebruikt voor de bereiding van microarray doelen. Figuur 4 toont een typische Agilent 2100 electropherogram voor xyleem RNA met een 28S: 18S-verhouding van 1,4 en een RIN waarde van 8,6, terwijl Figuur 5 toont een slechte xyleem RNA prep met een zeer hoge baseline en merkbare degradatie zoals blijkt uit de 28S: 18S ratio die gelijk is aan 0,65 en een RIN waarde van 3,4. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Agarose gel analyse van hoge-kwaliteit grenen RNA. Laan 1, NEB een kb standaard, Lane 2 toont een typische totaal RNA geïsoleerd van loblolly pine secundaire xyleem met karakteristieke ribosomale 28S, 18S en 5S bands en schijnbare 28S: 18S-ratio&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Agarose gel analyse van den RNA monster besmet met genomisch DNA. Laan 1, NEB een kb standaard, Lane 2, xyleem RNA-monster met genomisch DNA besmetting. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Agarose gel analyse van den monster met RNA-degradatie en besmetting met genomisch DNA. Laan 1, NEB een kb standaard, Lane2, xyleem RNA-monster met genomisch DNA vervuiling en ernstige RNA degradatie. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Agilent 2100 electropherogram van xyleem totaal RNA geïsoleerd met behulp van de beschreven methode loblolly pine xyleem. 28S: 18S-ratio is gelijk aan 1,4, RIN waarde is gelijk aan 8,6 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Agilent 2100 electropherogram van apicale tip totaal RNA die ernstige degradatie en genomische besmetting. 28S: 18S-ratio is gelijk aan 0,65, RIN waarde is gelijk aan 3,4

<ol><li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li>
<li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Siműes, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li>
</ol>

Het verkrijgen van hoge kwaliteit RNA uit naaldbomen, kan een moeilijke taak, gezien de hoge niveaus van fenol-en polysaccharide verbindingen aangetroffen in bosrijke weefsels. Te beginnen met het protocol ontwikkeld door Chang et al.. (1), hebben we ontdekt dat een strengere extractie en clean-up treden leiden naar de consistente isolatie van zeer hoge kwaliteit totaal RNA uit diverse houtige en niet-houtige weefsels bemonsterd uit een breed scala van naaldbomen. Deze video heeft aangetoond dat niet alleen onze gewijzi...

<table><tbody><tr><td>RNA-isolatiebuffer</td><td></td><td></td><td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammoniumbromide), 2% PVP (polyvinylpyrrolidon; Mw 30-40.000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0,5g/L Spermidine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-4</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15509-037</td><td></td></tr><tr><td>10M LiCl</td><td></td><td></td><td>Gemaakt met DEPC-behandeld water</td></tr><tr><td>SSTE-buffer</td><td></td><td></td><td>1M NaCl, 0,5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td></tr><tr><td>Natriumacetaat (NaOAc) 3M pH4.8</td><td></td><td></td><td>Gemaakt met DEPC-behandeld water</td></tr><tr><td>Fenol-chloroform (pH8.0)</td><td></td><td></td><td>120mL fenol, 160mL chloroform getitreerd met meerdere wisselingen van 0,5M Tris-Cl pH 8.0</td></tr><tr><td>Oak Ridge High Speed Teflon-buizen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-16B</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen 50mL High Speed-buizen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#05-562-10K</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon, steriele, afgedekte 50mL conische wegwerpbuizen</td><td>VWR international</td><td>#21008-939</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>#2302830</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNase-vrije microcentrifugebuizen, 2mL</td><td>Ambion</td><td>#AM12425</td><td></td></tr></tbody></table>

een verbeterde methode van rna isolatie uit loblolly pine ( p. taeda l.) en andere naaldbomen

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Weefsels geïsoleerd van naaldbomen, in het bijzonder die welke behoren tot de Pinaceae familie, zoals loblolly den (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), bevatten hoge concentraties van fenolische verbindingen en polysacchariden die interfereren met RNA-zuivering. Isolatie van hoge kwaliteit RNA van deze soorten vergt rigoureuze weefsel verzameling procedures op het gebied en de inzet van een RNA-isolatie protocol bestaat uit meerdere organische extractie stappen om RNA van voldoende kwaliteit te isoleren voor microarray en andere genomische analyses. De isolatie van hoge kwaliteit RNA uit het veld verzameld loblolly pine monsters kan lastig zijn, maar een aantal aanpassingen aan standaard-weefsel en RNA-isolatie procedures sterk verbeteren resultaten. De omvang van het algemeen RNA degradatie verhoogt, indien monsters die niet goed zijn verzameld en vervoerd van het veld, met name tijdens grootschalige oogsten. Totaal RNA opbrengst kan aanzienlijk worden verhoogd door verpulveren monsters in een vloeibare stikstof vriezer molen voorafgaand aan de isolatie RNA, vooral wanneer monsters komen uit houtachtige weefsels. Dit is vooral te danken aan de aanwezigheid van oxiderende stoffen, zoals fenolische verbindingen, en polysacchariden die zowel aanwezig zijn op een hoog niveau in uittreksels uit de houtachtige weefsels van de meeste naaldbomen. Indien niet verwijderd, kan deze verontreinigingen overdracht leidt tot problemen, zoals RNA degradatie, die resulteren in lage opbrengsten en een slechte kwaliteit RNA monster. Overdracht van fenolische verbindingen, evenals polysacchariden, kan ook verminderen of zelfs volledig te elimineren de werking van reverse transcriptase of andere polymerasen gebruikt voor cDNA synthese. In het bijzonder RNA bestemd om te worden gebruikt als sjabloon voor double-stranded cDNA synthese in het genereren van cDNA-bibliotheken, enkelstrengs cDNA synthese voor PCR of qPCR, of voor de synthese van microarray doel materialen moeten van de hoogste kwaliteit als onderzoekers verwachten beste resultaten te verkrijgen. RNA-isolatie technieken die gewoonlijk gebruikt voor vele andere plantensoorten zijn vaak onvoldoende in hun vermogen om deze verontreinigingen te verwijderen van de coniferen monsters en dus geen opbrengst totaal RNA monsters geschikt zijn voor downstream-manipulaties. In deze video tonen we methoden voor het gebied collectie coniferen weefsels, te beginnen met het kappen van een veertig jaar oude boom, op het verzamelen van floëem, secundaire xyleem, en reactie hout xyleem. We tonen ook aan een RNA-isolatie protocol dat consequent heeft opgeleverd van hoge kwaliteit RNA voor latere enzymatische manipulaties.

Veel planten-weefsels, waaronder floëem en xyleem van loblolly den (<em&gt; Pinus taeda</em&gt; L.), bevatten een hoog niveau van fenolen en polysacchariden die interfereren met RNA-zuivering. Deze presentatie behandelt technieken voor de oogst van het veld geteelde weefsels en isolatie van RNA van voldoende kwaliteit zijn voor microarrays en andere genomische analyses.

Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen

Weefsels geïsoleerd uit coniferensoorten, in het bijzonder die behorend tot de Pinaceae-familie, zoals de loblollyden (Pinus taeda L.), bevatten hoge ...

Het volgende is geproduceerd door onderzoekers van de University of Georgia en de Warnell School of Forestry and Natural Resources. Deze demonstratievideo beschrijft het oogsten van xylem- en floëemweefsel en de daaropvolgende RNA-isolatie uit Pinus Teta, algemeen bekend als de loblollyden, wat de belangrijkste coniferensoort is voor de productie van bosproducten in de Verenigde Staten. Zodra de boom is geveld, in dit geval een 40-jarige boom, wordt de hoofdstam in stukken gezaagd van ongeveer 50 centimeter lengte.De stamsectie wordt vervolgens op verschillende plaatsen in de lengte ingekerfd met de kettingzaag om het verwijderen van de schors te vergemakkelijken. Met behulp van een hamer en een houtbeitel wordt de schors opgetild totdat deze in secties kan worden afgepeld. Vervolgens wordt het vloeistofgeleidende weefsel handmatig verwijderd, van de binnenkant van de schorssecties gestript en onmiddellijk in vloeibare stikstof ondergedompeld.Zodra de schors is verwijderd, kan de dunne laag secundair xyleem worden verzameld door het oppervlak van de bout af te schrapen met een enkelzijdig scheermesje. Het waterige xyleemweefsel wordt onmiddellijk in vloeibare stikstof geplaatst. Tijdens deze oogst hebben we ook monsters van reactiehout verzameld, gewoonlijk aangeduid als compressie- en tegenhout, voordat de takken van de hoofdstam werden gesneden.De oriëntatie van de tak wordt eerst gemarkeerd met spuitspray, zodat de gebieden die de twee weefseltypen bevatten — tegenhout aan de bovenzijde van de tak en compressiehout aan de onderzijde — kunnen worden bepaald. Tijdens het verwijderen van de schors worden de takken eerst met een kettingzaag ingekerfd langs lijnen die het compressiehout van het tegenhout scheiden, waarna de schorsverwijdering wordt uitgevoerd zoals bij de bouten van de hoofdstam, met uitzondering van het feit dat alleen de schors in de regio die overeenkomt met het type reactie wordt verwijderd.Het geoogste hout wordt op elk gewenst moment verwijderd. Het is doorgaans moeilijker om grote bastsecties van deze kleinere takken te verwijderen. Monsters van reactiehout uit het secundaire xyleem worden op dezelfde wijze verzameld als bij normaal secundaire xyleem, door af te schrapen met het scheermesje en onmiddellijk onder te dompelen in vloeibare stikstof.Let op de roodbruine kleur die kenmerkend is voor compressiehout. Het is vermeldenswaard dat het verzamelen en verwerken van meerdere monsters van een grote boom veel mankracht vereist, waarbij elke betrokken persoon een aangewezen taak uitvoert zodat alle weefseltypen gelijktijdig worden verzameld om RNA-degradatie te beperken; monsters die in vloeibare stikstof zijn ingevroren, worden vervolgens overgebracht naar gelabelde opbergzakken en op droogijs geplaatst voor transport terug naar het laboratorium. Onze eerste stap is het vermalen van het weefsel met een Specs Model 68-50 freezer mill; vergeleken met malen met een vijzel en stamper verhoogt deze stap de opbrengst van de RNA-extractie voor houtweefselmonsters aanzienlijk, terwijl de monsters koud worden gehouden met vloeibare stikstof.Het weefsel wordt eerst met de hand in kleinere stukken gebroken en in de monsterkamer geplaatst. De kamer wordt in de houder geplaatst en vastgezet, waarna het monster gedurende twee minuten wordt gemalen. Het eindproduct heeft de consistentie van een grof poeder.Het RNA-extractieprotocol is een proces van twee dagen. Op de eerste dag worden 2,5 gram bevroren weefsel toegevoegd aan RNA-extractiebuffer die is verwarmd tot 65 °C. Het monster wordt krachtig geschud om te mengen, waarna een gelijk volume chloroform wordt toegevoegd en het monster opnieuw wordt gemengd door voorzichtig te keren.Vervolgens wordt het monster vijf minuten op een draaiwiel geplaatst. Het monster wordt daarna overgebracht naar Teflon Oakridge-buisjes voor hoge snelheden en gecentrifugeerd in een SS 34-rotor bij 12.000 RPM gedurende vijf minuten. De bovenste waterige fractie wordt in een nieuw buisje geëxtraheerd en er wordt een half volume chloroform aan toegevoegd.Het monster wordt één minuut gevortext en vervolgens opnieuw vijf minuten op het rotatiewiel geplaatst. Na een tweede centrifugatie wordt de waterige fractie opnieuw overgebracht naar een 50 ml polypropylene buis voor hoge snelheden en gecentrifugeerd bij 10.000 RPM gedurende 20 minuten. Om eventuele resterende partikels te verwijderen, wordt het monster overgegoten in een 50 ml Falcon-buis en wordt een kwart volume van 10 M lithiumchloride aan het monster toegevoegd.Het monster wordt door schudden gemengd en gedurende de nacht bewaard bij 4 °C. Op de tweede dag wordt het met lithiumchloride geprecipiteerde monster eerst gecentrifugeerd bij 11.000 RPM gedurende 30 minuten bij 4 °C.Het supernatant wordt afgegoten en weggegooid, waarna de buisjes gedurende één minuut ondersteboven op chemische doekjes worden geplaatst. Om eventueel overtollig vloeistof te verwijderen, wordt het RNA-pellet, dat zichtbaar zou moeten zijn, resuspendeerd in 800 µL warme SSTE-buffer die is voorverwarmd tot 65 °C. Zorg ervoor dat er meerdere keren op en neer wordt gepipetteerd en rondom de randen van het pellet om te garanderen dat alles volledig in oplossing komt.Breng vervolgens het geresuspendeerde RNA over naar een RNA-vrije microcentrifugebuis van Two Mil and Beyond. Verhit het monster gedurende één tot twee minuten in een waterbad van 65 °C, gevolgd door vortexen om te garanderen dat het monster volledig is geresuspendeerd. Dit kan indien nodig worden herhaald.Voeg nu een gelijk volume gebufferde fenol-chloroform toe. Vortex het monster gedurende 15 tot 20 seconden en centrifugeer in een microcentrifuge bij 14.000 RPM gedurende drie minuten. De waterige fractie wordt overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis en er wordt een gelijk volume toegevoegd.Het monster wordt gevortexd en gecentrifugeerd zoals bij de vorige extractie. Voor de uiteindelijke organische extractiefase worden de Lock-gelbuizen eerst gecentrifugeerd op 11.000 RPM gedurende twee minuten.Vervolgens wordt het RNA-monster uit de vorige extractie toegevoegd aan de phase lock-gel, gevolgd door een half volume chloroform, waarna beide componenten voorzichtig door pipetteren worden gemengd. Het monster wordt daarna vijf minuten gecentrifugeerd op 11.000 RPM, en het waterige RNA-monster wordt overgebracht naar een nieuwe Ambion RNA-vrije microcentrifugebuis. De volgende stap is een eenvoudige RNA-precipitatie van het monster met een tiende volume 3 M natriumacetaat pH 4,8 en twee volumes 100% ethanol.De sample wordt gevortext, kortstondig gedurende 30 minuten in een vriezer van -80 °C geplaatst en vervolgens 30 minuten gecentrifugeerd in een microcentrifuge bij 4 °C. Het supernatant wordt voorzichtig weggezogen en het kleine witte pellet wordt gewassen met 1 mL ijskoude 70% ethanol; na het wegzuigen wordt de ethanolwas herhaald. Resterende ethanol wordt aan de lucht gelaten door de buisjes vijf minuten open op de bench te laten staan.RNA-pellets worden resuspendeerd in 100 µL DEPC-water en opnieuw opgelost door vortexen en verhitting bij 65 °C. Indien nodig kan dit worden herhaald. De monsterconcentratie wordt bepaald.De ratio's 262/80 en 262/30 worden spectrophotometrisch berekend om de mate van protein- en koolhydraatcontaminatie in het monster te schatten. 1% AGROS-gelelektroforese wordt gebruikt om de monsterkwaliteit, genomische DNA-contaminatie en RNA-degradatie kwalitatief te schatten. De integriteit van kritische monsters wordt verder geëvalueerd met een Agilent 2100 bioanalyzer om de ribosomale 28S/18S-ratio's en een RNA-integriteitsgetal te bepalen. Bedankt voor het bekijken van onze video over het oogsten van weefselmonsters en de isolatie van totaal RNA uit LOB (lollypine).De volgende personen zijn verantwoordelijk voor de opname en productie van deze trainingsvideo.

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het cDNA microarray PtGen2 is ontwikkeld voor genexpressie studies in loblolly...

Het verwerken van de Loblolly Pine PtGen2 cDNA microarray

Niet-radioactieve In situ Hybridisatie Protocol Toepasbaar voor Noorwegen Spruce en een bereik van plantensoorten

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

We zijn erin geslaagd een methode te ontwikkelen voor RNA-isolatie uit plantenzaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen bevatten, die remmende effecten hebben op RNA-isolatie met hoge zuiverheid. Onze methode is geschikt voor het monitoren van de expressie van genen met transcripten op laag niveau in zaden.

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Hier presenteren we een protocol voor het traceren van genomic DNA (gDNA) verontreiniging in RNA monsters. De onderhavige methode maakt gebruik van primers specifiek voor de interne getranscribeerde spacer regio (ITS) van ribosomal DNA (rDNA) genen. De methode is geschikt voor betrouwbare en gevoelige detectie van DNA besmetting in meeste prokaryoten en de eukaryoten.

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

Dit protocol biedt een overzicht van de procedures voor de isolatie van RNA voor de profilering van de transcriptomic van de lymfeklier weefsels van grote dieren, met inbegrip van de stappen in de identificatie en de besnijdenis van lymfeklieren van vee en wilde dieren, bemonstering benaderingen te leveren consistentie in meerdere dieren, en overwegingen plus representatieve resultaten voor de post collectie bewaring en verwerking ten behoeve van RNA analyse.

Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

Hier presenteren we een Bioinformatic aanpak en analyses om lijn-1 expressie te identificeren op de Locus specifieke niveau.

De volgende-generatie van RNA het rangschikken en een bioinformatica pijpleiding om uitgedrukte lijn-1S op het Locus-specific niveau te identificeren

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Dit protocol is bedoeld om celtypespecifiek te isoleren, ribosomale mRNA's te vertalen met behulp van het NuTRAP-muismodel.

Isoleer celtypespecifieke RNA's uit snap-frozen heterogene weefselmonsters zonder celsortering

We beschrijven een eenvoudige maar zeer reproduceerbare methode om extracellulair RNA te isoleren van het bladoppervlak en de apoplast van Arabidopsis-planten.

Een stapsgewijze handleiding voor de isolatie en analyse van bladoppervlak en apoplastisch RNA met behulp van Arabidopsis-rozetten

Leer een verbeterde methode voor RNA-isolatie uit Loblolly Pine (Pinus taeda) en andere naaldbomen. Deze techniek overwint problemen met fenolen en polysacchariden voor genomisch onderzoek.

Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen

Meer video's verkennen