Een verbeterde methode van RNA isolatie uit Loblolly Pine ( P. taeda L.) en andere naaldbomen
22 februari 2010
Veel planten-weefsels, waaronder floëem en xyleem van loblolly den ( Pinus taeda L.), bevatten een hoog niveau van fenolen en polysacchariden die interfereren met RNA-zuivering. Deze presentatie behandelt technieken voor de oogst van het veld geteelde weefsels en isolatie van RNA van voldoende kwaliteit zijn voor microarrays en andere genomische analyses.
Het volgende is geproduceerd door onderzoekers van de University of Georgia en de Warnell School of Forestry and Natural Resources. Deze demonstratievideo beschrijft het oogsten van xylem- en floëemweefsel en de daaropvolgende RNA-isolatie uit Pinus Teta, algemeen bekend als de loblollyden, wat de belangrijkste coniferensoort is voor de productie van bosproducten in de Verenigde Staten. Zodra de boom is geveld, in dit geval een 40-jarige boom, wordt de hoofdstam in stukken gezaagd van ongeveer 50 centimeter lengte.
De stamsectie wordt vervolgens op verschillende plaatsen in de lengte ingekerfd met de kettingzaag om het verwijderen van de schors te vergemakkelijken. Met behulp van een hamer en een houtbeitel wordt de schors opgetild totdat deze in secties kan worden afgepeld. Vervolgens wordt het vloeistofgeleidende weefsel handmatig verwijderd, van de binnenkant van de schorssecties gestript en onmiddellijk in vloeibare stikstof ondergedompeld.
Zodra de schors is verwijderd, kan de dunne laag secundair xyleem worden verzameld door het oppervlak van de bout af te schrapen met een enkelzijdig scheermesje. Het waterige xyleemweefsel wordt onmiddellijk in vloeibare stikstof geplaatst. Tijdens deze oogst hebben we ook monsters van reactiehout verzameld, gewoonlijk aangeduid als compressie- en tegenhout, voordat de takken van de hoofdstam werden gesneden.
De oriëntatie van de tak wordt eerst gemarkeerd met spuitspray, zodat de gebieden die de twee weefseltypen bevatten — tegenhout aan de bovenzijde van de tak en compressiehout aan de onderzijde — kunnen worden bepaald. Tijdens het verwijderen van de schors worden de takken eerst met een kettingzaag ingekerfd langs lijnen die het compressiehout van het tegenhout scheiden, waarna de schorsverwijdering wordt uitgevoerd zoals bij de bouten van de hoofdstam, met uitzondering van het feit dat alleen de schors in de regio die overeenkomt met het type reactie wordt verwijderd.
Het geoogste hout wordt op elk gewenst moment verwijderd. Het is doorgaans moeilijker om grote bastsecties van deze kleinere takken te verwijderen. Monsters van reactiehout uit het secundaire xyleem worden op dezelfde wijze verzameld als bij normaal secundaire xyleem, door af te schrapen met het scheermesje en onmiddellijk onder te dompelen in vloeibare stikstof.
Let op de roodbruine kleur die kenmerkend is voor compressiehout. Het is vermeldenswaard dat het verzamelen en verwerken van meerdere monsters van een grote boom veel mankracht vereist, waarbij elke betrokken persoon een aangewezen taak uitvoert zodat alle weefseltypen gelijktijdig worden verzameld om RNA-degradatie te beperken; monsters die in vloeibare stikstof zijn ingevroren, worden vervolgens overgebracht naar gelabelde opbergzakken en op droogijs geplaatst voor transport terug naar het laboratorium. Onze eerste stap is het vermalen van het weefsel met een Specs Model 68-50 freezer mill; vergeleken met malen met een vijzel en stamper verhoogt deze stap de opbrengst van de RNA-extractie voor houtweefselmonsters aanzienlijk, terwijl de monsters koud worden gehouden met vloeibare stikstof.
Het weefsel wordt eerst met de hand in kleinere stukken gebroken en in de monsterkamer geplaatst. De kamer wordt in de houder geplaatst en vastgezet, waarna het monster gedurende twee minuten wordt gemalen. Het eindproduct heeft de consistentie van een grof poeder.
Het RNA-extractieprotocol is een proces van twee dagen. Op de eerste dag worden 2,5 gram bevroren weefsel toegevoegd aan RNA-extractiebuffer die is verwarmd tot 65 °C. Het monster wordt krachtig geschud om te mengen, waarna een gelijk volume chloroform wordt toegevoegd en het monster opnieuw wordt gemengd door voorzichtig te keren.
Vervolgens wordt het monster vijf minuten op een draaiwiel geplaatst. Het monster wordt daarna overgebracht naar Teflon Oakridge-buisjes voor hoge snelheden en gecentrifugeerd in een SS 34-rotor bij 12.000 RPM gedurende vijf minuten. De bovenste waterige fractie wordt in een nieuw buisje geëxtraheerd en er wordt een half volume chloroform aan toegevoegd.
Het monster wordt één minuut gevortext en vervolgens opnieuw vijf minuten op het rotatiewiel geplaatst. Na een tweede centrifugatie wordt de waterige fractie opnieuw overgebracht naar een 50 ml polypropylene buis voor hoge snelheden en gecentrifugeerd bij 10.000 RPM gedurende 20 minuten. Om eventuele resterende partikels te verwijderen, wordt het monster overgegoten in een 50 ml Falcon-buis en wordt een kwart volume van 10 M lithiumchloride aan het monster toegevoegd.
Het monster wordt door schudden gemengd en gedurende de nacht bewaard bij 4 °C. Op de tweede dag wordt het met lithiumchloride geprecipiteerde monster eerst gecentrifugeerd bij 11.000 RPM gedurende 30 minuten bij 4 °C.
Het supernatant wordt afgegoten en weggegooid, waarna de buisjes gedurende één minuut ondersteboven op chemische doekjes worden geplaatst. Om eventueel overtollig vloeistof te verwijderen, wordt het RNA-pellet, dat zichtbaar zou moeten zijn, resuspendeerd in 800 µL warme SSTE-buffer die is voorverwarmd tot 65 °C. Zorg ervoor dat er meerdere keren op en neer wordt gepipetteerd en rondom de randen van het pellet om te garanderen dat alles volledig in oplossing komt.
Breng vervolgens het geresuspendeerde RNA over naar een RNA-vrije microcentrifugebuis van Two Mil and Beyond. Verhit het monster gedurende één tot twee minuten in een waterbad van 65 °C, gevolgd door vortexen om te garanderen dat het monster volledig is geresuspendeerd. Dit kan indien nodig worden herhaald.
Voeg nu een gelijk volume gebufferde fenol-chloroform toe. Vortex het monster gedurende 15 tot 20 seconden en centrifugeer in een microcentrifuge bij 14.000 RPM gedurende drie minuten. De waterige fractie wordt overgebracht naar een nieuwe microcentrifugebuis en er wordt een gelijk volume toegevoegd.
Het monster wordt gevortexd en gecentrifugeerd zoals bij de vorige extractie. Voor de uiteindelijke organische extractiefase worden de Lock-gelbuizen eerst gecentrifugeerd op 11.000 RPM gedurende twee minuten.
Vervolgens wordt het RNA-monster uit de vorige extractie toegevoegd aan de phase lock-gel, gevolgd door een half volume chloroform, waarna beide componenten voorzichtig door pipetteren worden gemengd. Het monster wordt daarna vijf minuten gecentrifugeerd op 11.000 RPM, en het waterige RNA-monster wordt overgebracht naar een nieuwe Ambion RNA-vrije microcentrifugebuis. De volgende stap is een eenvoudige RNA-precipitatie van het monster met een tiende volume 3 M natriumacetaat pH 4,8 en twee volumes 100% ethanol.
De sample wordt gevortext, kortstondig gedurende 30 minuten in een vriezer van -80 °C geplaatst en vervolgens 30 minuten gecentrifugeerd in een microcentrifuge bij 4 °C. Het supernatant wordt voorzichtig weggezogen en het kleine witte pellet wordt gewassen met 1 mL ijskoude 70% ethanol; na het wegzuigen wordt de ethanolwas herhaald. Resterende ethanol wordt aan de lucht gelaten door de buisjes vijf minuten open op de bench te laten staan.
RNA-pellets worden resuspendeerd in 100 µL DEPC-water en opnieuw opgelost door vortexen en verhitting bij 65 °C. Indien nodig kan dit worden herhaald. De monsterconcentratie wordt bepaald.
De ratio's 262/80 en 262/30 worden spectrophotometrisch berekend om de mate van protein- en koolhydraatcontaminatie in het monster te schatten. 1% AGROS-gelelektroforese wordt gebruikt om de monsterkwaliteit, genomische DNA-contaminatie en RNA-degradatie kwalitatief te schatten. De integriteit van kritische monsters wordt verder geëvalueerd met een Agilent 2100 bioanalyzer om de ribosomale 28S/18S-ratio's en een RNA-integriteitsgetal te bepalen. Bedankt voor het bekijken van onze video over het oogsten van weefselmonsters en de isolatie van totaal RNA uit LOB (lollypine).
De volgende personen zijn verantwoordelijk voor de opname en productie van deze trainingsvideo.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze presentatie bespreekt het oogsten van xylem- en floëemweefsels van de loblollyden (Pinus taeda) en de daaropvolgende isolatie van RNA. De technieken zijn erop gericht de uitdagingen te overwinnen die worden veroorzaakt door hoge concentraties fenolen en polysachariden, die de RNA-zuivering verstoren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantenbiologie
- RNA-zuivering
- Genomische analyse
Achtergrond
- Loblolly pine is een sleutelsoort voor bosproducten in de VS.
- Het hoge gehalte aan fenolen en polysachariden compliceert de RNA-extractie.
- In het veld gekweekte weefsels vereisen specifieke oogsttechnieken.
- RNA-kwaliteit is cruciaal voor microarrays en genomische studies.
Doel van de studie
- Het demonstreren van effectieve oogsttechnieken voor de loblollyden.
- Het isoleren van RNA van voldoende kwaliteit voor genomische analyses.
- Het bieden van een praktische gids voor onderzoekers in de plantbiologie.
Gebruikte methoden
- Het zagen van de hoofdstam van een 40-jarige loblollyden in stukken.
- Het inkerven van de stukken met een kettingzaag om het verwijderen van de schors te vergemakkelijken.
- Het gebruik van een hamer en beitel om de schors op te tillen en af te pellen.
- Het handmatig verwijderen van floëemweefsel en het onderdompelen hiervan in vloeibare stikstof.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van RNA uit geoogste weefsels.
- Demonstratie van effectieve technieken om zuiveringsproblemen te overwinnen.
- Het bieden van een visuele gids voor onderzoekers.
- Benadrukken van het belang van RNA-kwaliteit voor downstream-toepassingen.
Conclusies
- Oogsttechnieken zijn essentieel voor het verkrijgen van RNA van hoge kwaliteit.
- Veldmethoden kunnen worden aangepast voor verschillende plantenweefsels.
- Effectieve RNA-isolatie is cruciaal voor genomisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Kwalitatieve RNA-isolatie uit coniferenweefsels, zoals de loblollyden, is essentieel voor het mogelijk maken van betrouwbare genomische en transcriptomische analyses in plantenbiotechnologisch R&D. Het overwinnen van de uitdagingen die worden veroorzaakt door fenolische en polysacharidecontaminanten heeft een directe invloed op het voorspellende vertrouwen van downstream moleculaire assays en ondersteunt een robuuste targetvalidatie in biotechnologische pijplijnen voor bosbouw en landbouw. Dit verbeterde protocol verhoogt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van RNA-gebaseerde discovery-workflows voor complexe plantensystemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt een strikte analyse van genexpressie in coniferensoorten mogelijk voor de verduidelijking van signaalpaden.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door RNA van hoge integriteit te leveren voor moleculaire assays.
- Vermindert biologische ambiguïteit in transcriptomische studies van houtige weefsels.
Screening & Assayontwikkeling
- Vergemakkelijkt de bereiding van gevalideerde RNA-monsters voor microarray- en qPCR-assayontwikkeling.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door interferentie van verontreinigingen in enzymatische reacties te minimaliseren.
- Maakt betrouwbare screening van veranderingen in genexpressie in diverse weefseltypes mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ondersteunt de ontdekking van translationele biomarkers door de RNA-kwaliteit voor analyses tussen verschillende soorten te waarborgen.
- Zorgt voor continuïteit van de monstername in het veld tot de moleculaire validatie in het laboratorium.
- Vermindert risico's bij preklinische studies door de kwaliteit van de RNA-input voor downstream-applicaties te standaardiseren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit RNA-isolatieprotocol vormt de schakel tussen veldmonstername en de ontwikkeling van moleculaire assays, waardoor vroege ontdekkingen worden verbonden met daaropvolgende genomische analyses.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden mogelijk door hoogwaardige RNA-extractie uit uitdagende plantenweefsels.
- Screening: Levert assay-klaar RNA met minimale contaminanten voor reproduceerbare moleculaire screening.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metrieken voor RNA-integriteit (bijv. spectrophotometrische ratio's, bioanalyzer RIN) voor kwaliteitsbeoordeling van monsters.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij biomarkerstudies die een consistente RNA-kwaliteit vereisen in zowel veld- als laboratoriumomgevingen.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een gestandaardiseerd, schaalbaar protocol dat aanpasbaar is voor meerdere coniferen- en plantensoorten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in genexpressie- en transcriptoomanalyses.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid van RNA-isolatie uit complexe weefsels.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming door het risico op assay-falen als gevolg van een slechte RNA-kwaliteit te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van moleculaire targets en kandidaatgenen in plantbiotechnologische pijplijnen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in veldcollectie van weefsels en de verwerking van fenolrijke monsters.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde apparatuur zoals vriesmolens en hogesnelheidscentrifuges.
- Vereist strikte standaardisatie tussen teams voor monsterverwerking en kwaliteitscontrole.
- Aanpasbaar aan diverse coniferen en houtige plantensoorten met indien nodig aanpassingen in het protocol.
- Potentiële beperkingen omvatten de arbeidsintensiteit en de noodzaak van snelle invriezing van monsters om RNA-degradatie te voorkomen.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:00
Title
0:23
Tissue Harvest
0:45
Collection of Phloem
1:07
Collection of Secondary Xylem
1:26
Collection of Reaction Wood: Compression and Opposite Secondary Xylem
2:21
Liquid Nitrogen Storage
3:20
RNA Isolation Day 1
2:46
RNA Isolation: Tissue Preparation
4:41
RNA Isolation Day 2
6:35
RNA Precipitation
7:16
Final Resuspension and Quantification
8:02
Credits
