Het bepalen van de reactiviteit en de titer van Serum met behulp van een hemagglutinatie Assay

Het bepalen van de reactiviteit en titer voor serum met behulp van een hemagglutininetest. Een gluten-natie is een reactie die plaatsvindt tussen oplosbare antilichamen en deeltjesvormige antigenen. Deze kunnen cellen zijn of moleculen dragen.

Epitopen op het oppervlak van de drager maken het mogelijk dat een antilichaam zich bindt en de drager kruislings verbindt, wat leidt tot de vorming van een complex rooster, genoemd een antigeen-antilichaamcomplex. Hemagluttinatie is een specifieke vorm van aggluttinatie waarbij antilichamen zich binden aan rode bloedcellen, die fungeren als het deeltjesvormige antigeen. Rode bloedcellen zijn nuttige doelwitten omdat ze zowel gemakkelijk beschikbaar zijn als dat de resultaten gemakkelijk met het blote oog kunnen worden waargenomen.

Serummonsters worden serieel verdund en vervolgens in een 96-wells ubo-plaat geplaatst. Vervolgens wordt een suspensie van rode bloedcellen Riva-cellen toegevoegd. Wanneer antilichamen die in hoge concentratie aanwezig zijn, zich binden aan de rode bloedcellen, ontstaat een groot rooster.

Terwijl dit rooster zich door zwaartekracht neerzet, past het zich aan de vorm van de ubo-plaat aan. Wanneer van bovenaf bekeken, is een brede laag rode bloedcellen te zien. Dit is een positieve hemagglutininereactie.

Wanneer de antilichaamniveaus laag zijn, kan zich geen rooster vormen en passen de rode bloedcellen zich aan de vorm van de UBO-plaat aan en concentreren zich aan de basis en vormen een kleine pellet. Dit is een negatieve hemagluttinatiereactie. Dit diagram toont een positieve reactie.

De cellen vormen een rooster terwijl ze zich nestelen, ze passen zich aan de vorm van de U-bodemplaat aan. Aan de linker- en rechterkant zien we de bovenkant waar een brede laag rode bloedcellen te zien is. Als er een tussenliggende hoeveelheid antilichamen aanwezig is, zal er enige lettervorming worden waargenomen.

Hemagluttinatie maakt het ook mogelijk om de reactiviteit van verschillende serummonsters te testen tegen het bekende antigeen. De titer van het serummonster kan ook worden bepaald. De titer is de laatste verdunning waarbij een positieve reactie werd waargenomen.

Normaal gesproken geldt: hoe hoger de antilichaamconcentratie in het serummonster, hoe hoger de titer. Dit diagram toont een negatieve hemagluttinatiereactie. Onvoldoende antilichaam aanwezig om de rode bloedcellen kruislings te verbinden.

Terwijl de cellen zich door zwaartekracht nestelen, glijden ze langs de zijkant van de put en vormen een strakke pellet op de bodem. Het diagram aan de rechterkant toont de rode bloedcellen wanneer ze van bovenaf worden bekeken. Voor dit experiment heb je 1 96-wells U-bodemplaat nodig.

Het is essentieel dat een U-bodemplaat wordt gebruikt, omdat vlakke bodemplatten de cellen niet zullen laten sedimenteren in een pellet, waardoor interpretatie onmogelijk wordt. Een pipet die 50 microliter test-serum kan leveren, een 1% suspensie van Riva-cellen en een eenmalige oplossing van veronalbufferzoutoplossing naar elke put van de rij. Een op twaalf, lever 50 microliter van roal-bufferzoutoplossing.

Dit wordt gebruikt als uw verdunningsmiddel. Plaats nu 50 microliter serum in put A een. Dit is uw eerste een op twee verdunning.

Gebruik de pipet om ervoor te zorgen dat het serummonster grondig is gemengd. Eenmaal gemengd, verwijdert u 50 microliter uit put A een en brengt u dit over naar put A twee. Dit is uw tweede een op twee verdunning, wat u een verdunning van viervoudig geeft.

Vervolg deze verdunningsreeks met behulp van putten drie tot en met elf. Plaats geen serum in put twaalf, want dit is uw roal-bufferzoutoplossing negatieve controle. Neem nu uw 1% suspensie van Riva-cellen, die grondig is gemengd en breng 50 microliter over naar put een tot en met put A twaalf.

Zodra de cellen zijn toegevoegd, dek de plaat af en tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat de monsters en de cellen zijn gemengd. Incubeer nu 60 minuten bij 37 graden. Een bevochtigde incubator is geschikt.

Tijdens de incubatieperiode van 60 minuten zullen antigeen-antilichaaminteracties plaatsvinden en zullen de cellen zich beginnen te nestelen. De videobeelden die u bekijkt, zijn een tijdsverloopfotografie van de volledige periode van 60 minuten. Dit is een close-up van putten vijf tot en met tien.

We hebben put twaalf al onderzocht, wat uw VBS-controle was. Bij deze put hadden de cellen een strakke pellet gevormd, wat aangeeft dat de test goed heeft gefunctioneerd. Putten vijf en zes zijn voorbeelden van positieve hemagluttinatie.

Put zeven is een voorbeeld van een tussenliggend aggluttinatieresultaat, terwijl putten acht, negen en tien negatief zijn voor hemagluttinatie. Op basis van dit resultaat zou de titer worden bepaald op basis van de verdunning voor put zeven, omdat dit de laatste put was waar een positieve reactie werd waargenomen.