Name: Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-25T17:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Leer de dissectie en cultuur van commissurale neuronen uit het ruggenmerg van E13 rattenembryo's. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar axonale groei en geleiding mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), de Peter Lougheed Medical Research Foundation, de McGill Program in Neuroengineering, het Fonds de Recherche en Sante du Quebec (FRSQ), en de Canada Foundation voor Innovatie (CFI ). Sebastien D. Langlois werd ondersteund door een opleiding Master&#39;s Award van het Fonds de la Recherche en sante du Quebec (FRSQ) en door een Frederick Banting en Charles Best Graduate Canada Beurzen Master Award van de Canadese Institutes of Health Research (CIHR). Wij zijn dankbaar voor Jessica MT Pham voor hulp met cijfers.

1. Dissectie van embryonale rat dorsale ruggenmerg Algemene aanbevelingen Houd L-15-medium op het ijs en vaak het medium verandering in de dissectie schotel om de embryo's af te koelen. Dit spaart weefsel integriteit. Alle stappen worden uitgevoerd met twee paar van Dumont # 5 tang tenzij anders vermeld. Om contaminatie te voorkomen, spray alle gereedschappen en werkoppervlakken met 70% ethanol en houden dissectie medium fles gesloten. Voor de overdracht van embryo's tussen de gerechten, gebruik dan een cut plastic pipet of een geperforeerde lepel. Het is van levensbelang, niet aan het ruggenmerg (knikken, stretching) schade met succes te voltooien de dissectie. Voorbereiding <ul><li> Koude L-15-medium </li><li> 50 ml L-15 + 10% hitte-geïnactiveerd paard serum (HiHS). Te houden op het ijs. </li></ul> Ruggenmerg dissectie <ol><li> Euthanaseren een E13 zwangerschap-geënsceneerde rat (E0 = eerste dag na dekking dagen) met een CO 2 kamer volgens de institutionele richtlijnen. </li><li> Spray 70% ethanol op de buik. Pinch en trek de huid van de onderbuik met een pincet en snijden met chirurgische schaar. Herhalen om dwars door de spier-en peritoneale lagen om de buikholte te bereiken. Maak een V-vorm incisie door te snijden weefsel langs de zijkanten van de buik, tot aan de thorax. Til en trek terug het weefsel naar de buikholte bloot te leggen. </li><li> De baarmoeder is bevestigd op drie locaties: in het midden onder buik, en zowel de bovenste laterale hoeken. Til de baarmoeder door te grijpen op weefsel tussen embryonale zakken. Snijd het bindweefsel naar de baarmoeder en plaats het in een petrischaal gevuld met L-15 op het ijs te verwijderen. </li><li> De volgende stappen zijn gedaan onder een dissectie microscoop. Te scheiden een embryo van de extra-embryonale weefsels en embryonale membranen, pak het weefsel tussen de baarmoeder zakken met een pincet,. Met het andere paar, knijp de meer transparante zijde van de zak om dwars door de oppervlakkige membranen (de donkere kant is de placenta). Knijp het embryo door zachtjes te drukken op de placenta kant van de weg. Verwijder alle embryo's en in een petrischaal gevuld met L-15 op het ijs. </li><li> Plaats een embryo in een 10 cm petrischaal gevuld met ijskoude L-15. Met behulp van microscissors, weggesneden het hoofd en achterste delen hoeken weergegeven in figuur 1a. Snijden op deze hoek zal de positie van de embryo wanneer geplaatst "ventrale naar beneden" te helpen. </li><li> De positie van de embryo 'ventrale zijde naar beneden "(anterior wijst weg, posterior wijzend naar de experimentator) (afb. 1b). </li><li> Houd het embryo van de ene kant, met behulp van de tang "pin down" het embryo (fig. 1c). Niet bewegen van de tang, want het zal het weefsel scheuren. Met de andere tang, afschilferen van de huid over de rug van het embryo vanaf de streek tussen de "bedrijf" tang (fig 1d-e). Dit zal blootstellen het ruggenmerg, die op dit punt, is verpakt door membranen (de hersenvliezen). Pak de huid van de zijkanten in plaats van boven het ruggenmerg om te voorkomen dat knikken het ruggenmerg. </li><li> Gedeeltelijk los het weefsel aan de rechterkant van het ruggenmerg (fig. 1f). Vanaf het niveau van de holding tang, porren het weefsel met gesloten pincet, zo dicht mogelijk bij het ruggenmerg. Vervolgens opent u langzaam de tang om het weefsel scheuren. Dit moet los van de achterwortelganglia (DRG) van het ruggenmerg, en moeten ook verstoren ventrale organen. Laat wat weefsel bevestigd aan de voorste en achterste uiteinden. Aangesloten verlaten weefsel gewicht toevoegt aan het embryo, waardoor wordt voorkomen dat het wordt omhoog getrokken tijdens de volgende stap. Daarnaast wordt dat weefsel gebruikt om vast te houden aan het embryo in latere stappen. </li><li> Vanaf het voorste einde moet het gebruik van de haakvormige wolfraam naald op de hersenvliezen snijden en het ruggenmerg te openen langs de roofplate (fig. 1g). </li><li> Draai de embryo 180 graden (posterior weg te wijzen, voorste wijzend naar de experimentator) (afb. 1h). Hierdoor kan de onderzoeker aan dezelfde hand te gebruiken om het weefsel los te maken van de andere kant van het embryo. </li><li> Houd het embryo door te grijpen op de eerder vrijstaande kant, en verstoren het weefsel van de overblijvende zijde met behulp van dezelfde methode (zie 1.8.). Als je klaar bent, helemaal los van het weefsel aan beide zijden van het ruggenmerg. Alternatief: helemaal los het weefsel nog op de linkerkant, maar laat iets weefsel bevestigd aan de voorste en achterste einde aan de rechterkant. Dit kan soms helpen handhaven het ruggenmerg in de positie in stap 1.12. </li><li> Plaats het ruggenmerg op zijn kant en verwijder de meeste van de resterende mesenchymale weefsel en DRG's (fig. 1i). </li><li> Bij deze stap, de hersenvliezen en het ruggenmerg zijn twee 'platen' van de weefsels apposed op elkaar. Vastpinnen de grotere, anterior-de meeste deel van het ruggenmerg, en trek een kort segment van hersenvlies uit het ruggenmerg cord (fig. 1j, links). Nu, houd de twee gescheiden segmenten door te grijpen in met een pincet, en trek het hersenvliezen met een gladde, constante beweging (fig. 1j). Ongelijke "peeling" zal leiden tot breuk van het ruggenmerg en / of de hersenvliezen laag. Het is meestal niet mogelijk om te herstellen van het gedeelte van het ruggenmerg nog aan hersenvliezen. </li><li> Met behulp van een plastic pipet de geïsoleerde ruggenmerg naar een petrischaal met een L-15 + 10% HiHS en laten op het ijs. Typisch worden ruggenmerg van alle embryo's voor het ontleden van de dorsale delen. </li></ol> Dorsale ruggenmerg dissectie <ol start="15"><li> Plaats een ruggenmerg in een petrischaal met een L-15 +10% HiHS, liggend in een "open-boek" configuratie. Knip de ruimere, voorste gedeelte (waaronder een deel van de achterhersenen) (fig. 1k). </li><li> De dorsale weefsel bevindt zich in de laterale-de meeste delen van het ruggenmerg (fig 1l, links). Terwijl pinning het snoer met een rechte wolfraam naald, gebruik dan de L-vormige wolfraam naald te snijden een strip die is 1/5de van de breedte van de helft van het ruggenmerg. (Fig. 1l, rechts). Plaats de dorsale strips in een 15 ml plastic buis met L-15 + 10% HiHS op ijs. Dorsale neurale buis delen van ~ 12 E13 embryo's zal opleveren ~ 3.5-4 miljoen cellen voor plating na dissociatie. Meer cellen kunnen worden verkregen door het uitvoeren van een grove ontleding van de dorsale ruggenmerg (snijden breder dorsale strips), maar commissural neuron zuiverheid zal worden verminderd. </li></ol> 2. Commissural neuron cultuur Algemene aanbevelingen Alle stappen dienen te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een weefselkweek kap, tenzij anders vermeld. Gebruik vers medium en vers ontdooid supplementen en reagentia. De dissociatie en tritureren stappen worden uitgevoerd in Ca 2 + / Mg 2 +-vrij HBSS te minimaliseren Ca 2 + / Mg 2 +-afhankelijke hechting. Voorbereiding <ul><li> beklede dekglaasjes (gebruik Duits Desag glas) of weefsel cultuur platen (zie coating procedure hieronder). </li><li> warm Neurobasal Plating Media (zie hieronder), in weefselkweek gerechten en CO 2 evenwicht in de weefselkweek incubator voor minimaal 1,5 uur voor de plating. </li><li> 2,5% trypsine in de 37 ° C waterbad </li><li> 2 flessen van HBSS Ca 2 + / Mg 2 +-vrij, een bij 4 ° C, een bij 37 ° C. </li><li> twee vuur-gepolijst glas pasteurpipetten een met een diameter de helft van de gebruikelijke grootte, en een met een diameter van iets kleiner dan de helft. Gebruik gesteriliseerd Pasteurpipetten. Om brand-polijsten de pipetten, gebruik dan een Bunsen-brander (de top van de licht blauwe vlam) om de tip te smelten enigszins afnemen van de diameter. Omdat deze stap is uitgevoerd buiten de weefselkweek kap, spuit de pipetten met 70% ethanol voor plaatsing onder de weefselkweek kap. Voor meer efficiënte invordering van neuronen, de vacht van de pasteurpipetten met media die serum voor het begin van de dissociatie of net voor de tritureren stap (vul pipetten met media en houden gedurende 30 seconden). Dit voorkomt dat cellen van het vasthouden aan de binnenkant van het Pasteur pipet tijdens de tritureren. </li><li> steriel milliQ water voor het wassen van PLL-gecoate gerechten of dekglaasjes </li><li> 12,5% MgSO 4-oplossing in HBSS </li></ul> Poly-L-lysine coating Bij gebruik van glas dekglaasjes, acid-wash voor 24 uur en steriliseren voorafgaand aan de beplating (zie Kaech en Banker, 2006). Gebruik Duitse Desag glas dekglaasjes. Voor het coaten van poly-L-lysine op glas of plastic dekglaasjes weefselkweek gerechten: <ul><li> onder een weefselkweek kap, bestrijken oppervlakken met een kleine koepel van 100 ug / ml PLL oplossing voor 1.75-2 uur. </li><li> Was twee keer met milliQ water, ten minste 5 minuten per wasbeurt (kan worden uitgevoerd tijdens de cel dissociatie stap hieronder). </li><li> op te slaan in het water tot gebruik. Laat niet de PLL-gecoate oppervlak droog is. Ter beperking van PLL verspilling voor dekglaasjes coating, plaats de dekglaasjes in steriele bacteriële petrischalen. Vacht en was de dekglaasjes door het plaatsen van een koepel van vloeistof op de dekglaasjes. De bacteriële Petri gerechten zijn hydrofoob, waardoor de vloeistof moet blijven op het glas dekglaasjes. Overdracht van de dekglaasjes om weefselkweek gerechten vlak voor beplating van de cellen. Voor neuronen vergulde op plastic weefselkweek gerechten, hechting meestal hoger is, kan dus neurieten rek worden verminderd. </li></ul> Dissociatie en plating <ol><li> Controleer of de dorsale strips hebben zich tot op de bodem van de buis. Verwijder het merendeel van de L-15 +10% HiHS met een Pasteur pipet. Snel een keer was het dorsale neurale buis strips door het toevoegen van 3 ml koud (4 ° C) HBSS. </li><li> Laat de dorsale neurale buis strips gedurende 2 minuten rusten, verwijder vervolgens de HBSS met een Pasteur pipet. </li><li> Voeg warm (37 ° C) HBSS tot een volume van 4,7 ml. Then Voeg 0,3 ml van 2,5% trypsine tot een uiteindelijke concentratie van 0,15% trypsine te geven. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in het waterbad gedurende 7 minuten. Meng voorzichtig een keer halverwege de incubatie. </li><li> Voeg 30 ul DNAse (25 000 U / mL) voor een uiteindelijke concentratie van 150 U / mL. Voeg 60 ul van MgSO 4 en meng kort voor een uiteindelijke concentratie van 0,15%. Voor weefsel van grof dissecties, incubeer voor een extra 1 minuut bij 37 ° C in het waterbad. In dit stadium moet het dorsale neurale buis secties worden versnipperd. Als de dorsale neurale buis secties niet begonnen met het fragment, betekent dit meestal dat de 2,5% trypsine voorraad oud is, en nieuwe voorraad moet worden ontdooid, of het wassen met koud HBSS niet effectief te verwijderen van de HiHS uit het monster. </li><li> Centrifugeer het weefsel fragmenten bij 200 g gedurende 4 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met een Pasteur pipet, zodat ~ 50-100 ul van vloeistof op de bodem van de buis. </li><li> Flick de buis voorzichtig om de pellet los te maken, dan wassen van de cellen door toevoeging van 5 ml warm HBSS. Laten bezinken bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 200 g gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof met een Pasteur pipet, zodat ~ 50-100 ul van vloeistof op de bodem van de buis. </li><li> Flick de buis voorzichtig om de pellet los te maken en gedeeltelijk resuspendeer de cellen. Voeg vervolgens 2 ml warm HBSS. </li><li> Gebruik de kleine (half-diameter) brand-gepolijst glas Pasteur pipet om de cellen te scheiden door langzaam pipetteren up-and-down 4-6 keer. Voorkomen dat bubbels, en pipet de vloeistof tegen de zijkant van de buis. Niet over-vermaal. </li><li> Gebruik de kleinste vuur-gepolijst glas Pasteur pipet om verder van de cellen scheiden door langzaam pipetteren up-and-down 3-4 keer. Voorkomen dat bubbels, en pipet de vloeistof tegen de zijkant van de buis. Niet over-vermaal. Voor weefsel van grof dissecties, voeg een extra 1 ml warm HBSS aan de buis aan het einde van de dissociatie. Wanneer dissociëren de cellen, is het niet nodig om alle de cel klompen en aggregaten dissociëren. Stop pipetteren up-and-down of wijziging van een Pasteur pipet met een kleinere diameter als je geen verdere daling in de omvang van de cel aggregaten met verdere pipetteren. </li><li> Laat de resterende weefsel fragmenten in de buis genoegen nemen met een min. Het is niet nodig om de cellen over te dragen aan een nieuwe buis. </li><li> Neem 20 pi celsuspensie en voeg 5 pl trypan blauw. Rekenen cellen op een hemocytometer. Neuronen moet ≥ 95% haalbaar zijn door trypan blauw uitsluiting. </li><li> Het bord van de neuronen in Neurobasal Plating Media (zie recepten). <ul><li> Aanbevolen plating dichtheden voor het verkrijgen van geïsoleerde neuronen (low-density culturen om neuronen klonteren of overlappen elkaar te voorkomen): </li><li> 120 000 - 180 000 cellen / goed voor een 6 wells plaat </li><li> 60 000 - 75 000 cellen / goed voor een 12 wells plaat </li></ul></li><li> 16-18 uur later, wijzigt de media om Neurobasal Growth Media (zie recepten) Geen gebruik maken van een vacuümpomp om de media te zuigen uit de cultuur schotel bij het ​​veranderen van media; voorzichtig gebruik van een pipet. Dit voorkomt loskomen van de neuronen. </li></ol> Representatieve resultaten: Vier uur na plating, moet neuronen hebben gehandeld op grond van de poly-L-lysine (PLL)-coating. Onder fase contrast belichting, gevolgd cellichamen zijn meestal vrij plat en ovaal van vorm (fig. 2a). Cellen die niet goed zijn toegetreden weergegeven als bolletjes die iets bewegen als de schotel is zeer zacht klopte op de zijkant. Vele factoren kunnen mogelijk belemmeren de hechting van cellen (zie discussie). Na 30 uur in vitro, hebben de meeste neuronen uitgebreid een axon met een zichtbare groei kegel (fig. 2c, d). Als een slechte axonale groei wordt waargenomen, controleert u of de Neurobasal Growth Media is gemaakt met vers medium en supplementen. Neuronen gezond te blijven gedurende ten minste 6 dagen in deze voorwaarden. Deze procedure heeft bewezen betrouwbaar te geven voorbereidingen sterk verrijkt in commissural neuronen, met ~ 90% van de neuronen die DCC (Yam et al.. 2009). De breedte van de dorsale ruggenmerg strip die wordt gebruikt voor de voorbereiding van de celsuspensie van invloed op de zuiverheid van de cultuur, met een grotere zuiverheid wanneer dunnere strips worden gebruikt. Een voorbeeld toepassing is weergegeven in figuur 3 (immunofluorescentie). Zie het artikel van Yam et al.. (2009) voor meer voorbeelden. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schema van het ruggenmerg dissectie stappen. D = rug-, V = Ventraal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1773/1773fig1.jpg">Klik hier voor een grotere afbeelding te zien.</a> <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Vertegenwoordiger gevolg van de geïsoleerde commissuralneuronen uitgeplaat op een PLL-gecoat glas dekglaasje aan. a, b) 4 uur na de plating, hebben neuronen gehandeld op grond van het oppervlak. Bar = 20 urn. c, d) 30 uur na de plating, hebben de meeste neuronen uitgebreid een axon met een zichtbare groei kegel. Bar = 20 urn. <img src="/files/ftp_upload/1773/1773fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Commissural Een neuron immunostained voor gamma-tubuline (groen), met F-actine gelabeld door phalloidin (F-actine, rood) en de kern van DAPI (blauw). Recepten en opmerkingen Neurobasal Plating Media <ul><li> Neurobasal </li><li> 10% hitte-geïnactiveerd FBS (HiFBS) </li><li> 2 mM L-glutamine (van 200 mM voorraad-oplossing) Optioneel: penicilline / streptomycine antibiotica (gebruik de helft van de normale concentratie) </li></ul> Neurobasal Groei Media <ul><li> Neurobasal </li><li> B27 (1 / 50 verdunning uit voorraad) </li><li> 2 mM L-glutamine (van 200 mM voorraad-oplossing) </li><li> Optioneel: penicilline / streptomycine antibiotica (gebruik de helft van de normale concentratie) Zodra de media is gemaakt, kan deze worden bewaard bij 4 ° C gedurende twee weken. Om de temperatuur en de pH van media evenwicht voor het uitplaten de cellen, plaatsen media in weefselkweek petrischalen en plaats in een weefselkweek incubator voor minstens 1,5 uur. </li></ul> Neurobasal Na een fles Neurobasal medium is geopend, kan het een maand bewaard bij 4 ° C in het donker. Gooi Neurobasal die is geopend voor meer dan een maand anders overleving van de cel lager zal zijn. Warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (HiFBS) of paard serum (HiHS) Om warmte-inactiveren FBS of GS, warmte bij 56 ° C in een waterbad gedurende 30 minuten. Schud de fles ongeveer elke 10 minuten of zo. (Gebruik Voor nauwkeurigheid een fles van vergelijkbare grootte gevuld met water. Plaats een thermometer in het water fles om te zien wanneer 56 ° C is bereikt. Begin timing op dit punt.) Warmte-geïnactiveerd FBS moet mogelijk worden gecentrifugeerd om duidelijke precipitaten, en kunnen worden hoeveelheden verdeeld en opnieuw ingevroren bij -20 ° C. L-Glutamine Altijd dooi een verse hoeveelheid van L-glutamine voor elk experiment. B27 Aliquots van B27 kan worden bewaard bij 20 ° C voor langdurige opslag, of bij 4 ° C gedurende maximaal een maand.

<ol><li>Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. , 113-1111 (2003).</li>
<li>Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+ipsilateral+retinal+ganglion+cell+axons+at+the+optic+chiasm+requires+the+Shh+Receptor+Boc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Segregation of ipsilateral retinal ganglion cell axons at the optic chiasm requires the Shh Receptor Boc.</a> Journal of Neuroscience. 30, 266-275 (2010).</li>
<li>Helms, A. W., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+of+dorsal+commissural+interneurons+are+defined+by+MATH1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors of dorsal commissural interneurons are defined by MATH1 expression.</a> Development. 125, 919-928 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Okada, A., Charron, F., Morin, S., Shin, D. S., Wong, K., Fabre, P. J., Tessier-Lavigne, M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boc+is+a+receptor+for+sonic+hedgehog+in+the+guidance+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Boc is a receptor for sonic hedgehog in the guidance of commissural axons.</a> Nature. 444, 369-373 (2006).</li>
<li>Yam, P. T., Langlois, S. D., Morin, S., Charron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+guides+axons+through+a+noncanonical%2C+Src-family-kinase-dependent+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog guides axons through a noncanonical, Src-family-kinase-dependent signaling pathway.</a> Neuron. 62, 349-362 (2009).</li>
</ol>

We hebben beschreven een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen uit embryonale rat ruggenmerg. Deze procedure is routinematig gebruikt in ons lab om op betrouwbare wijze voor te bereiden neuronen om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon begeleiding te bestuderen. Voor celbiologie en immunochemie experimenten, dissectie van een nest produceert voldoende neuronen. Wanneer er meer cellen nodig zijn, kunnen dergelijke zoals in veel biochemie experimenten, dissectie van twee nestjes nodig zijn. Voor ...

Dissectie van embryonale rat dorsale ruggenmerg (zie ook tabel I) <ul><li> E13 zwangerschap geënsceneerd rat </li><li> Ethanol 70% </li><li> Chirurgische schaar, Fine Science Tools </li><li> Tang, Dumont # 5, Fine Science Tools </li><li> Petrischalen </li><li> L-15-medium </li><li> Dissection microscoop, Leica </li><li> Plastic overdracht pipetten </li><li> Microscissors, Fine Science Tools </li><li> Tungsten naalden en pin houders van (een haakvormige naald, een L-vormen naald, een rechte naald), Fine Science Tools </li><li> Hitte-geïnactiveerd Horse Serum (HiHS) </li><li> 15 ml plastic buizen </li></ul> Commissural neuron cultuur (zie ook tabel I) <ul><li> Weefselkweek incubatoren (37 ° C, 5% CO 2, vochtigheid) </li><li> Duitse Desag dekglaasjes en / of kunststof weefselkweek gerechten </li><li> Poly-L-lysine, Sigma </li><li> Steriele milliQ H 2 O </li><li> Neurobasal, Invitrogen </li><li> Hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HiFBS) </li><li> L-Glutamine </li><li> B27, Invitrogen </li><li> Penicilline / streptomycine antibiotica </li><li> 37 ° C waterbad </li><li> Steriel Pasteur Pipetten </li><li> Bunsen gasbrander </li><li> HBSS, Ca 2 + / Mg 2 +-vrij, Invitrogen </li><li> DNAse, Worthington </li><li> MgSO 4 </li><li> Centrifuge </li><li> Hemacytometer </li><li> Trypan blauwe oplossing </li></ul>

dissectie en cultuur van commissural neuronen van het ruggenmerg embryonic

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neuronen zijn op grote schaal gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan axon begeleiding tijdens de embryonale ontwikkeling van het ruggenmerg te onderzoeken. De cellichamen van deze neuronen bevinden zich in het dorsale ruggenmerg en hun axonen volgen stereotiepe trajecten tijdens de embryonale ontwikkeling. Commissural axonen in eerste instantie ventraal project de richting van de vloerplaat. Na het oversteken van de middellijn, deze axonen naar voren en het project richting de hersenen. Elk van deze stappen wordt gereguleerd door de werking van verschillende begeleiding cues. Culturen sterk verrijkt in commissural neuronen zijn bij uitstek geschikt voor vele experimenten het aanpakken van de mechanismen van axon pathfinding, waaronder het draaien assays, immunochemie en biochemie. Hier beschrijven we een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Eerst wordt het ruggenmerg geïsoleerd en dorsale strips ontleed uit. De dorsale weefsel wordt dan gedissocieerd in een cel schorsing door behandeling met trypsine en mechanische storingen. Neuronen zijn uitgeplaat op poly-L-lysine-gecoat glas dekglaasjes of weefselkweek gerechten. Na 30 uur<em&gt; In vitro</em&gt; Hebben de meeste neuronen uitgebreid een axon. De zuiverheid van de cultuur (Yam<em&gt; Et al..</em&gt; 2009), meestal meer dan 90%, kan worden beoordeeld door immunokleuring met de commissural neuron markers DCC, LH2 en TAG1 (Helms en Johnson, 1998). Dit neuronale voorbereiding is een nuttig hulpmiddel voor<em&gt; In vitro</em&gt; Onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen van commissural axon groei en begeleiding bij het ruggenmerg ontwikkeling.

Deze video toont een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Gedissocieerd commissural neuronen zijn nuttig om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon groei en begeleiding te bestuderen.

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissurale neuronen zijn op grote schaal gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan axonale geleiding tijdens de embryonale ontwikkeling van het ruggenmerg. De cellichamen ...

Deze video demonstreert een methode om comm-chorale neuronen uit het embryonale ruggenmerg te dissekeren en te kweken. De procedure begint met het oogsten van ratembryo's in stadium E 13, waarna de ruggenmergen worden gedissekeerd. Tijdens de dissectie worden de ruggenmergen geopend langs de roof plate en klaargemaakt in een open-boekconfiguratie.Ruggenmergweefselstrips worden gedissecteerd en in een buis verzameld. Het ruggenmergweefsel wordt door trypsine en mechanische disruptie gedissocieerd tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Commissurale neuronen worden vervolgens gekweekt op met polylysine gecoate glazen dekglasjes of weefselkweekschalen.Deze kunnen vervolgens worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axonale groei en geleiding te bestuderen. Hallo, ik ben Sebastian van het Laboratory of Molecular Biology of Neural Development aan het Clinical Research Institute of Montreal. Hallo, ik ben Steve Moen, ook van het Molecular Biology of Neural Development Laboratory.Vandaag laten we u een procedure zien voor het dissekeren en cultiveren van commissurale neuronen uit het embryonale ruggenmerg. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axongeleiding te bestuderen. Laten we beginnen.Vandaag zullen ruggenmergen worden gedissecteerd uit vers geoogste E 13 rattenembryo's, die gedurende de gehele dissectie in een schaaltje met L 15 medium worden geplaatst. Het is belangrijk om de embryo's en oplossingen op ijs te bewaren. Houd er rekening mee dat het bij alle dissectiestappen cruciaal is om het ruggenmerg niet onnodig op te rekken, aangezien dit de isolatie van een volledig intact ruggenmerg kan belemmeren.Scheid onder een dissectiemicroscoop het embryo van alle extra-embryonale weefsels en embryonale membranen. Plaats vervolgens één embryo in de dissectieschaal. Gebruik microschaarknippen om de kop en de posterieure delen van de hier getoonde hoeken weg te snijden.Dit creëert een vlak oppervlak dat helpt bij het positioneren van het embryo voor gemakkelijke toegang tot het ruggenmerg. Positioneer het embryo met de ventrale zijde naar beneden en de anterior zijde van u af gericht. Gebruik een pincet om het embryo aan één zijde stevig vast te pinnen.Knijp de pincet niet dicht en laat deze niet los, anders zal het weefsel bij de tweede pincet scheuren. Pak de huid aan de zijkant van het ruggenmerg vast. Draai de punten van de fixeerpincet.Pel de huid aan de rugzijde van het embryo af om het ruggenmerg, omgeven door de hersenvliezen, bloot te leggen en het weefsel rechts van het ruggenmerg gedeeltelijk los te maken. Gebruik gesloten pincetten om in het weefsel te prikken, beginnend op het niveau van de vasteerpincet. Kom zo dicht mogelijk bij het ruggenmerg zonder dit aan te raken.Herhaal dit meerdere keren langs het ruggenmerg. Hiermee worden sommige dorsale wortelganglia vastgezet en ventrale organen verstoord. Laat aan de anterieure en posterieure uiteinden wat weefsel zitten, beginnend bij het anterieure uiteinde.Gebruik een haakvormige wolfraamnaald om de meninges door te snijden en het ruggenmerg langs de dakplaat te openen. Draai het embryo 180 graden en disrupt het weefsel vanaf de overgebleven zijde met dezelfde methode.Ontkoppel vervolgens het weefsel aan de linkerkant van het ruggenmerg volledig, de zijde die eerder was verstoord (oorspronkelijk aan de rechterkant). Leg het ruggenmerg op zijn zijkant en gebruik een pincet om het meeste van het resterende mesenchymale weefsel en de dorsale wortelganglia te verwijderen. Gebruik een pincet om een kort flapje van de hersenvliezen open te pellen. Op dit punt vormen de hersenvliezen en het ruggenmerg twee lagen sandwichweefsel.Gebruik de pincet om het grotere deel van het ruggenmerg aan het anterieure uiteinde vast te zetten. Pak de twee gescheiden segmenten met een pincet vast en pel de meninges af. Doe dit met een vloeiende, constante beweging, aangezien onregelmatig pellen de laag van de meninges en/of het ruggenmerg kan beschadigen.Als de laag van de hersenvliezen tijdens het trekken scheurt, is het deel van het ruggenmerg dat aan de hersenvliezen verbonden blijft meestal niet meer te redden. Hoewel dit soms wel mogelijk is. Gebruik een plastic pipet om het geïsoleerde ruggenmerg voorzichtig over te brengen naar een schaal met L 15 medium met 10% hitte-inactief paardenserum op ijs voordat er meer embryo's worden verwerkt.Vergeet niet het medium in de dissectieschaal te vervangen door gekoeld L 15 om het embryo koel te houden en te helpen de weefselintegriteit te behouden. Oogst de ruggenmergen van alle embryo's voordat u overgaat tot de dissecties van het dorsale ruggenmerg. Om de dissectie van het dorsale merg te beginnen, plaatst u één vers geïsoleerd ruggenmerg in een Petrischaal met L 15 en 10% hitte-geïnactiveerd paardenserum.Snijd het bredere anterieure gedeelte weg, dat een deel van de ruitenhersenen bevat. Leg vervolgens het ruggenmerg plat neer en spreid het uit als een open boek. Het dorsale weefsel bevindt zich in de meest laterale delen van het opengelegde ruggenmerg. Terwijl het merg wordt vastgepind met een rechte wolfraamnaald, wordt met een L-vormige wolfraamnaald een strip uitgesneden van ongeveer een vijfde van de breedte van één helft van het ruggenmerg; het uitsnijden van bredere strips zal de opbrengst verhogen, maar de zuiverheid van de cultuur verminderen.Overdraag meerdere dorsale stroken naar een conische buis van 15 milliliter met L 15 medium met 10% paardenserum en plaats de buis op ijs. Het resterende deel van de procedure vindt plaats nabij of in de weefselkweekkap. Voor deze kweken is het belangrijk om oplossingen en apparatuur vooraf voor te bereiden, gewoonlijk vóór de dissectie.De tation-stap maakt gebruik van vuurgepolijste pastapippetten in twee maten, waarvan één een diameter heeft die de helft is van de oorspronkelijke grootte en de andere iets kleiner is. Coat de twee vuurgepolijste pipetten vóór aanvang met serumhoudend medium door medium in de pipetten op te zuigen en dit 30 seconden te laten inwerken. Dit vermindert het aantal cellen dat tijdens de ation aan het glas hecht.Begin met het controleren of de dorsale strips naar de bodem van de buis zijn gezakt. Verwijder onder een laminaire flowkast het grootste deel van het SUP-supernatans met een pipet. Was snel met drie milliliters koud magnesium- en calciumvrij HBSS.Laat de strip van de dorsale neurale buis twee minuten bezinken. Verwijder vervolgens de HBSS met de pasta. Vul het volume aan tot 4,7 milliliters.Voeg aan warm HBSS 0,3 milliliters van 2,5% trypsine toe voor een eindconcentratie van 0,15% trypsine en meng voorzichtig. Incubeer zeven minuten in een waterbad van 37 °C. Meng halverwege de incubatie één keer voorzichtig. Voeg na afloop van de incubatie DNase toe voor een eindconcentratie van 150 units per milliliter en magnesiumsulfaat voor een eindconcentratie van 0,15%, en meng kort.De secties van de dorsale neurale buis moeten nu gefragmenteerd zijn. Centrifugeer de weefselfragmenten bij 200 G gedurende vier minuten. Verwijder het SUP supernatant met een pasta perpe, waarbij ongeveer 50 tot 100 µL vloeistof onderin de buis achterblijft.Tik zachtjes tegen de buis om het pellet los te maken. Was de cellen vervolgens door vijf milliliters warme HBSS toe te voegen. Laat de cellen twee minuten bezinken bij kamertemperatuur.Centrifugeer en was de cellen opnieuw. Resuspendeer ze deze keer in twee milliliters warme HBSS. Gebruik een vuurgepolijste pipet met een halve diameter om de cellen te tritureren door langzaam vier tot zes keer op en neer te pipetteren; pipetteer de vloeistof tegen de wand van de buis om grotere klonten op te breken en zo celsterfte te verminderen.Voorkom het ontstaan van luchtbellen en agiteer niet te krachtig. Gebruik de kleinste vuurgepolijste glaspipet om de cellen verder te dissociëren door drie tot vier keer langzaam op en neer te pipetteren op dezelfde wijze. Het is niet nodig om alle celklonters te dissociëren, aangezien aggregaten van dode cellen en debris de neiging hebben zich te vormen.Laat eventuele weefselfragmenten één minuut bezinken. Verwijder vervolgens 20 µL van het SUP-supernatant, dat gesuspendeerde cellen moet bevatten voor telling in een hemosoter; de neuronen moeten voor ten minste 95% levensvatbaar zijn volgens trypaanblauw-kleuring. De neuronen bevinden zich in neurobasaal platingmedium in een concentratie die geschikt is voor uw toepassing.Vervang na 16 tot 18 uur het medium door neuraal basaal groeimedium om loslating te voorkomen. Verwijder het medium bij de neuronen voorzichtig met een pipet in plaats van te aspireren met een vacuumpomp. Hier zijn enkele representatieve resultaten van geïsoleerde commissurale neuronen die op met PLL gecoate glazen dekglasjes zijn gezaaid; vier uur na het zaaien hebben de neuronen zich aan het oppervlak gehecht, 30 uur na het zaaien.De meeste neuronen hebben verlengde axonen met een zichtbare groeikegel. Deze neuronen kunnen eenvoudig worden gebruikt in immunofluorescentie-experimenten. In dit voorbeeld zijn microtubuli groen gelabeld, actine rood en NA blauw.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u commissurale neuronen uit embryonale ruggenmergen kunt dissekeren en kweken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de zuiverheid van de commissurale neuronen afhangt van de dikte van de gedissekeerde dorsale strip. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

dissection-culture-commissural-neurons-from-embryonic-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze test evalueert het vermogen van een signaalmolecuul, hier botmorfogenetisch proteïne 7 (BMP7), om commissural axonen te heroriënteren. Een explant van embryonale dorsale ruggenmerg is gekweekt grenst aan een totaal van COS-cellen afscheiden van de kandidaat groeifactoren. Geheroriënteerd commissural axonen groeien binnen de explantatie worden gevisualiseerd door immunohistochemie.

Het testen van het vermogen van diffundeerbare signaalmoleculen om Embryonale Spinal Commissural Axonen Heroriënteer

Laten we zien hoe te ontleden en cultuur chick E4 statoacoustic ganglion en E6 ruggenmerg explantaten. Explantaten worden gekweekt onder serum-vrije omstandigheden in 3D collageen gels voor 24 uur. Neurieten responsiviteit is getest met de groei factor-aangevuld medium en met eiwit-gecoate kralen.

Dissectie en Cultuur van Chick Statoacoustic Ganglion en Spinal Cord Explantaten in Collageen Gels voor neurietuitgroei Assays

The video demonstrates the isolation of oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons from a transgenic mouse embryo. The embryo expresses motor neurons labeled with a green fluorescent protein (GFP) for easy visualization and identification. The motor neurons are surgically isolated under a fluorescence microscope and maintained in a culture medium.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from a Mouse Embryo

Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Processen als proliferatie, patroon, differentiatie en axon begeleiding kan gemakkelijk worden gemodelleerd in de zebravis ruggenmerg. In dit artikel beschrijven we een montageprocedure voor zebravis embryo's die visualisatie van deze gebeurtenissen optimaliseert.

Dissectie en horizontale bevestiging van de zebravis embryo&#39;s: Analyse van Spinal Cord Development

De vloerplaat is een cruciale structuur van de ontwikkeling van het ruggenmerg, waardoor dampdoorlatend signalen naar voorouders en differentiëren neuronen. We beschrijven een methode om vloer-plaat geconditioneerd medium produceren, toe te passen op verse ruggenmerg weefsel, en de consequenties daarvan op de eiwitten van belang door biochemie.

Cultuur van Geïsoleerde Vloerplaat Tissue en productie van geconditioneerd medium om functionele eigenschappen van Floor-plaat uitgebracht Signalen Assess

Prikken herstellen motoriek na een complete dwarslaesie. Sommige spinale-projecterende neuronen goed regeneratoren en andere niet. Dit document illustreert de technieken voor huisvesting zeeprik larven (en onlangs omgebouwd volwassenen), het produceren van volledige ruggenmerg doorsnijdingen en het voorbereiden wholemount hersenen en ruggenmerg voor in situ hybridisatie.

Compleet ruggenmergletsel en Brain Dissection Protocol voor Latere Wholemount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in Larvale Overzeese Lamprei

Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.

Isolatie en Cultuur van Gedissocieerde sensorische neuronen van Chick Embryo

Hier presenteren we een protocol dat is gebaseerd op gekweekt ruggemerg segmenten op multi-elektrode arrays functionele regeneratie van propriospinal verbindingen in vitro bestuderen.

Onderzoek van functionele Regeneratie in Organotypische Spinal Cord Co-culturen Grown on Multi-elektrode arrays

Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.

Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen

Leer de dissectie en cultuur van commissurale neuronen uit het ruggenmerg van E13 rattenembryo's. Deze methode maakt gedetailleerd onderzoek naar axonale groei en geleiding mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Meer video's verkennen