Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic
25 mei 2010
Deze video toont een methode te ontleden en cultuur commissural neuronen van de E13 rat dorsale ruggenmerg. Gedissocieerd commissural neuronen zijn nuttig om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axon groei en begeleiding te bestuderen.
Deze video demonstreert een methode om comm-chorale neuronen uit het embryonale ruggenmerg te dissekeren en te kweken. De procedure begint met het oogsten van ratembryo's in stadium E 13, waarna de ruggenmergen worden gedissekeerd. Tijdens de dissectie worden de ruggenmergen geopend langs de roof plate en klaargemaakt in een open-boekconfiguratie.
Ruggenmergweefselstrips worden gedissecteerd en in een buis verzameld. Het ruggenmergweefsel wordt door trypsine en mechanische disruptie gedissocieerd tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Commissurale neuronen worden vervolgens gekweekt op met polylysine gecoate glazen dekglasjes of weefselkweekschalen.
Deze kunnen vervolgens worden gebruikt om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axonale groei en geleiding te bestuderen. Hallo, ik ben Sebastian van het Laboratory of Molecular Biology of Neural Development aan het Clinical Research Institute of Montreal. Hallo, ik ben Steve Moen, ook van het Molecular Biology of Neural Development Laboratory.
Vandaag laten we u een procedure zien voor het dissekeren en cultiveren van commissurale neuronen uit het embryonale ruggenmerg. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de cellulaire en moleculaire mechanismen van axongeleiding te bestuderen. Laten we beginnen.
Vandaag zullen ruggenmergen worden gedissecteerd uit vers geoogste E 13 rattenembryo's, die gedurende de gehele dissectie in een schaaltje met L 15 medium worden geplaatst. Het is belangrijk om de embryo's en oplossingen op ijs te bewaren. Houd er rekening mee dat het bij alle dissectiestappen cruciaal is om het ruggenmerg niet onnodig op te rekken, aangezien dit de isolatie van een volledig intact ruggenmerg kan belemmeren.
Scheid onder een dissectiemicroscoop het embryo van alle extra-embryonale weefsels en embryonale membranen. Plaats vervolgens één embryo in de dissectieschaal. Gebruik microschaarknippen om de kop en de posterieure delen van de hier getoonde hoeken weg te snijden.
Dit creëert een vlak oppervlak dat helpt bij het positioneren van het embryo voor gemakkelijke toegang tot het ruggenmerg. Positioneer het embryo met de ventrale zijde naar beneden en de anterior zijde van u af gericht. Gebruik een pincet om het embryo aan één zijde stevig vast te pinnen.
Knijp de pincet niet dicht en laat deze niet los, anders zal het weefsel bij de tweede pincet scheuren. Pak de huid aan de zijkant van het ruggenmerg vast. Draai de punten van de fixeerpincet.
Pel de huid aan de rugzijde van het embryo af om het ruggenmerg, omgeven door de hersenvliezen, bloot te leggen en het weefsel rechts van het ruggenmerg gedeeltelijk los te maken. Gebruik gesloten pincetten om in het weefsel te prikken, beginnend op het niveau van de vasteerpincet. Kom zo dicht mogelijk bij het ruggenmerg zonder dit aan te raken.
Herhaal dit meerdere keren langs het ruggenmerg. Hiermee worden sommige dorsale wortelganglia vastgezet en ventrale organen verstoord. Laat aan de anterieure en posterieure uiteinden wat weefsel zitten, beginnend bij het anterieure uiteinde.
Gebruik een haakvormige wolfraamnaald om de meninges door te snijden en het ruggenmerg langs de dakplaat te openen. Draai het embryo 180 graden en disrupt het weefsel vanaf de overgebleven zijde met dezelfde methode.
Ontkoppel vervolgens het weefsel aan de linkerkant van het ruggenmerg volledig, de zijde die eerder was verstoord (oorspronkelijk aan de rechterkant). Leg het ruggenmerg op zijn zijkant en gebruik een pincet om het meeste van het resterende mesenchymale weefsel en de dorsale wortelganglia te verwijderen. Gebruik een pincet om een kort flapje van de hersenvliezen open te pellen. Op dit punt vormen de hersenvliezen en het ruggenmerg twee lagen sandwichweefsel.
Gebruik de pincet om het grotere deel van het ruggenmerg aan het anterieure uiteinde vast te zetten. Pak de twee gescheiden segmenten met een pincet vast en pel de meninges af. Doe dit met een vloeiende, constante beweging, aangezien onregelmatig pellen de laag van de meninges en/of het ruggenmerg kan beschadigen.
Als de laag van de hersenvliezen tijdens het trekken scheurt, is het deel van het ruggenmerg dat aan de hersenvliezen verbonden blijft meestal niet meer te redden. Hoewel dit soms wel mogelijk is. Gebruik een plastic pipet om het geïsoleerde ruggenmerg voorzichtig over te brengen naar een schaal met L 15 medium met 10% hitte-inactief paardenserum op ijs voordat er meer embryo's worden verwerkt.
Vergeet niet het medium in de dissectieschaal te vervangen door gekoeld L 15 om het embryo koel te houden en te helpen de weefselintegriteit te behouden. Oogst de ruggenmergen van alle embryo's voordat u overgaat tot de dissecties van het dorsale ruggenmerg. Om de dissectie van het dorsale merg te beginnen, plaatst u één vers geïsoleerd ruggenmerg in een Petrischaal met L 15 en 10% hitte-geïnactiveerd paardenserum.
Snijd het bredere anterieure gedeelte weg, dat een deel van de ruitenhersenen bevat. Leg vervolgens het ruggenmerg plat neer en spreid het uit als een open boek. Het dorsale weefsel bevindt zich in de meest laterale delen van het opengelegde ruggenmerg. Terwijl het merg wordt vastgepind met een rechte wolfraamnaald, wordt met een L-vormige wolfraamnaald een strip uitgesneden van ongeveer een vijfde van de breedte van één helft van het ruggenmerg; het uitsnijden van bredere strips zal de opbrengst verhogen, maar de zuiverheid van de cultuur verminderen.
Overdraag meerdere dorsale stroken naar een conische buis van 15 milliliter met L 15 medium met 10% paardenserum en plaats de buis op ijs. Het resterende deel van de procedure vindt plaats nabij of in de weefselkweekkap. Voor deze kweken is het belangrijk om oplossingen en apparatuur vooraf voor te bereiden, gewoonlijk vóór de dissectie.
De tation-stap maakt gebruik van vuurgepolijste pastapippetten in twee maten, waarvan één een diameter heeft die de helft is van de oorspronkelijke grootte en de andere iets kleiner is. Coat de twee vuurgepolijste pipetten vóór aanvang met serumhoudend medium door medium in de pipetten op te zuigen en dit 30 seconden te laten inwerken. Dit vermindert het aantal cellen dat tijdens de ation aan het glas hecht.
Begin met het controleren of de dorsale strips naar de bodem van de buis zijn gezakt. Verwijder onder een laminaire flowkast het grootste deel van het SUP-supernatans met een pipet. Was snel met drie milliliters koud magnesium- en calciumvrij HBSS.
Laat de strip van de dorsale neurale buis twee minuten bezinken. Verwijder vervolgens de HBSS met de pasta. Vul het volume aan tot 4,7 milliliters.
Voeg aan warm HBSS 0,3 milliliters van 2,5% trypsine toe voor een eindconcentratie van 0,15% trypsine en meng voorzichtig. Incubeer zeven minuten in een waterbad van 37 °C. Meng halverwege de incubatie één keer voorzichtig. Voeg na afloop van de incubatie DNase toe voor een eindconcentratie van 150 units per milliliter en magnesiumsulfaat voor een eindconcentratie van 0,15%, en meng kort.
De secties van de dorsale neurale buis moeten nu gefragmenteerd zijn. Centrifugeer de weefselfragmenten bij 200 G gedurende vier minuten. Verwijder het SUP supernatant met een pasta perpe, waarbij ongeveer 50 tot 100 µL vloeistof onderin de buis achterblijft.
Tik zachtjes tegen de buis om het pellet los te maken. Was de cellen vervolgens door vijf milliliters warme HBSS toe te voegen. Laat de cellen twee minuten bezinken bij kamertemperatuur.
Centrifugeer en was de cellen opnieuw. Resuspendeer ze deze keer in twee milliliters warme HBSS. Gebruik een vuurgepolijste pipet met een halve diameter om de cellen te tritureren door langzaam vier tot zes keer op en neer te pipetteren; pipetteer de vloeistof tegen de wand van de buis om grotere klonten op te breken en zo celsterfte te verminderen.
Voorkom het ontstaan van luchtbellen en agiteer niet te krachtig. Gebruik de kleinste vuurgepolijste glaspipet om de cellen verder te dissociëren door drie tot vier keer langzaam op en neer te pipetteren op dezelfde wijze. Het is niet nodig om alle celklonters te dissociëren, aangezien aggregaten van dode cellen en debris de neiging hebben zich te vormen.
Laat eventuele weefselfragmenten één minuut bezinken. Verwijder vervolgens 20 µL van het SUP-supernatant, dat gesuspendeerde cellen moet bevatten voor telling in een hemosoter; de neuronen moeten voor ten minste 95% levensvatbaar zijn volgens trypaanblauw-kleuring. De neuronen bevinden zich in neurobasaal platingmedium in een concentratie die geschikt is voor uw toepassing.
Vervang na 16 tot 18 uur het medium door neuraal basaal groeimedium om loslating te voorkomen. Verwijder het medium bij de neuronen voorzichtig met een pipet in plaats van te aspireren met een vacuumpomp. Hier zijn enkele representatieve resultaten van geïsoleerde commissurale neuronen die op met PLL gecoate glazen dekglasjes zijn gezaaid; vier uur na het zaaien hebben de neuronen zich aan het oppervlak gehecht, 30 uur na het zaaien.
De meeste neuronen hebben verlengde axonen met een zichtbare groeikegel. Deze neuronen kunnen eenvoudig worden gebruikt in immunofluorescentie-experimenten. In dit voorbeeld zijn microtubuli groen gelabeld, actine rood en NA blauw.
We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u commissurale neuronen uit embryonale ruggenmergen kunt dissekeren en kweken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de zuiverheid van de commissurale neuronen afhangt van de dikte van de gedissekeerde dorsale strip. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert een methode om commissurale neuronen te dissekeren en te kweken uit het dorsale ruggenmerg van ratten in stadium E13. Geassocieerde commissurale neuronen zijn nuttig voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van axonale groei en geleiding.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Commissurale neuronen spelen een cruciale rol in de ontwikkeling van het zenuwstelsel.
- Het begrijpen van hun groeimechanismen en geleidingsmechanismen is essentieel voor inzichten in de neurale ontwikkeling.
- Het dissekeren en kweken van deze neuronen maakt gedetailleerde cellulaire studies mogelijk.
- Deze methode kan helpen bij het onderzoeken van potentiële therapeutische strategieën voor ruggenmergletsels.
Doel van de studie
- Het bieden van een betrouwbare methode voor het isoleren van commissurale neuronen uit rattenembryo's.
- Het faciliteren van de studie naar axonale groei en geleiding in een gecontroleerde omgeving.
- Het verbeteren van het begrip van de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de neurale ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Het oogsten van ratembryo's in stadium E13.
- Het dissekeren van ruggenmergen en het prepareren ervan in een open-book-configuratie.
- Het dissocieren van dorsaal weefsel tot een single-cell-suspensie met behulp van trypsine en mechanische disruptie.
- Het kweken van commissurale neuronen op met polylysine gecoate oppervlakken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en kweek van commissurale neuronen uit ruggenmergen van ratten in stadium E13.
- Aantoonbare levensvatbaarheid van gekweekte neuronen voor verdere experimentele studies.
- Een reproduceerbare methode geboden voor het bestuderen van axonale groei en geleiding.
- Mogelijkheid gemaakt tot het onderzoeken van cellulaire en moleculaire mechanismen in een laboratoriumomgeving.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het dissekeren en kweken van commissurale neuronen.
- Deze aanpak kan een aanzienlijke bijdrage leveren aan onderzoek naar neurale ontwikkeling.
- Toekomstige studies kunnen deze gekweekte neuronen gebruiken om therapeutische interventies te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze methode maakt de isolatie mogelijk van sterk verrijkte culturen van commissurale neuronen uit het embryonale ruggenmerg, waardoor een reductionistisch systeem ontstaat om axonale geleidingsmechanismen te bestuderen. Dergelijke preparaten ondersteunen targetvalidatie in neurodevelopmentaal onderzoek door mechanistische analyse van responsen op geleidingssignalen in een gecontroleerde, reproduceerbare setting mogelijk te maken. De benadering draagt bij aan preklinische risicoreductie door kwantitatieve, fenotype-gebaseerde read-outs te genereren voor studies naar padmodulatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot axongeleidingspaden te onderzoeken via functionele assays op gezuiverde commissurale neuronen.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd, hoogzuiver neuronen culturesysteem (>90% zuiverheid) voor consistente studies naar target engagement.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een ziekterelvant systeem voor het screenen van verbindingen die axonale draaiing, groeikegeldynamiek of gevoeligheid voor geleidingssignalen moduleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt assay-standaardisatie via gedefinieerde tijdlijnen voor dissociatie, uitplating en rijping, wat reproduceerbare evaluatie van verbindingen faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een platform voor mechanische risicoreductie om target-engagement en pathway-modulatie te beoordelen in een mens-relevante ontwikkelingscontext.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische validatie door kwantificeerbare assays voor axonale uitgroei en draaipunten als translationele biomarkers te bieden.
Integratie van pijplijn & workflow
De methode past binnen het continuüm van drug discovery en ondersteunt het testen van hypothesen in een vroeg stadium en de ontwikkeling van assays voor neurodevelopmentale targets, waarbij de resultaten bijdragen aan de identificatie van lead-verbindingen en beslissingen over de preklinische voortgang.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden en biologisch risicobeheer door directe observatie van axonale responsen op begeleidingssignalen zoals netrinen, slits en morfogenen mogelijk te maken.
- Screening: Levert kwantitatieve, beeldvormingsgeschikte read-outs (axonlengte, morfologie van de groeikegel, draaihoeken) die geschikt zijn voor geautomatiseerde of high-content screeningformaten.
- Analytics: Genereert meetbare afhankelijke variabelen, waaronder axonale extensiesnelheden, trajectgetrouwheid en markerexpressie (DCC, LH2, TAG1) voor statistische vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinisch werk via geconserveerde axonale begeleidingsmechanismen, waardoor cross-species extrapolatie van effecten van doelmodulatie mogelijk is.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor neuronale preparatie dat toepasbaar is in meerdere studies naar begeleidingssignalen en screeningcampagnes voor verbindingen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door biologische ruis te verminderen via sterk verrijkte neuronale culturen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor dissectie, dissociatie en uitplating.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door vroege mechanistische inzichten te bieden in de effecten van targetmodulatie op axonale geleiding.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risicogebaseerde prioritering van neuro-ontwikkelingstargets op basis van functionele validatie in een fysiologisch relevant neuronaal model.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in embryonale weefseldissectie en steriele neuronenkweektechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot embryo's van tijdige dracht, dissectiemicroscopen en apparatuur voor trypsine-gebaseerde dissociatie.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de selectie van de breedte van de dorsale strip om een balans tussen opbrengst en zuiverheid te waarborgen.
- Vereist aanpassing van de plaatdichtheid en rijpingstijd voor verschillende assayformaten (bijv. immunofluorescentie versus biochemische analyse).
- Beperkt door de embryonale oorsprong van het weefsel, wat longitudinale studies buiten de vroege ontwikkelingsstadia beperkt.
