Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

In dit artikel beschrijven we een protocol voor de groei en expansie van menselijke bronchiale epitheelcellen uit vers geïsoleerde menselijke bronchiale segmenten. Dit protocol bestaat uit vijf secties: coderen en krassen, honderd millimeter kweekplaten, herstellen van bronchiaal weefsel, explantaten van bronchiaal weefseltransplantaten, passage van menselijke bronchiale epitheelcellen met ciliaire groei, en menselijke bronchiale epitheelcellen op transwells. Voordat u begint, dient u er rekening mee te houden dat alle stappen in de biologische veiligheidskabinet worden uitgevoerd.

Tenzij anders vermeld, lees dan de sectie over materialen, reagentia en preparatie door en zorg ervoor dat u de basisvoorbereidingen heeft getroffen. De volgende handelingen: coderen, stockoplossingen, kweek, medium, dissociatieoplossingen, coating en krassen. Honderd millimeter kweekplaten moeten in de bst worden uitgevoerd.

Houd alles steriel. Neem steriele kweekplaten van honderd millimeter en coatingoplossing. Pipetteer 2 mL coatingoplossing in een honderd millimeter plaat en draai deze rond om de bodem van de plaat te coaten.

Zorg ervoor dat de coatingoplossing de bodem van de plaat gelijkmatig bedekt. Pipetteer de resterende oplossing uit de plaat en gebruik deze om een tweede plaat van honderd millimeter te coaten. Herhaal dit voor zoveel platen als nodig is.

Het aantal benodigde platen varieert afhankelijk van het aantal weefselexplantaten. Zorg ervoor dat de coatingoplossing de bodem van de platen gelijkmatig bedekt, zoals gedemonstreerd.

Dek de platen af met hun deksels. Laat de platen één tot twee uur drogen in de incubator en aspireer de overtollige oplossing voor gebruik voor bronchiale weefselexplanten. Niet gebruikte gecoate kweekplaten kunnen in een steriele zak worden geplaatst en bij vier graden Celsius worden bewaard voor later gebruik.

Reinig een kleine, scherpe schaar, een scalpel en een pincet met 70% ethanol en breng in de BSC de krasgecoate platen aan door met het scalpel stevig te drukken om diepe, kleine X-vormige inkepingen te maken, minimaal vier per plaat. Als de kras niet diep genoeg is, zullen de weefselstukjes niet in de spuiten bezinken en zullen ze gaan drijven. Plaats het weefsel buiten de BSC in een P3-schaal. Spoel het geïsoleerde menselijke bronchiaalweefsel grondig af met BSS.

Open de bronchiale fragmenten. Breng het weefsel over in de BS en breng dit vervolgens over naar een steriele weefselkweekplaat van 100 millimeter met gekoelde DMEM/F12 plus 1% antibioticum-antimycoticum. Gebruik de kleine scherpe schaar om het weefsel in blokjes van twee tot drie millimeter te snijden.

Plaats met een pincet één stukje gesneden weefsel in het centrum van elke X en druk dit aan. Laat de weefselstukjes of X-explantaten enkele seconden voorzichtig aan de plaat hechten. Voeg vervolgens voorzichtig 10 ml compleet medium toe. Als het weefsel na toevoeging van het medium blijft drijven, gebruik dan een pincet om het weefsel in de groeven van de X te duwen of maak een nieuwe X. Het kan nodig zijn om nieuwe X-en te maken als de groeven niet diep genoeg zijn.

Plaats de platen in de incubator en ververs het medium elke drie tot vier dagen totdat de weefsels klaar zijn voor transplantatie. Wanneer er voldoende epitheelcellen rond de weefsels zijn gegroeid om gebieden van één tot twee centimeter te bedekken, wat ongeveer vier weken duurt. Gebruik hiervoor gecoate en bekraste platen van honderd millimeter.

Aangezien sommige weefselexplantaten mogelijk niet succesvol zijn, hangt het aantal platen af van het aantal weefselstukjes dat u transplanteert. Indien u platen gebruikt die eerder zijn gecoat en bewaard bij vier graden Celsius, breng deze dan voor gebruik naar kamertemperatuur. Pak het weefsel voorzichtig op met een pincet van de oorspronkelijke plaat, plaats het in het centrum van de as in de nieuwe plaat en druk voorzichtig aan. Weefsels zonder uitgroei moeten worden weggegooid.

Laat het weefsel aan de plaat hechten. Voeg gedurende enkele seconden medium toe en incubeer. Voeg toe zoals eerder beschreven voor X explan.

Voeg twee ml trypsin-EDTA-stamoplossing toe aan elke 100 mm weefselkweekplaat. Verdun de stamoplossing met zes ml steriele 0,01 M PBS, waarbij twee ml stamoplossing wordt gemengd met zes ml PBS voor een eindconcentratie trypsin van 250 µg/ml en EDTA van 100 µg/ml. Nadat de explantaten naar een nieuwe plaat zijn verplaatst, wordt het medium afgezogen van platen met ringen van cellen van één tot twee centimeter.

Voeg acht ml warme verdunde druppels en een edt-oplossing toe aan elke 100 mm plaat. Plaats deze in een incubator bij 37 °C gedurende drie tot 15 minuten. Controleer regelmatig.

Het te lang laten inwerken van trypsine zal de cellen beschadigen. Controleer de platen onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de meeste cellen zijn losgekomen; de cellen worden rond en laten los, zoals te zien is bij 8x vergroting. Voeg 10% FBS in medium per plaat toe om de EDTA-oplossing te inactiveren.

Combineer de volumes van alle platen in één buis of in aparte buisen per weefseltype. Tel de cellen met behulp van een Hema Cytometer; centrifugeer bij 100 G gedurende vijf minuten. Er vormt zich een celpellet onderin de buis; resuspendeer het celpellet in compleet medium tot de gewenste celconcentratie.

Plaats telkens twee tot 3 miljoen cellen per T 75-fles en voeg naar behoefte volledig medium toe. Incubeer en ververs het medium. Elke drie tot vier weken groeien de cellen tot subconfluentie in de D 75-flessen.

Na ongeveer vier weken moeten de cellen worden geoogst en uitgebreid, of gebruikt bij subconfluentie om senescentie te voorkomen. Begin met het voorbereiden van de permeabele membranen van de transwells. Gebruik de 6,5 millimeter inserts die in de 24-wells platen passen.

Voeg medium toe aan beide zijden van het membraan. Zes mils aan de onderzijde en 0,1 mils aan de bovenzijde. Incubeer gedurende één uur in een celkweekincubator.

Verwijder voorzichtig het medium van beide zijden van het membraan. Begin eerst met het basale volume; wees voorzichtig, want het membraan kan gemakkelijk beschadigd raken. Pipetteer het medium daarom langs de wand van de kweekinsert, gebruik daarbij het aanbevolen volume.

Als dit niet gebeurt, zal er medium lekken naar andere wells waarin cellen zijn gezaaid. Na de pre-incubatie van de permeabele support pipetteert u voorzichtig uw celconcentratie op de apicale zijde van het membraan voor wells van 6,5 millimeter, waarbij 0,1 ml celconcentratie op de apicale zijde van het membraan wordt aangebracht. Pipetteer 0,6 ml medium op de basale zijde van het membraan.

Voed de cellen gedurende 10 dagen aan zowel de apicale als de basale zijde. Om een goed gedifferentieerde cultuur te verkrijgen, dient het medium tweemaal per week te worden vervangen. Verwijder het basale volume met de gedemonstreerde methode.

Vervang eerst het epicale volume door 0,6 ml medium toe te voegen aan de basale zijde van het membraan. Deze methode bevordert de celhechting aan het membraan en voorkomt dat cellen gedurende lange tijd aan lucht worden blootgesteld. Wissel het medium snel uit en plaats het monster terug in de incubator.

Creëer op dag 10 een lucht-vloeistofgrensvlak door het AAL-medium te verwijderen en de 0,6 ml medium aan de basale zijde van het membraan te vervangen. Houd de cellen gedurende zes weken in het lucht-vloeistofgrensvlak en verschoon het medium twee keer per week. Gecilieerde cellen zullen vier weken na de creatie van de ALI verschijnen.

Vloeistofinterface. De cellen zullen een uniforme differentiatie tot gecilieerde cellen bereiken. Zes weken na het creëren van de vloeistofinterface van het oor.

Menselijke bronchiale segmenten met gezonde epitheelcellen uit explantaten en transplantaten. In onze studie waren succesvolle culturen uit explantaten van het bronchiale weefsel aanwezig in acht van de negen weefsels. Aangezien een van de explantaatculturen geïnfecteerd raakte, bereikten de ringen van epitheelcellen een straal van één tot twee centimeter in drie tot vier weken.

Succesvolle X-explantaten werden tot wel zes keer opnieuw gekweekt. Alle succesvolle culturen vertoonden bewijs van celmigratie binnen 48 uur na het begin van de transplantaties, of de X-explantaten vertoonden, zoals getoond in B-cellen, een kasseivormig uiterlijk dat kenmerkend is voor deze epitheelcellen, zoals getoond in B. In daaropvolgende figuren onthulde immunokleuring van cytosinepreparaten van cellen uit het explantaat en cellen gezaaid op dekglasplaatjes dat alle cellen positief waren voor het epitheelspecifieke cytokeratine; menselijke subcultuur van bronchiale cellen, gegroeid tot subconfluentie in T 75-flasks, worden hier getoond. Let op het kasseivormige uiterlijk.

Menselijke subculturen van bronchiale cellen vertoonden een uniforme positieve immunokleuring voor keratine en E.cadherine; immunokleuring met specifieke antilichamen tegen andere celtypen vertoonde geen aanwijzingen voor contaminatie van de culturen door fibroblasten, mesenchymale of endotheliale cellen. Raadpleeg voor meer details figuur vijf en de bijbehorende legenda in de tekst. Cellen gekweekt op permeabele polyester membranen of transwells met een vloeistofinterface differentieerden tot gecilieerd epitheel, zoals hier wordt aangetoond; gooi de cellen en hun transplantaten weg als er cellen met een andere morfologie dan hier getoond beginnen te verschijnen. In dit protocol hebben we gedetailleerde methoden gepresenteerd voor de kweek en expansie van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen.

Studies op basis van menselijke cellen zijn nodig voor het bepalen van belangrijke pathways van mechanismen bij menselijke longziekten en voor toxicologische en farmacologische screening van nieuwe geneesmiddelen. We hopen dat de hier beschreven methoden u zullen aanmoedigen om menselijke bronchiale epitheelcellen uit explantaten te kweken en deze cellen in uw studiesystemen te gebruiken. Bedankt en veel succes.