Name: Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Leer een protocol voor het kweken en uitbreiden van primaire humane bronchiale epitheelcellen uit verse bronchussegmenten. Deze methode omvat differentiatie op een lucht-vloeistof-interface voor onderzoek naar longgezondheid en ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zijn zeer dankbaar dat dr. Richard Inculet voor het verstrekken van de bronchiale weefsels. Onderzoek Ethics Board goedkeuringen zijn verkregen van St. Joseph&#39;s Gezondheidszorg Hamilton en The University of Western Ontario / Londen Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), weefsel-en Archief Comite, afdeling Pathologie. We danken ook Ernie Spitzer (Electron Microscopy, McMaster University) voor het leveren van TEM van onze ALI culturen en Daniela Farkas voor het verstrekken van een deel van de materialen die nodig zijn voor de immunokleuring. Dit werk werd gefinancierd door een Block term subsidie ​​van de Ontario Thoracic Society, dr. Asma Yaghi werd ondersteund door een FSORC beurs, St. Joseph&#39;s Healthcare, Hamilton, Ontario, Canada.

<ol><li>Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts - Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).</li>
<li>Turi, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+activates+anion+exchange+protein+2+and+AP-1+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).</li>
<li>Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+normal+adult+human+bronchial+epithelial+cells+in+a+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium.</a> In Vitro. 18, 633-642 (1982).</li>
<li>Yoshisue, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ciliated+bronchial+epithelium+1%2C+a+ciliated+cell-associated+gene+induced+during+mucociliary+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).</li>
<li>Wetering, S. van <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+secretory+leukocyte+proteinase+inhibitor+%28SLPI%29+production+by+human+bronchial+epithelial+cells%3A+increase+of+cell-associated+SLPI+by+neutrophil+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase.</a> J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).</li>
<li>Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+and+human+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).</li>
<li>Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+serum-free+culture+conditions+for+primary+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hyg.+Environ.+Health%22%5BJournal%5D)">Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells.</a> Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells%22">Culture of epithelial cells</a>. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 1-23 (1992).</li>
<li>Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells%22">Culture of epithelial cells</a>. Freshney, R. I. , Wiley-Liss, Inc. New York. 181-196 (1992).</li>
</ol>

In deze studie hebben we gepresenteerd gedetailleerde methoden voor cultuur en uitbreiding van de primaire menselijke bronchiale epitheelcellen. We laten zien hoe explantaten en transplantaties van bronchiale weefsel, gekweekt in media die epitheliale celgroei te bevorderen, kan een continue bron van menselijke epitheelcellen voor studies van de niet-gesplitste (onder water) en gedifferentieerde (gekweekt op lucht-water grensvlak) cel-modellen bieden . Deze cellen kunnen worden gebruikt in drug het testen van systemen d...

Andere eisen: incubator, biologische veiligheid kast (BSC), centrifuge, 100mm kweekplaten, steriele buizen (15 ml, 50 ml en 2 ml), steriele pipet tips, scalpel handvat en messen, kleine scherpe schaar, laboratorium jassen en handschoenen. Deze kunt u opvragen bij uw preferred suppliers.

primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van explantaten

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Menselijke bronchiale epitheelcellen nodig zijn voor cel-modellen van de ziekte en het effect van hulpstoffen en farmacologische agenten op de functie en structuur van de menselijke epitheelcellen te onderzoeken. Hier beschrijven we in detail de kweekmethode bronchiale epitheelcellen van de luchtwegen luchtwegen weefsel dat wordt door de chirurg geoogst op de tijden van de longchirurgie (bv. longkanker of long volume reductie chirurgie). Met ethiek goedkeuring en informed consent, de chirurg neemt wat nodig is voor de pathologie en voorziet ons van een bronchiale gedeelte dat is ver van de zieke gebieden. Het weefsel wordt vervolgens gebruikt als een bron van explanten die kan worden gebruikt voor het kweken van primaire bronchiale epitheelcellen in de cultuur. Bronchiale segmenten ongeveer 0,5-1cm lang en 1 cm in diameter ≤ worden gespoeld met koud EBSS en overtollige parenchymweefsel wordt verwijderd. Segmenten zijn opengesneden en gehakt in de 2-3mm<sup&gt; 3</sup&gt; Stukjes weefsel. De stukken worden gebruikt als een bron van primaire cellen. Na het coaten 100mm kweekplaten voor 1-2 uur met een combinatie van collageen (30 ug / ml), fibronectine (10 ug / ml), en de BSA (10 ug / ml), worden de platen gekrast in 4-5 gebieden en weefsel stukken worden geplaatst in de krassen gebieden, dan kweekmedium (DMEM / Ham F-12 met additieven) die geschikt zijn voor epitheliale celgroei wordt toegevoegd en de platen worden geplaatst in een incubator bij 37 ° C in 5% CO<sub&gt; 2</sub&gt; Bevochtigde lucht. Het kweekmedium wordt elke 3-4 dagen. De epitheliale cellen groeien uit de stukken de vorming van ongeveer 1,5 cm diameter ringen in 3-4 weken. Explanten kan opnieuw worden gebruikt tot 6 keer door ze te verplaatsen naar nieuwe pre-gecoate platen. Cellen worden opgeheven met behulp van trypsine / EDTA, samengevoegd, geteld, en opnieuw uitgeplaat in T75 Cell Bind kolven om hun aantal te verhogen. T75 kolven gezaaid met 2-3 miljoen cellen groeien naar 80% confluentie in 4 weken. Uitgebreide primaire menselijke epitheliale cellen kunnen worden gekweekt en toegestaan ​​om te differentiëren op de lucht-vloeistof interface. Hier beschreven methoden bieden een overvloedige bron van menselijke bronchiale epitheelcellen van vers geïsoleerde weefsels en zorgen voor het bestuderen van deze cellen als modellen van ziekte en voor farmacologie en toxicologie screening.

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor het kweken van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen van explantaten van menselijke bronchiale luchtwegen weefsel inclusief gedifferentieerde groei van een lucht-water grensvlak. Deze methode biedt een overvloedige bron van primaire cellen voor onderzoek naar de rol van de luchtweg epitheel in de menselijke longen gezondheid en ziekte.

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Menselijke bronchiale epitheelcellen zijn nodig voor celmodellen van ziekten en om het effect van hulpstoffen en farmacologische middelen op de ...

In dit artikel beschrijven we een protocol voor de kweek en expansie van menselijke bronchiale epitheelcellen uit vers geïsoleerde menselijke bronchiale segmenten. Dit protocol bestaat uit vijf secties: coderen en krassen, honderd millimeter kweekplaten, herstellen van bronchiaal weefsel, explanttransplantaties van bronchiaal weefsel, passage van gecilieerde menselijke bronchiale epitheelcellen en menselijke bronchiale epitheelcellen op transwells. Let erop voordat u begint dat alle stappen in de biologische veiligheidskabinet worden uitgevoerd.Tenzij anders vermeld, raadpleegt u de sectie over materialen, reagentia en preparatie en zorg ervoor dat u de basisvoorbereidingen heeft getroffen. De volgende zaken: codering, kweek van stamoplossingen, medium, dissociieoplossingen, coating en krassen, moeten in 100 mm kweekplaten worden uitgevoerd in de bst.Houd alles steriel. Neem steriele kweekplaten van 100 mm en coatingoplossing. Pipetteer 2 mL coatingoplossing in een 100 mm plaat en draai deze rond om de bodem van de plaat te coaten.Zorg ervoor dat de coating-oplossing de bodem van de plaat gelijkmatig bedekt. Pipetteer de resterende oplossing uit de plaat en gebruik deze om een twee

primary-human-bronchial-epithelial-cells-grown-from-explants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nasale epitheelcellen, verkregen door middel van oppervlakkige schaaf biopsie van menselijke vrijwilligers, worden uitgebreid en overgebracht naar weefselkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, worden cellen gekweekt bij lucht-water grensvlak, waardoor culturen van trilharen en niet-haarcellen. Gedifferentieerde nasale epitheelcelkweken voorzien levensvatbare experimentele modellen voor het bestuderen van de respiratoire mucosa.

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

Deze publicatie toont methoden voor succesvol bemonsteren en kweken van nasale epitheliale mucosa van kinderen, en het herprogrammeren van deze cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's).

Cultiveren primaire nasale epitheelcellen van Kinderen en Programmeer in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Primaire humane bronchiale epitheelcellen zijn moeilijk te transduceren. Dit protocol beschrijft de productie van lentivirussen en hun concentratie, evenals de optimale kweekcondities die nodig zijn om zeer efficiënte transductionen in deze cellen te bereiken tijdens differentiatie naar een pseudostratified epitheel.

Optimale Lentivirus Productie en Cultuur van de Cel voorwaarden die nodig zijn om succesvol te transduceren primaire humane bronchiale epitheelcellen

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor weefseldissociatie en cellulaire fractioneringsbenaderingen die verrijking van levensvatbare epitheelcellen uit proximale en distale gebieden van de menselijke long mogelijk maken. Hierin worden deze benaderingen toegepast voor de functionele analyse van longepitheelvoorlopercellen door het gebruik van 3D organoïdencultuurmodellen.

Isolatie en verrijking van menselijke longepitheelvoorlopercellen voor organoïde cultuur

Hier beschrijven we de isolatie, versterking en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcellen (HNE) op het lucht-vloeistofinterface en een biobankingprotocol dat het mogelijk maakt om met succes versterkte HNE te bevriezen en vervolgens te ontdooien. Het protocol analyseert elektrofysiologische eigenschappen van gedifferentieerde HNE-cellen en CFTR-gerelateerde chloridesecretiecorrectie bij verschillende modulatorbehandelingen.

Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde

Het protocol presenteert een methode om menselijke longorganoïden af te leiden uit primaire longweefsels, de longorganoïden uit te breiden en proximale differentiatie te induceren om 3D- en 2D-luchtwegorganoïden te genereren die het menselijke luchtwegepitheel getrouw fenokopie.

Het opzetten van menselijke longorganoïden en proximale differentiatie om volwassen luchtwegorganoïden te genereren

Het huidige protocol beschrijft door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelachtige cellen (iAT2s). Deze cellen kunnen worden gekweekt als zelfvernieuwende bollen in 3D-cultuur of worden aangepast aan de air-liquid interface (ALI) -cultuur.

Het genereren van 3D-bollen en 2D-lucht-vloeistofinterfaceculturen van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelcellen

Recente ontwikkelingen in door de mens geïnduceerde pluripotente stamceldifferentiatieprotocollen maken de stapsgewijze afleiding van orgaanspecifieke celtypen mogelijk. Hier geven we gedetailleerde stappen voor het onderhoud en de uitbreiding van iPSC-afgeleide luchtwegbasale cellen en hun differentiatie in een mucociliair epitheel in lucht-vloeistof interfaceculturen.

Generatie van luchtwegepitheelcel lucht-vloeistof interfaceculturen uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.

Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Lucht-vloeistof interfacecultuur wordt vaak gebruikt om pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te ontwikkelen door primaire normale menselijke bronchiale epitheelcellen te differentiëren die de apicale zijde van de longluchtweg nabootsen. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bepalen van de kwaliteit door de biofysische eigenschappen te monitoren, zoals ciliaire functie en membraanintegriteit.

Bepaling van de ciliaire functie en membraanondoorlaatbaarheid van het pseudogestratificeerde longluchtwegepitheel

Leer een protocol voor het kweken en uitbreiden van primaire humane bronchiale epitheelcellen uit verse bronchussegmenten. Deze methode omvat differentiatie op een lucht-vloeistof-interface voor onderzoek naar longgezondheid en ziekte.

Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

Meer video's verkennen