Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten

In dit artikel beschrijven we een protocol voor de groei en expansie van menselijke bronchiale epitheelcellen uit vers geïsoleerde menselijke bronchiale segmenten. Dit protocol bestaat uit vijf secties: coderen en krassen, honderd millimeter kweekplaten, herstellen van bronchiaal weefsel, explanttransplantaties van bronchiaal weefsel, passage van menselijke bronchiale epitheelcellen die gecilieerd groeien, en menselijke bronchiale epitheelcellen op transwells. Voordat u begint, dient u er rekening mee te houden dat alle stappen in de biologische veiligheidskast worden uitgevoerd.

Tenzij anders vermeld, lees dan de sectie over materialen, reagentia en preparatie en zorg ervoor dat u de basisvoorbereidingen heeft getroffen. De volgende zaken: coderen, stokoplossingcultuur, medium, dissociatie-oplossingen, coating en krassen; honderd millimeter kweekplaten dienen in de bst te worden uitgevoerd.

Houd alles steriel. Neem steriele kweekplaten van 100 mm en coatingoplossing. Breng met de BST-pipet 2 mL coatingoplossing aan op een plaat van 100 mm en draai deze rond om de bodem van de plaat te coaten.

Zorg ervoor dat de coatingoplossing de bodem van de plaat gelijkmatig bedekt. Pipetteer de resterende oplossing weg en gebruik deze om een tweede plaat van honderd millimeter te coaten. Herhaal dit voor zoveel platen als nodig is.

Het aantal benodigde platen varieert afhankelijk van het aantal weefselerexplantaten. Zorg ervoor dat de coatingoplossing de bodem van de platen gelijkmatig bedekt, zoals gedemonstreerd.

Dek de platen af met hun deksels. Laat de platen één tot twee uur drogen in de incubator en aspireer de overtollige oplossing vóór gebruik voor bronchiaal weefselexplantaat. Niet-gebruikte gecoate kweekplaten kunnen in een steriele zak worden geplaatst en bewaard worden bij vier graden Celsius voor later gebruik.

Reinig een kleine, scherpe schaar, een scalpel en pincetten met 70% ethanol door middel van spray en breng deze in de BSC. Maak krasjes in de gecoate platen door stevig met het scalpel te drukken om minimaal vier kleine, diepe X-vormige inkepingen per plaat te maken. Als de kras niet diep genoeg is, zullen de weefselstukjes niet in de spuiten bezinken en zullen ze gaan drijven. Plaats het weefsel buiten de BSC in een P3-schaal. Spoel het geïsoleerde menselijke bronchiale weefsel grondig uit met BSS.

Open de bronchiale stukken. Breng het weefsel in de BS en overdraag deze naar een steriele tissue culture plaat van 100 mm met gekoeld DMEM/F12 plus 1% antibioticum-antimycoticum. Gebruik de kleine scherpe schaar om het weefsel in blokjes van 2 tot 3 mm te snijden.

Plaats met een pincet één stukje gesneden weefsel in het midden van elke X en druk dit aan. Laat de weefselstukjes of X-explantaten enkele seconden rustig aan de plaat hechten. Voeg vervolgens voorzichtig 10 ml volledig medium toe. Als het weefsel na toevoeging van het medium blijft drijven, gebruik dan een pincet om het weefsel in de groeven van de X te duwen of maak een nieuwe X. Het kan nodig zijn om nieuwe X'en te maken als de groeven niet diep genoeg zijn.

Plaats de platen in de incubator en verschanpel het medium elke drie tot vier dagen tot de weefsels klaar zijn voor transplantatie. Wanneer er voldoende epitheelcellen rondom de weefsels zijn gegroeid om gebieden van één tot twee centimeter te bedekken, wat ongeveer vier weken duurt. Gebruik hiervoor gecoate en bekraste platen van honderd millimeter.

Aangezien sommige weefseleplantaties mogelijk niet succesvol zijn, is het aantal platen afhankelijk van het aantal stukjes weefsel dat wordt getransplanteerd. Als u platen gebruikt die eerder zijn gecoat en bij vier graden Celsius zijn bewaard, breng deze dan voor gebruik naar kamertemperatuur. Pak het weefsel voorzichtig met een pincet op uit de oorspronkelijke plaat, plaats het in het midden van de as in de nieuwe plaat en druk voorzichtig aan. Weefsels zonder uitgroei moeten worden weggegooid.

Laat het weefsel aan de plaat hechten. Voeg gedurende enkele seconden medium toe en incubeer. Voeg toe zoals eerder beschreven voor de X-uitleg.

Voeg twee ml trypsin- en EDTA-stokoplossing toe aan elke 100 mm weefselkweekplaat. Verdun de stokoplossing met zes ml steriele 0,01 M PBS en twee ml stokoplossing aan zes ml PBS voor een eindconcentratie van trypsin van 250 µg/ml en voor EDTA van 100 µg/ml. Aspireer na het verplaatsen van de explanten naar een nieuwe plaat het medium uit de platen met cellen in ringen van één tot twee centimeter.

Voeg acht ml warme verdunde druppels en een edt-oplossing toe aan elke plaat van honderd millimeter. Plaats deze in een incubator bij 37 °C gedurende drie tot 15 minuten. Controleer regelmatig.

Het te lang laten inwerken van trypsine zal de cellen beschadigen. Controleer de platen onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de meeste cellen zijn losgekomen; de cellen zullen rond worden en loslaten, zoals getoond bij acht Mils warmte. Voeg 10% FBS in medium per plaat toe om de EDTA-oplossing te inactiveren.

Combineer de volumes van alle platen in één buis of in afzonderlijke buizen per weefseltype. Tel de cellen met een Hema Cytometer na centrifugatie bij 100 g gedurende vijf minuten. Er zal een celpellet aan de bodem van de buis ontstaan; resuspendeer het celpellet in compleet medium tot de gewenste celconcentratie.

Plaats telkens twee tot 3 miljoen cellen per T 75-fles en voeg naar behoefte compleet medium toe. Incubeer en ververs het medium. Elke drie tot vier weken groeien de cellen tot subconfluentie in de D 75-flessen.

Na ongeveer vier weken moeten de cellen worden losgemaakt en uitgebreid, of gebruikt bij subconfluentie om senescentie te voorkomen. Begin met het voorbereiden van de permeabele membranen van de transwells. Gebruik de inserts van 6,5 millimeter die passen in de 24-wells platen.

Voeg medium toe aan beide zijden van het membraan. Zes honderd microliter aan de onderzijde en 0,1 ml aan de bovenzijde. Incubeer één uur in een celkweekincubator.

Verwijder voorzichtig het medium van beide zijden van het membraan. Begin eerst met het basale volume; wees voorzichtig, aangezien het membraan gemakkelijk beschadigd kan raken. Pipetteer het medium daarom langs de wand van de kweekinsert en gebruik het aanbevolen volume.

Als dit niet gebeurt, kan het medium lekken naar andere putjes waarin cellen zijn uitgezaaid. Pipetteer na pre-incubatie van de permeabele drager voorzichtig uw cel-suspensie op de apicale zijde van het membraan; voor putjes van 6,5 millimeter voegt u 0,1 ml van de cel-suspensie toe aan de apicale zijde van het membraan. Pipetteer 0,6 ml medium op de basale zijde van het membraan.

Voed de cellen gedurende 10 dagen vanaf de epicale en basale zijden. Voor het verkrijgen van een goed gedifferentieerde cultuur dient het medium tweemaal per week te worden vervangen. Verwijder het basale volume met de gedemonstreerde methode.

Vervang eerst het epicale volume door 0,6 ml medium aan de basale zijde van het membraan toe te voegen. Deze methode bevordert de aanhechting van cellen aan het membraan en voorkomt dat cellen gedurende lange perioden aan lucht worden blootgesteld. Vervang het medium snel en plaats de monsters terug in een incubator.

Creëer op dag 10 een lucht-vloeistofinterface door het AAL-medium te verwijderen en de 0.6 ml medium aan de basale zijde van het membraan te vervangen. Houd de cellen zes weken lang in de lucht-vloeistofinterface en verschoon het medium twee keer per week. Gecilieerde cellen zullen vier weken na de creatie van de interface verschijnen.

Vloeistofinterface. Cellen zullen een uniforme differentiatie tot gecilieerde cellen bereiken. Zes weken na creatie van de vloeistofinterface van het oor.

Menselijke bronchiale segmenten met gezonde epitheelcellen uit explantaten en transplantaten. In ons onderzoek ontstonden succesvolle culturen uit explantaten van het bronchiale weefsel in acht van de negen weefsels. Aangezien één van de explantaatculturen geïnfecteerd raakte, bereikten de ringen van epitheelcellen een straal van één tot twee centimeter in drie tot vier weken.

Succesvolle X-explantaten werden tot zes keer opnieuw gekweekt. Alle succesvolle culturen vertoonden bewijs van celmigratie binnen 48 uur na het begin van de transplantaties, of de X-explantaten vertoonden, zoals getoond in B, een kasseistructuur die kenmerkend is voor deze epitheelcellen, zoals te zien in B. In opeenvolgende figuren onthulde immuunkleuring van cytosine-preparaten van cellen uit het explantaat en cellen gezaaid op dekglasplaatjes dat alle cellen positief waren voor het epitheelspecifieke cytokeratine; menselijke subcultuur-bronchiale cellen die tot sub-confluentie zijn gegroeid in T 75-kolfjes worden hier getoond. Let op de kasseistructuur.

Menselijke subculturen van bronchiale cellen vertoonden een uniforme positieve immunostaining voor keratine en E.cadherine. Immunostaining met specifieke antilichamen tegen andere celtypen vertoonde geen aanwijzingen voor contaminatie van de culturen door fibroblasten, mesenchymale cellen of endotheelcellen. Raadpleeg voor meer details figuur vijf en de bijbehorende legenda in de tekst. Cellen die zijn gekweekt op permeabele polyester membranen of transwells met een vloeistofinterface differentieerden in gecilieerd epitheel, zoals hier gedemonstreerd; discard de cellen en hun transplantaten indien cellen met een andere morfologie dan hier gedemonstreerd beginnen te verschijnen. In dit protocol hebben we gedetailleerde methoden gepresenteerd voor de kweek en expansie van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen.

Studies op basis van menselijke cellen zijn nodig om belangrijke signaalpaden van mechanismen bij menselijke longziekten vast te stellen en voor toxiciteits- en farmacologisch onderzoek naar nieuwe geneesmiddelen. We hopen dat de hier beschreven methoden u zullen aanmoedigen om menselijke bronchiale epitheelcellen uit explantaten te kweken en deze cellen in uw studiesystemen te gebruiken. Bedankt en veel succes.