Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel II: Koolhydraten

Het bepalen van de matrixpolysaccharidesamenstelling en het kristallijne cellulosegehalte van plantencelmuren begint met gedroogd plantmateriaal, dat aan verschillende extracties wordt onderworpen. Het resulterende materiaal bestaat uitsluitend uit celwanden en wordt vervolgens gesplitst om de matrixpolysaccharidesamenstelling te bepalen. Het wandmateriaal wordt behandeld met een zwakke zuur om niet-kristallijne polysacchariden, die voornamelijk de hemocellulosen zijn, te hydrolyseren in hun monosacchariden.

De monosacchariden worden vervolgens omgezet in hun overeenkomstige vluchtige aldolacetaat, die vervolgens worden geanalyseerd en gekwantificeerd door gaschromatografie gekoppeld aan een massaspectrometer voor de bepaling van kristallijne cellulose. De wanden worden behandeld met het grafietreagens, een mengsel van zuren die niet-kristallijne wandcomponenten verwijderen. Het resterende kristallijne cellulose wordt afgebroken tot zijn monomeer glucose, die chemometrisch kan worden bepaald.

De bepaling van lignine-inhoud en samenstelling wordt gedemonstreerd in een andere J-videopublicatie getiteld Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part One Lignin. Hallo, ik ben Marcus Pauley, hoofd van de Wall Analytical Facility in het Great Lakes Bioenergy Research Center hier aan Michigan State University. Ik ben Cliff Foster, manager van de Cell Wall Analytical Facility.

Vandaag laten we u zien hoe u de samenstelling van de polysacchariden in het plantencelmuurmateriaal kunt bepalen, dat cellulose is in verschillende homocellulosen. Hier in het Great Lakes Bioenergy Research Center ontwikkelen we technologie om deze suikers om te zetten in biobrandstoffen. Om een optimaal plantaardig grondstof te identificeren, moeten we eerst beoordelen welke soorten suikers en hoeveelheid er in deze biomassa aanwezig zijn.

In een andere video getiteld Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls, part one Lignin, zullen we ons concentreren op de polyfenolanalyse. Dus laten we beginnen. Begin deze procedure door celwanden te isoleren.

Maal ongeveer 60 tot 70 milligram gedroogd plantmateriaal met 5,5 millimeter roestvrijstalen ballen in een twee mil SAR TED schroefdopbuis. Gebruik een REM-molen als een hoogdoorvoeralternatief, gebruik een maal- en doseerrobot genaamd eyewall zoals beschreven in deel een. Wanneer het malen voltooid is, verwijder de stalen ballen.

Ga door met het isoleren van celwanden en verwijder resterende zetmeel zoals getoond in deel een en beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Weeg twee milligram DS-zetmeelcelwandmateriaal af in een twee mil sared buis. Een hoogdoorvoerwijze om deze taak uit te voeren is de eyewall robot.

De robot neemt een buis met gemalen plantmateriaal en maakt een gat in de bodem van de buis. De doorboorde buis wordt vervolgens op een VI-voeder geplaatst. Een lege buis wordt op een weegschaal geplaatst en door vibratie onder de VI-voeder verschoven. Materiaal percoleert door het gat in de geladen bovenbuis in de lege onderbuis totdat de gewenste hoeveelheid materiaal is verzameld.

Voeg 100 microgram acetol toe als intern standaard. Spoel de buismuren met aceton om het celwandmateriaal op de bodem van de buis te verzamelen en laat het aceton zeer voorzichtig verdampen onder luchtstroom. Voer vervolgens zwakke zuurhydrolyse uit.

Voeg voorzichtig 250 microliter twee molaire trichloroazijnzuur of TFA toe aan elk monster, zorg ervoor dat er geen materiaal op de buismuren spat. Sluit de buizen goed af en incubeer gedurende 90 minuten in een verwarmingsblok op 121 graden Celsius. Koel vervolgens de verwarmingsblokken en monsters op ijs en centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 10.000 RPM.

Breng 100 microliter van de zure supernatant bevattende de gesolubiliseerde suikers van de matrixpolysaccharide over naar schroefdopbuisjes, zorg ervoor dat het pelletmateriaal niet wordt verstoord. Het pellet kan worden gebruikt voor de kristallijne cellulosetest. Laat de TFA verdampen in een glazen buis onder een zachte stroom lucht in een verdampingsapparaat.

Voeg 300 microliter propanol toe om overtollig zuur te verwijderen en verdampt bij 25 graden Celsius. Herhaal dit in totaal drie keer. Om identificatie van de monosacchariden door middel van gaschromatografie mogelijk te maken, voer een aldolacetaatderivatisering uit.

Eerst worden de monosacchariden gereduceerd tot hun overeenkomstige open ring aldolen, die vervolgens worden geacetyleerd. Raadpleeg het bijbehorende schriftelijke protocol voor gedetailleerde instructies. Elke stap van de procedure volgt het eerder getoonde protocol, toevoeging van reagens, incubatie, verdamping onder een luchtstroom, gevolgd door verwijdering van overtollig reagens door verschillende wasstappen.

In de laatste stappen worden de aldolacetaten geëxtraheerd. Voeg eerst 500 microliter ethylacetaat toe en slinger lichtjes. Voeg vervolgens twee milli van water toe, sluit de buizen af en draai, centrifugeer de buizen gedurende vijf minuten bij 2000 RPM om duidelijke gescheiden lagen te verkrijgen met ethylacetaat bovenaan met de Al Dettol-acetaten en water onderaan. Pipet 50 microliter van de ethylacetaatlaag in GCMS-buisjes met inserts, verdund door 100 microliter aceton toe te voegen aan de GC-buis en de GC-buis kan worden bewaard bij vier graden Celsius.

Als de GCMS-analyse niet onmiddellijk wordt voortgezet, injecteer de monsters in een gaschromatograaf die is uitgerust met een quadruple massaspectrometer. Raadpleeg het bijbehorende schriftelijke protocol voor kolom- en details van de run. Het uitgangsmateriaal voor het bepalen van het kristallijne cellulosegehalte kan geïsoleerd celwandmateriaal zijn of wandmateriaal dat al is behandeld met het zwakke zuur TFA, hetzij onmiddellijk na de zuurbehandeling of in opslagbare gedroogde vorm.

Na het verwijderen van overtollig TFA met isopropanol zoals eerder getoond, voegt u toe aan de TFA-pellet in de twee M sars tot de buis een M van up degra reagens gemaakt van azijnzuur, salpeterzuur en water, voeg een acht tot een tot twee volume-volumeverhouding toe. Sluit de buis goed af, draai en verwarm op een verwarmingsblok gedurende 30 minuten op 100 graden Celsius. Als gevolg van deze behandeling blijft alleen kristallijne cellulose over in de pellet.