Het testen van het vermogen van diffundeerbare signaalmoleculen om Embryonale Spinal Commissural Axonen Heroriënteer

Explantaten van het dorsale ruggenmerg worden gedissekeerd uit rattenembryo's en gekweekt in een driedimensionale collageengel tegenover cellen die een kandidaat-signaleringsmolecuul tot expressie brengen. Het vermogen van het signaleringsmolecuul om axonen die binnen het dorsale ruggenmerg-explantaat groeien te heroriënteren, wordt beoordeeld met behulp van immunohistochemie.

Hoi, ik ben Virginia Hazen van het laboratorium van Samantha Butler van de afdeling Biological Sciences aan de University of Southern California. Ik ben Keith Fun, ook van het Butler-lab. En ik ben Ken Ya Mai van het Butler-lab.

Vandaag tonen we u een procedure voor het kweken van dorsale spinale implantaten en aggregaten van getransfecteerde cost-cellen in een collageenmatrix. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om het vermogen van kandidaat-signaleringsmoleculen te testen om spinale neuronen te oriënteren. In dit experiment zullen we onderzoeken of bone morphogenetic protein, of BMP seven, kan fungeren als een chemorepellent.

Laten we beginnen. Bereid co-celaggregaten voor die worden gebruikt om het traject van comm-chorale axonen vanuit co-cellen uit te dagen. Deze zijn getransfecteerd met het expressieplasmid voor het molecuul van belang, in dit geval bone morphogenetic protein of BMP7.

Aspireer het medium uit de schaal en spoel de cellen met één milliliter 1X PBS. Verwijder de PBS en behandel de cellen gedurende 15 minuten met een halve milliliter enzymvrij cel-dissociatiemedium. Stop de reactie door één milliliter medium met foetaal runderserum toe te voegen.

Gebruik een 1000 µL pipetpunt om de cellen herhaaldelijk op te nemen tot er geen cellen meer op het oppervlak van de kweekschaal achterblijven. Breng de cellen over naar een 15 mL conische buis en pellet de cellen gedurende twee minuten. Verwijder bij 2000 RPM het supernatant en pipetteer herhaaldelijk om de cellen opnieuw te suspenderen.

Spot meerdere druppels van 20 µL van de celoplossing in 100 µL medium op de binnenzijde van een deksel van een 35 mm kweekschaal. Sluit het deksel op de schaal en plaats deze gedurende enkele uren in de incubator om de cellen te laten aggregeren. Houd voor het bereiden van dorsale ruggenmergimplantaten vers geoogste cellen beschikbaar.

Plaats E 11 rattenembryo's op ijs. Verwijder in L 15 medium met een verscherpte wolfraamnaald een sectie van vier tot zes somieten uit de rompstreek direct onder de knop van de voorpot van elk embryo. Verzamel het weefsel met een plastic pipet in één well van een vierdelige plaat.

Plaats de schaal op ijs. Wanneer alle segmenten zijn gedisseceerd, gebruik dan de pipet om de stukjes over te brengen naar een tweede putje van de schaal met L 15 medium plus disc paste. Incubeer het weefsel gedurende maximaal vijf minuten bij kamertemperatuur.

Om celdood te voorkomen, mag het weefsel niet te lang worden gedigesteerd. Voeg één milliliter vers L 15-medium met 5% hitte-geïnactiveerd geitenserum toe aan de derde put van de schaal. Draag vervolgens de weefselstukjes over naar deze put.

Laat het weefsel na afloop van de incubatie in de dis space een uur rusten op ijs. Om de daaropvolgende dissectie in een microcentrifugebuis te vergemakkelijken, voegt u 40 µL van 10 x minimal essential medium toe aan 360 µL collageen. Vortex kortstondig om te mengen en centrifugeer kort in een picofuge.

De oplossing zal geel zijn en moet zoveel mogelijk op ijs worden bewaard om te voorkomen dat het collageen stolt. Titreer voor elke batch collageen met een hoeveelheid 0,8 molair natriumbicarbonaat tot de collageenoplossing licht oranje wordt. Meng de oplossing na elke toevoeging. Wanneer de collageenoplossing deze kleur heeft, blijft deze vloeibaar als deze op ijs wordt bewaard, maar is deze klaar om te stollen bij kamertemperatuur. Als de oplossing na het mengen roze wordt, begin dan opnieuw met een nieuwe buis collageen met medium. Spot 20 µL collageen in elke put van een schone vier-put plaatschaal.

Verspreid het collageen met de punt van de pipette om een klein schijfje te vormen. Laat het collageen ongeveer 10 minuten uitharden bij kamertemperatuur. Verwijder onder de dissectiemicroscoop met een vers geslepen wolfraamnaald en een fijne pincet het mesoderm rondom het ruggenmerg van één embryo met de wolfraamnaald; verwijder vervolgens het ventrale deel van het ruggenmerg, dat kan worden herkend aan de aanwezigheid van de bodemplaat.

Aan de meest ventrale rand is de vloerplaat iets dikker dan de dakplaat aan de dorsale rand. In dit voorbeeld ligt het ruggenmerg met de ventrale zijde naar beneden. Snijd het weefsel voorzichtig parallel aan de vloerplaat en verwijder het ventrale vijfde deel van het ruggenmerg.

Gebruik de naald om het dorsale ruggenmergexplan verticaal te bisecteren. Zorg ervoor dat de randen zo schoon mogelijk zijn gesneden en trim deze indien nodig opnieuw bij. Gebruik een mondpipet voorzien van een glazen capillaire buis met een diameter van 0,5 millimeter om elk x explan over te brengen naar een apart collageenkussen.

Snijd met de wolfraamnaald het aggregaat van getransfecteerde co-cellen in vierkantjes met ongeveer dezelfde breedte als de laterale rand van het dorsale ruggenmerg. Gebruik een mondpipet om een van de vierkantjes op het collageenkussentje met de x-explant te plaatsen. Gebruik de mondpipet om eventueel overtollig vloeistof weg te zuigen.

Aspireer niet te veel, aangezien een kleine hoeveelheid vloeistof helpt bij de daaropvolgende applicatie van collageen; breng 4 µL geprimed collageen aan op het kussentje. Gebruik de wolfraamnaald om het collageen over de implantaten te verplaatsen zonder het weefsel rechtstreeks aan te raken. Door de naald in het collageen te bewegen, oriënteert u elke x explan zodanig dat het co-celaggregaat zich naast de laterale rand bevindt.

Laat het collageen 15 tot 20 minuten uitharden. Herhaal het applicatieproces met nog eens vier µL collageen om ervoor te zorgen dat de x explan volledig in collageen is ingekapseld voordat u overgaat naar het volgende embryo in een weefselkweekkap; voeg 0,5 mL medium toe en kweek dit gedurende 30 tot 40 uur in een incubator. Fixeer de explantaten in een zuurkast met 0,5 mL 4% Paraformaldehyde-oplossing in PBS gedurende 45 minuten. Was het weefsel, terwijl dit op ijs wordt bewaard, twee keer met 0,5 mL van de blokkerings- en permeabilisatielossing PBTN.

Incubeer de x explantaten in blokkeeroplossing bij vier graden Celsius, bij voorkeur overnight. Gebruik een pincet om de X explantaat uit de vierputjesplaat te knippen en plaats elk explantaat in een putje van een 48-well plaat.

Voeg 200 µL primair antilichaam toe aan elke well. Om commissurale axonen te visualiseren, wordt een muis anti-Ttag-antilichaam gebruikt en om te bepalen of de transfectie van cross-cellen succesvol was, wordt een antilichaam tegen het geteste molecuul toegevoegd. Incubeer dit gedurende de nacht bij 4 °C.

Was elk monster vijf keer in PBTN-blokkeeroplossing gedurende één uur per wasbeurt bij vier graden Celsius. Verwijder de PBTN en voeg 200 microliters secundair antilichaam toe aan elk monster. Bedek de wells met aluminiumfolie om bleken te voorkomen en incubeer ze gedurende de nacht bij vier graden Celsius.

Was de monsters vijf keer in PBTN zoals eerder beschreven. Breng elke explantaat over naar een objectglas met drie putjes. Verwijder overtollige vloeistof, breng Invecta Shield-medium aan en dek af met een dekglas.

Bewaar de preparaten in een lichtdichte map of doos bij vier of minus 20 degrees Celsius totdat ze klaar zijn voor visualisatie onder de microscoop. Nu tonen we enkele representatieve beelden van x explantaten nadat deze zijn gekweekt, gefixeerd, gekleurd en afgebeeld via confocale microscopie. Paneel A laat zien dat een X explantaat van de dakplaat, omlijnd in wit, de tag one positieve chorale axonen van zich af kan heroriënteren, wat aantoont dat de dakplaat de bron is van een axonale chemorepellent. Paneel B laat zien dat co cellen die het M tact signaleringsmolecuul, botmorfogenetisch proteïne of BMP seven uitscheiden, carcerale axonen op een vergelijkbare manier als de dakplaat kunnen afstoten.

Axonen van cellen die alleen het expressieplasmidi uitscheiden, hebben geen effect op de oriëntatie van axonen. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u ruggenmergexplantaat kunt dissekeren, oriënteren en cultureren en celaggregaten kunt aanbrengen om te bepalen of een kandidaat-signaalmolecuul axonale heroriëntatieactiviteit bezit. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het collageen zoveel mogelijk op ijs te bewaren en het explantaat volledig in collageen in te kapselen, zodat het niet in direct contact komt met het cultuurmedium.

En tot slot: kweek de cellen slechts zo lang als nodig is om de axonen tot aan de ventrale rand van het x explantaat te laten groeien. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.