Name: Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Leer de geoptimaliseerde fibrinegel bead assay voor het bestuderen van angiogenese in vitro. Deze methode toont sprouting, lumenformatie en vertakking van bloedvaten met time-lapse beeldvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VOORBEREIDEN CELLEN <ol><li> Brengen HUVEC en fibroblasten in M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 dagen voor de kralen. </li><li> Schakelaar middellange tot EGM-2 (Clonetics) de dag voor beading voor HUVEC en de dag voor inbedding van fibroblasten. </li><li> Een concentratie van ~ 400 HUVEC per kraal is nodig. </li><li> 20.000 fibroblasten per goed is nodig. </li></ol> Coaten van de parels MET HUVEC - dag-1 <ol><li> Trypsinize HUVEC. </li><li> Laat kralen om zich te vestigen (NIET CENTRIFUGE!). Zuig het supernatant en kort was de kralen in een ml warm EGM-2 medium. </li><li> Mix 2500 kralen w / 1x10 6 HUVEC in 1,5 ml warm EGM-2 medium in een FACS buis. Verticaal plaats het in de incubator. (Dit zal genoeg zijn voor ~ 10 wells. Schaal indien nodig) </li><li> Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C, het schudden van de buis om de 20 minuten. (Een goede coating is van cruciaal belang voor kiemen.) </li><li> Na 4 uur, de overdracht van de gecoate parels aan een T25 kolf in 5 ml van de EGM-2 en laat O / N. </li></ol> INBEDDING gecoate parels in fibrine GEL - DAG 0 <ol><li> Bereid de 2,0 mg / ml fibrinogeenoplossing (zie recept sectie). </li><li> Voeg 0,15 Eenheden / ml aprotinine aan de fibrinogeen-oplossing. </li><li> Transfer gecoate kralen om een ​​15 ml conische buis en laat de kralen af ​​te wikkelen. Resuspendeer kralen in 1 ml van de EGM-2 en transfer naar een 1,5 ml centrifuge buisje. </li><li> Was de kralen 3X met 1 ml van EGM-2 door pipetteren op en neer LANGZAAM. </li><li> Rekenen kralen aan een dekglaasje en resuspendeer in fibrinogeen-oplossing bij een concentratie van ~ 500 kralen / ml. </li><li> Voeg toe 0.625 Eenheden / ml trombine aan elk putje. </li><li> Voeg 0,5 ml van de fibrinogeen / kraal ophanging aan elk putje van een 24-well plaat. Wijzig de pipetpunt voor elk goed! </li><li> Meng de trombine en de fibrinogeen door te gaan op en neer voorzichtig met de pipetpunt ~ 4 tot 5 keer. Wees voorzichtig om geen grote bubbels te maken. </li><li> Laat de plaat gedurende 5 minuten in de motorkap, en plaats deze in de 37 ° C-incubator voor 10-15 minuten tot een stolsel te genereren. </li><li> Tijdens het wachten op het stolsel, trypsinize fibroblasten. </li><li> Voeg 1 mL van EGM-2 per well druppelsgewijs. </li><li> Zaad fibroblasten op de top van fibrine-gel met een concentratie van 20.000 cellen per well. </li></ol> OPMERKINGEN: Meestal, wanneer de fibrine gel is gevormd, ziet u kleine luchtbelletjes in de gel. Maak je geen zorgen, zullen ze verdwijnen in 3-4 dagen. Wijzig de media om de andere dag, dat wil zeggen, Dag 2, 4, 6, enz. .. Op dag 3 of 4 moet je beginnen te zien kiemen.

<ol><li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microcarrier-based+cocultivation+system+for+the+investigation+of+factors+and+cells+involved+in+angiogenesis+in+three-dimensional+fibrin+matrices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro.</a> Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).</li>
</ol>

Er is een groeiende consensus dat de drie-dimensionale (3D) in vitro angiogenese assays een model dat veel dichter bij de werkelijke omgeving in vivo dan kan worden bereikt met behulp van 2D-culturen aan te bieden. Het is duidelijk dat een superieure 3D-systemen moet reproduceerbaar zijn, en in staat zijn om een ​​aantal van de belangrijkste stappen van angiogenese na te bootsen. Terwijl verscheidene eerdere 3D-testen zijn ontwikkeld, veel van deze beide te gebruiken hard-to-verkrijgen van microvasculair cellen, of slechts recapituleren een...

<table><tbody><tr><td>Cytodex-3 beads</td><td>Reagens</td><td>Amersham</td><td>17-0485-01</td><td>10 g/fles. 1. Hydrateer en laat 0.5 g droge beads zwellen in 50 mL PBS (pH = 7.4) gedurende ten minste 3 h bij RT. Gebruik een 50 mL buis en plaats deze op de rocker. 2. Laat de beads bezinken (~ 15 min). Verwijder het supernatant en was de beads enkele minuten in verse PBS (50 mL). 3. Verwijder de PBS en vervang deze door verse PBS: 25 mL -&amp;gt; 20 mg/mL =&amp;gt; 60000 beads/mL of 50 mL -&amp;gt; 10 mg/mL =&amp;gt; 30,000 beads/mL. 4. Plaats de beadsuspensie in een gesiliconiseerde glazen fles (Windshield Wiper of Sigmacote). 5. Steriliseer de beads door autoclaveren gedurende 15 min bij 115&amp;#x00B0;C. 6. Bewaar bij 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-1153</td><td>10 mg/fles. Reconstitueer geliofiliseerd aprotinine tot 4 U/mL in DI-water. Steriel filteren. Maak aliquoten van elk 1 mL. Bewaar bij -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogeen Type I</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8630</td><td>1 g. Los 2 mg/mL fibrinogeen op in DPBS. Noteer het % stolbaar eiwit en pas dit dienovereenkomstig aan. Verwarm in een waterbad van 37 &amp;#x00B0;C om het fibrinogeen op te lossen. Meng door de buis om te keren. Niet vortexen. Steriel filteren via 0.22 µm.</td></tr><tr><td>Trombine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3399</td><td>22 mg = 1.000 units. Reconstitueer in steriel water tot 50 U/mL. Maak aliquoten van elk 0.5 mL. Bewaar bij -20 &amp;deg;C.</td></tr></tbody></table>

geoptimaliseerde fibrinegel bead assay voor de studie van angiogenese

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenese is een complexe multi-step proces, waarbij, in antwoord op angiogene stimuli, nieuwe schepen worden gemaakt van de bestaande bloedvaten. Deze stappen zijn: afbraak van de basale membraan, proliferatie en migratie (ontspruiten) van endotheelcellen (EC) in de extracellulaire matrix, de uitlijning van de EC in de koorden, vertakking, lumen vorming, anastomose, en de vorming van een nieuwe kelder membraan. Velen in vitro testen zijn ontwikkeld om dit proces te bestuderen, maar de meeste alleen maar na te bootsen bepaalde stadia van de angiogenese, en morfologisch de schepen binnen de tests vaak niet lijken op schepen in vivo. Op basis van eerder werk van Nehls en Drenckhahn, hebben we een geoptimaliseerd in vitro angiogenese-test dat de menselijke navelstreng EG en fibroblasten gebruikt. Dit model recapituleert alle van de belangrijkste vroege stadia van angiogenese en, belangrijker nog, de schepen weer te geven patent intercellulaire lumen, omringd door gepolariseerd EC. EG worden gecoat op cytodex microdragers en ingebed in een fibrine gel. Fibroblasten zijn gelaagd op de top van de gel, waar zij nodig oplosbare factoren die de bevordering van EG-ontspruit uit het oppervlak van de kralen. Na een aantal dagen, talloze schepen aanwezig zijn die gemakkelijk kunnen worden waargenomen onder fase-contrast-en time-lapse microscopie. Deze video toont de belangrijkste stappen bij het opzetten van deze culturen.

Deze video toont het protocol van een in vitro angiogenese test die recapituleert verschillende stadia van angiogenese. Time-lapse beelden van kiemen, lumen vorming, vertakking en anastomose - belangrijkste kenmerken van angiogenese - worden weergegeven.

Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese

Angiogenese is een complex proces uit meerdere stappen, waarbij, als reactie op angiogene stimuli, nieuwe vaten worden gevormd uit de bestaande vasculatuur. Deze ...

Hoi, mijn naam is Mar Katsu. Ik kom van het Hughes Lab van de afdeling Molecular Biology and Biochemistry aan uc Irvine. Ik zal de fibrinie-bead-assay uitvoeren.Het volledige proces duurt twee dagen. Op de eerste dag worden de beads gecoat met pubieke cellen of menselijke endotheelcellen uit de navelvene. Op de tweede dag worden deze gecoate beads ingebed in fibrinegels, waarna er een laag fibroblasten op deze gels wordt aangebracht.We gebruiken deze assay om de vele stappen van angiogenese in een in vitro setting te bestuderen. Op de eerste dag in deel één gebruiken we CY X three Beads. Vervolgens gebruiken we op de tweede dag deze drie reagentia: fibrinogeen, trombine en aprotinine cytx.De kralen drie zijn afkomstig van Amazon Biosciences en zijn specifiek gecodeerd met collageen, zodat de endotheelcellen aan de kralen hechten. Het volgende reagens is fibrinogeen, dat we bij Sigma betrekken. Dit vormt de eigenlijke gel of stolsel in de bead-assay.Thrombine is een stollingsfactor. Dit eiwit zet fibrinogeen om in fibrine, en daarom voegen we het toe aan de assay. Aprotinine is een serumprotease-remmer.We gebruiken dit om te voorkomen dat proteasen het fibrinegel afbreken. Wat u hie

optimized-fibrin-gel-bead-assay-for-the-study-of-angiogenesis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a modified microcarrier beads-based assay incorporating pericytes to study endothelial sprouting during the early stages of angiogenesis. The assay provides an in vitro experimental model to understand molecular mechanisms of angiogenesis and the effect of anti-angiogenetic therapeutics.

Bead Sprouting Assay for Early-Stage Angiogenesis Assessment: An In Vitro Bead-Based Model to Study Endothelial Sprouting in the Presence of Pericytes

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Een overzicht van de orgaanspecifieke micro-omgeving, die lokale angiogenesis stimuleert, is onmisbaar voor succesvolle regeneratie van beschadigde weefsels. Dit rapport demonstreert een nieuwe methode om fibrinegels op het longoppervlak van een levende muis te implanteren om te onderzoeken hoe de longspecifieke micro-omgeving angiogenese en alveolaire regeneratie bij volwassen muizen moduleert.

Implantatie van fibrinegel op Muis Lung naar Lung-specifieke angiogenese

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Dit protocol presenteert een kraal roman in vitro assay dat meer modellen op de juiste wijze het proces van in vivo angiogenese kiemen door pericytes op te nemen. Deze wijziging maakt het mogelijk de bepaling van de kraal te recapituleren meer getrouw de heterotypic cellulaire interacties tussen endotheliale cellen en muurschildering cellen die essentieel zijn voor angiogenese.

Integratie van Pericytes in een parel van de Endothelial cel kiemen Assay

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van de pathofysiologie van proliferatieve diabetische retinopathie met behulp van patiënt-afgeleide, operatief verwijderd, fibrovascular weefsels voor driedimensionale inheemse karakterisering en ex vivo weefselkweek. Dit ex vivo cultuur model is ook vatbaar voor testen of ontwikkelen van nieuwe behandelingen.

Een Ex Vivo weefselkweek Model voor Fibrovascular complicaties in proliferatieve diabetische retinopathie

Deze methode beschrijft de cultuur van door IPSC afkomstige endotheliale cellen als 40 geperfundeerd 3D Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch platform. Dit platform maakt de studie mogelijk van gradiënt-gedreven angiogene kiemen in 3D, inclusief anastomose en stabilisatie van de angiogene spruiten op een schaalbare en hoge doorvoer wijze.

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.

Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies

Mechanisch geïsoleerde stromale vasculaire fractie (SVF) in combinatie met een fibrine-hydrogel biedt een gemakkelijke en efficiënte drager voor levensvatbare, van vet afgeleide stromale cellen voor verschillende indicaties, waaronder weefselmanipulatie en/of wondgenezingsdoeleinden. Hier presenteren we de bereiding van een mechanisch SVF (mSVF)-fibrine hydrogelconstruct voor translationeel onderzoek en klinische toepassing.

De combinatie van mechanisch geïsoleerde stromale vasculaire fractie en fibrinehydrogel: een verwerkingsprotocol

Hier presenteren we een fibrinogeen-polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) protocol om de fibrinogenolytische middelen van Sipunculus nudus snel te scheiden en weer te geven.

Snelle scheiding en weergave van actieve fibrinogenolytische middelen in Sipunculus nudus door middel van fibrinogeen-polyacrylamide-gelelektroforese

Leer de geoptimaliseerde fibrinegel bead assay voor het bestuderen van angiogenese in vitro. Deze methode toont sprouting, lumenformatie en vertakking van bloedvaten met time-lapse beeldvorming.

Geoptimaliseerde fibrinegel Bead Assay voor de Studie van Angiogenese

Meer video's verkennen