Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Dit protocol gebruikt een reguleerbare promotor die gecontroleerde expressie van eiwitten mogelijk maakt. In dit experiment gebruiken we een hoogkopie twee micron plasmide dat het N twee domein tot expressie brengt vanuit een met een methionine onderdrukkbare promotor. Wilde gistcellen worden hiermee getransformeerd.

Plasmid en transformanten worden geselecteerd op platen zonder uol. Na overnacht groei. In selectief medium worden cellen gesynchroniseerd door groeionderbreking door cortisol.

Ten slotte wordt expressie geïnduceerd door cellen over te brengen naar medium zonder methionine tijdens het verloop van het experiment. Eiwitconcentratie wordt bewaakt door western blotting en morfologische fenotypeontwikkeling door microscopie. Hallo, ik ben Claudia van de afdeling Biologische Wetenschappen, Purdue University.

Ik ben de Bari Muji in de alar en ik ben ook in de AL-lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor analyse van de ontwikkeling van een morfologisch fenotype als functie van eiwitconcentratie in body induct. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de morfologische en moleculaire aspecten van een celdelingfenotype te bestuderen dat wordt waargenomen bij overexpressie van de N twee domein van het endocytische adaptieve eiwit absent two.

Dus laten we beginnen. Dit protocol begint met de constructie van een giststam die uw eiwit van belang tot expressie zal brengen. In ons geval hebben we de wilde giststam W 3 0 3 getransformeerd met hoogkopie plasma DNA dat nth twee bevat onder de controle van de methionine onderdrukkbare promotor twee millimolair methionine onderdrukt met 25 promotoractiviteit.

Terwijl medium zonder methionine maximale expressie toestaat, pluk zes kolonies van een plaat met recent getransformeerde cellen en inoculeer in 50 milliliter selectief medium met 0,2 millimolair methionine in een conische kolf, incubeer een nacht bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM. Op de volgende ochtend schat de celdichtheid door de optische dichtheid van de cultuur te meten bij 600 nanometer. Breng het equivalent van 20 OD 600 nanometer per milliliter cellen over naar een steriele centrifugeerbuis en verzamel door centrifugatie.

Suspenseer de cellen opnieuw in YPD medium door te vortexen om de celcyclussynchronisatie aole te laten verlopen tot een eindconcentratie van 15 microgram per milliliter van een voorraad van één milligram per milliliter in DMSO. Incubeer gedurende vier uur bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM. Na vier uur controleert u het percentage cellen dat gearresteerd is in mitose.

Door onder de microscoop te kijken en het aantal cellen met knoppen van gelijke grootte te tellen, gaat u door naar de volgende stap. Alleen als de arrestatie groter is dan 90%Verzamel de cellen door centrifugatie bij 2200 RPM gedurende vijf minuten. Na drie wasbeurten met ijswater, suspendeert u de pellet opnieuw in selectief medium zonder methionine bij een celdichtheid van ongeveer 0,5 OD 600 nanometer per milliliter.

Breng de helft van het volume cellen over naar een nieuwe steriele buis en voeg methionine toe tot een eindconcentratie van 0,2 millimolair. Dit zal dienen als controle voor effecten van basale niveaus van eiwitexpressie. Breng beide culturen terug naar de incubator van 30 graden Celsius.

Cellen worden elk uur gedurende zes uur geanalyseerd voor fenotypeontwikkeling. Breng een milliliter celsuspensie van elke cultuur over naar een steriele micro fugebuis en verzamel de cellen door centrifugatie, aspireer het supernatant en suspendeer het pellet in 70 microliter medium. Voeg vervolgens 30 microliter methyleenblauw toe van een voorraad van één milligram per milliliter in steriel water.

Pipet vervolgens ongeveer zes microliter van deze suspensie op een schone glazen plaat en plaats een dekglas boven de druppel. Druk het dekglas voorzichtig om een dunne, uniforme laag cellen te vormen tussen de glasinterfaces. Verdeel het dekglas in negen kwadranten en neem drie beelden per kwadrant.

Het aantal cellen per veld mag niet groter zijn dan 30 cellen om nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken. Tel het aantal cellen dat het fenotype vertoont dat wordt onderzocht, dat in dit voorbeeld knopvormende gistcellen zijn met verlengde en/of geconcateneerde knoppen die niet van elkaar scheiden. We tellen ook het aantal dode cellen geïdentificeerd door hun blauwe kleur, aangezien de celdelingsdefect geïnduceerd bij nth.

Twee overexpressie leidt tot celdood om fenotypespecifieke defecten op elk moment te visualiseren. Breng een milliliter cultuur over in een steriele micro fugebuis en verzamel cellen door centrifugatie. Suspendeer het cellenpellet in 100 microliter van een milligram per milliliter, calor witte oplossing in steriel water en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Kleuring met calor wit maakt visualisatie van de e-celwand mogelijk. Was het pellet drie keer met een XPBS. We suspenderen het uiteindelijke pellet in 100 microliter PBS.

Observeer de cellen onder de microscoop en verzamel beelden bij 100 x vergroting met behulp van UV-optica voor visualisatie van de celwand. Om GFP-gelabelde septine te visualiseren, verzamel beelden met behulp van een FS E-filter. Kwantificeer het percentage cellen met celwanddefecten en septine mislokalisatie met behulp van de eerder getoonde methode door het dekglas in negen kwadranten te verdelen en drie beelden per kwadrant te nemen voor telling. TijdLapse videomicroscopie van enkele gistcellen vereist media-ingebedde agrosbedden om een agrosbed te maken.

Reinig eerst een glazen plaat met een holle verdieping met 70%alcohol en laat deze drogen terwijl de plaat aan het drogen is. Kook 0,06 gram agros in vijf milliliter selectief medium zonder methionine in een magnetron tot de agros volledig en snel is opgelost. Pipet 200 microliter van de agros bevattende media in de plaat.

Druk een andere schone glazen plaat om de depressie en zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder zijn gevangen. Wanneer de gel is gestold, beweeg de plaat erbovenop soepel weg van de depressieplaat, waarbij hun oppervlakken altijd parallel blijven. Dit zorgt ervoor dat het oppervlak van de agrosbed gelijk is aan het oppervlak van de depressieplaat.

Reinig he