Identificatie van groeiremming fenotypes geïnduceerd door expressie van bacteriële type III Effector in gist

Om dit protocol te starten, selecteert u een vector voor de expressie van uw gewenste bacteriële effector. In gist en giststammen wordt de vector vervolgens getransformeerd in gistcellen. Daarna wordt de expressie van de effector geïnduceerd.

Geïnduceerde cellen worden gelyseerd voor een daaropvolgende western blot-analyse om de expressie van de effector te verifiëren. Na bevestiging van de expressie van de effector worden de cellen gekweekt en worden seriële verdunningen in een factor tien op represserende en inducerende media geplaatst. Ten slotte wordt na twee tot drie dagen de gistgroei geanalyseerd.

Hoi, ik ben Do Solomon van het laboratorium van Dr. Guido Cesa van de afdeling Plantwetenschappen aan de Universiteit van Tel Aviv. Vandaag laten we u een procedure zien voor de identificatie van groeiremmende fenotypes die worden geïnduceerd door de expressie van bacteriële type drie-effectoren in gist. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de functie van type drie-effectoren van gramnegatieve pathogene bacteriën te bestuderen en het is een hulpmiddel dat ons ondersteunt bij de identificatie van de TIC-targets van de effector.

Laten we beginnen. Bij het ontwerpen van een gist-systeem dat geschikt is voor de expressie van de type drie effectoren waarin men geïnteresseerd is, moeten verschillende belangrijke factoren worden overwogen en geoptimaliseerd. De eerste factor is de promotor die de expressie van de effectoren aanstuurt.

Omdat bacteriële type three-effectoren toxisch kunnen zijn voor gistcellen, moet een induceerbare promotor worden gebruikt om hun expressie te controleren. In dit experiment gebruiken we de GAL1-promotor. De tweede factor is het kopiegetal van het effectorgen.

Hoge expressieniveaus worden bereikt wanneer het effectorgen wordt gedragen door een twee-micron-plasmide. Intermediaire expressie wordt verkregen door gebruik te maken van een plasmide met een centromeer, en lage expressie wordt bereikt wanneer het effectorgen via homologe recombinatie in het gistgenoom wordt geïntegreerd. Een derde factor die in overweging moet worden genomen, is de epitope-tag die wordt gebruikt om de eiwitexpressie te verifiëren in gevallen waarin antilichamen tegen de betreffende effector niet beschikbaar zijn.

Veelgebruikte tags zijn M hemagglutinine HA of flag, waarvoor betrouwbare commerciële antilichamen beschikbaar zijn. We raden aan om slechts één kopie van de tag te gebruiken om ongewenste schadelijke effecten op de structuur en activiteit van het effector-eiwit te minimaliseren. Tot slot moet de giststam die voor expressie wordt gebruikt, tropisch zijn voor de selecteerbare marker van de expressievector.

Om gistcellen voor transformatie te kweken, wordt een gistkolonie van een verse plaat gepikt en worden drie milliliter YPD in een polypropylene buis van 15 milliliter geinoculeerd via vortexen. Plaats de cultuurbuis kort in een roller en incubeer deze overnight bij 30 °C met constante rotatie. Verwijder de volgende ochtend de cultuur uit de roller en centrifugeer deze 5 minuten bij 800 ×g op kamertemperatuur.

Verwijder na centrifugatie het supernatant volledig en resuspendeer de cellen in één milliliter Resus suspensiebuffer door ongeveer 10 seconden te vortexen op maximale snelheid. Breng voor elk te transformeren plasmide en voor een extra controletransformatie 100 microliters van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuisje. Voeg aan elk buisje, behalve aan het controlebuisje, vijf microliters enkelstrengs zalmsperma-DNA en 250 tot 500 nanogram plasmide-DNA toe.

Voeg vervolgens voorzichtig 650 microliters transformatieoplossing toe aan elke buis en vortex. Incubeer de buizen 30 minuten bij 30 graden Celsius op een roller. Wanneer de incubatie voltooid is, voegt u 70 microliters DMSO toe aan elke buis en mengt u door de buizen 10 tot 15 keer om te keren om te voorkomen dat de cellen kapot gaan.

Vortex de buisjes niet. Plaats de buisjes in een voorverwarmd waterbad van 42 °C en incubeer gedurende 15 minuten. Verwijder de buisjes na 15 minuten uit het waterbad en plaats ze onmiddellijk twee minuten op ijs.

Zodra de buisjes zijn afgekoeld, worden de cellen geoogst door middel van centrifugatie, waarna een pipetteur wordt gebruikt om het viskeuze supernatant voorzichtig te verwijderen. Resuspendeer elk pellet in 150 µL steriel dubbel gedestilleerd water en verspreid de celsuspensie op een plaat met het geschikte selectieve medium. Laat de platen twee minuten openstaan om te laten drogen in een laminaire flowkast.

Plaats de platen vervolgens gedurende twee tot drie dagen in een incubator op 30 °C om de gistcellen te laten groeien. Inoculeer voor het bereiden van een eiwitextract drie milliliter van het juiste represserende medium met een gistkolonie van een verse plaat en vortex deze. Plaats de kweekbuis de volgende dag kort in een roller op 30 °C.

Verwijder de cultuur van de roller en centrifugeer deze 5 minuten bij 800 Gs op kamertemperatuur, verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet. Meng drie milliliter steriel DDW door middel van vortexen, centrifugeer opnieuw, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in drie milliliter steriel DDW. Draag nu 200 microliter van de celsuspensie over naar een nieuwe buis van 15 milliliter die drie milliliter van het juiste inductiemedium bevat en meng dit door middel van vortexen.

Plaats de buis in een roller en incubeer deze overnacht bij 30 °C. Breng de volgende ochtend 1 mL van de cultuur, of meer bij culturen met een lage dichtheid, over naar een microcentrifugebuis. Oogst de cellen door centrifugatie bij 800 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur; werk vanaf dit punt in een zuurkast om inademing van toxische Beamer capto ethanol-dampen te voorkomen.

Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipetteerder en resuspendeer de celpellet in 100 µL ijskoude lysisoplossing. Meng krachtig door te vortexen en incubeer 30 minuten op ijs. Bepaal tijdens de incubatie van 30 minuten het volume aan zes normale zoutzuur dat nodig is om 100 µL lysisbuffer te titreren naar een pH van 9 tot 10.

Om dit te doen, voegt u verschillende volumes zoutzuur toe aan 100 µL lysisbuffer in 10 verschillende buisjes en controleert u de pH van de oplossing met een pH-indicatorstrip aan het einde van de incubatie bij het juiste volume zoutzuur in het lysaat, waarna u mengt door te vortexen. Voeg vervolgens 50 µL van een drievoudige monsterbuffer toe aan het lysaat en meng door te vortexen; prik met een naald een gaatje in de dop van het microcentrifugebuisje en kook de lysaatoplossing vijf minuten lang op een warmteblok. Laat de oplossing na het koken twee minuten afkoelen bij kamertemperatuur.

Vortex vervolgens de lysaatoplossing en centrifugeer deze 10 seconden. Het lysaat is nu klaar voor immuno-bloedanalyse om de cellen voor de spotting-assay voor te bereiden. Kweek de volgende dag drie milliliter culturen van elke stam, zoals eerder beschreven.

Bereid twee platen voor met synthetisch compleet medium zonder leucine. Het medium van de ene plaat moet worden aangevuld met 2% glucose en dat van de andere plaat met 2% lactose en 1% raffinose. Droog de platen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een steriele laminaire flowkast.

Oogst de cellen en resuspendeer elk celpellet in drie milliliter steriel DDW. Herhaal de centrifugatiestap en resuspendeer de cellen opnieuw in drie milliliter steriel DDW. Bepaal de optische dichtheid of OD van elke cultuur en bereid vervolgens in steriele microfiche-buisjes cel-suspensies van één milliliter met een OD 600 van één voor.

Bereid vervolgens voor elke cel-suspensie drie vervolgverdunningen van factor 10 door gebruik te maken van drie steriele microcentrifugebuisjes gevuld met 900 µL steriel dubb gedestilleerd water (DDW). Plaats de droge platen op een raster en spot voor elke cultuur 10 µL van de vier verdunningen in een rij. Laat de platen na het spotten enkele minuten openstaan in de zuurkast.

Wanneer de vlekken droog zijn, worden de platen afgedekt en geplaatst in een incubator van 30 °C voor twee tot drie dagen. Nu tonen we de resultaten van een yeast spotting assay voor de detectie van groeiremming. Fenotypes geïnduceerd door expressie van type drie effectoren, hier de type drie effectoren AVRpt2, AvrAA1 en AvrRe1 van de bacterie.

Pseudomonas Riner pathogeen van onze tomaat werd tot expressie gebracht vanuit een centromeer-bevattend plasmide in een giststam op represserend medium; giststammen die het plasmide voor de expressie van A-V-R-P-T-O en HOP AA one one droegen, vertoonden een vergelijkbare groei als de controlestam met een lege vector. Terwijl gist met AAV RE one een licht verminderde groei vertoonde, waarschijnlijk door lekkage van de GAL one-promotor en de hoge cytotoxiciteit van AV RE one, veroorzaakte de expressie van zowel AV E one als HOP AA one one onder inducerende omstandigheden een drastisch groeiremmend fenotype, weerspiegeld door de afwezigheid van kolonies in elke verdunning. In tegenstelling hiermee oefende de expressie van A-V-R-P-T-O geen groeiremmend effect uit.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe groeiremmingsfenotypes kunnen worden geïdentificeerd die worden veroorzaakt door de expressie van bacteriële type drie effectoren in gist. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat zowel de expressievector als deze stam zorgvuldig moeten worden gekozen, aangezien beide de resultaten drastisch kunnen beïnvloeden. Vergeet daarnaast niet om in alle stappen van de procedure vers getransformeerde koloniën te gebruiken.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.