Name: Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer fluorescerende labeling van SNAP-tag fusieproteïnen in COS-7 cellen voor live cell imaging. Deze methode maakt real-time visualisatie van eiwitdynamiek en lokalisatie in levende cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kai Johnsson Ivan Correa Andreas Brecht Katrin Müentener Chris Noren Luo zon Ming Xu Theodore Davis Salvatore Russello Aihua Zhang Inca Ghosh Elissa Maunus Nicholas Labarthe James MacFarland John Buswell Brenda Desmond James Ellard Don Kam

Plating CHO-K1 cellen: <ol><li> Voeg 50-100μl van de CHO-K1 cellen die zijn getrypsiniseerd volgens standaard protocollen om 6 ml van complete F-12K. </li><li> Meng celsuspensie door en neer te pipetteren meerdere malen, dan aliquot 300 ul van getrypsiniseerd celsuspensie aan elke well van een steriele kamer 8-Lab-Tek II Chambered dekglaasje met # 1.5 borosilicaat dekglaasje kamers (Nalgene Nunc Int;. Product # 155409; Lot: 100808-8-0). </li><li> Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 's nachts. </li></ol> Voorbijgaande Transfectie van CHO-K1 cellen met pSNAP-ADRB2 en pSNAP-H2B: <ol><li> Controleer of de celkweek kamers gezaaid op de vorige dag om te zoeken naar celdichtheid en gezondheid. </li><li> Etiket het juiste aantal microcentrifuge buizen. </li><li> In een laminaire stroming kap, opgericht transfectie complexe mengsels op basis van het volgende voorbeeld grafiek, met behulp van 0,3 microgram pSNAP-ADBR2 controle plasmide DNA of 0,3 ug van pSNAP-H2B controle plasmide DNA, 1 ui Transpass D2 en 1 pi Transpass V per reactie. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> plasmide </td><td> aantal reacties </td><td> il serum-vrij medium </td><td> pi Transpass D2 </td><td> pi Transpass V </td><td> ul plasmide DNA </td><td> pi Transpass D2/reaction </td><td> ul van Transpass V / reactie </td><td> ng van DNA / reactie </td><td> DNA-conc. (Ng / ul) </td><td> il van plasmide DNA / reactie </td></tr><tr><td> SNAP-ADRb2 </td><td> 5 </td><td> 236,5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3.5 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 472,34 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> H2B-SNAP </td><td> 5 </td><td> 237 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 300 </td><td> 515,89 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Bespotten </td><td> 5 </td><td> 240 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> Ongetransfecteerde </td><td> 5 </td><td> 250 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table></li><li> De eerste, mix het serum vrij F-12K met de juiste plasmide DNA, dan is vervolgens de Transpass D2 transfectiereagens toe te voegen, voeg de Transpass V transfectiereagens. Meng de componenten door en neer te pipetteren voorzichtig in enkele keren na de toevoeging van elk reagens. </li><li> Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Tijdens de incubatie, een keer wassen cellen met 600 pi DMEM compleet en voeg 450 ul van de volledige DMEM aan elk monster. </li><li> Voeg 50 ul van de transfectie complex mengsel aan elk monster, langzaam en in een drop-wijs mode. </li><li> Incubeer de monsters overnacht bij 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> SNAP-Cell TMR Star Labeling van CHO-K1 cellen transient getransfecteerd met pSNAP-ADRB2 en pSNAP-H2B: <ol><li> Verwijder voorzichtig de transfectie complexe media van elk monster door afzuiging. Twee keer wassen cellen met 600 pi van volledige F-12K en vervang media in elk putje met 600 ul van complete F-12K. </li><li> Mix kleurstof etikettering media door het toevoegen van 995 ul van complete F-12K en 51 ul 0,6 mM SNAP-Cell TMR-Star substraat. De uiteindelijke concentratie van SNAP-Cell TMR-Star moet worden 3mm. Pipet op en neer een paar keer te mengen na de toevoeging van substraat. </li><li> Verwijder voorzichtig de groei van de media-monsters en voeg 200 ul van kleurstof etikettering media aan elke well. Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 30 minuten. </li><li> Terwijl de monsters te incuberen, te bereiden Hoechst 33342 oplossing voor het nucleaire kleuring van de monsters door het mengen van 1 pi van Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydraat (10 mg / ml, oplossing in water, 16,2 mM oplossing; Invitrogen Molecular Probes) in 10 ml van de volledige F-12K . </li><li> Verwijder de media van alle monsters en voeg 600 ul van de verdunde Hoechst oplossing voor elk monster. Incubeer monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 5 minuten. </li><li> Was monsters drie keer met 600 ul van complete F-12K. </li><li> Incubeer de monsters bij 37 ° C, 5% CO 2 voor een extra 30 minuten om zonder rechtspersoonlijkheid fluorofoor uit diffuse van de cellen. </li><li> Na 30 minuten de media op het SNAP-Cell monsters nog een laatste keer en ga door naar beeldvorming. </li><li> Het imago van de cellen met behulp van een Zeiss apotome Axiovert 200M fluorescentie microscoop. </li></ol> Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Hier zijnenkele representatieve resultaten van het fluorescerende beeldvorming met behulp van standaard fluorescentie microscopie van levende COS-7 cellen die uiten SNAP-tag fusies. Deze eerste afbeelding toont live-COS-7 cellen die pSNAP-H2B (nucleaire histone) gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star. De pSNAP-H2B construct werd gegenereerd met behulp van de pSNAP-tag (m) vector. De cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star gedurende 30 minuten en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw) voor de kernen. De roze fluorescentie toont de overlay van de rode fluorescentie waar histon-eiwit aanwezig is in aanvulling op de blauwe fluorescentie onder vermelding van de kern. De expressie van het eiwit H2B is duidelijk en gemakkelijk te herkennen. <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> <img src="/files/ftp_upload/1876/1876fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuren 2 en 3. Deze volgende twee afbeeldingen laten wonen COS-7 cellen transient getransfecteerd met pSNAP-ADRβ2. Cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star (rood) en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw). De pSNAP-ADRβ2 construct werd gegenereerd met behulp van de pSNAP-tag (m) vector. De cellen werden gemerkt met SNAP-Cell TMR-Star gedurende 30 minuten en tegengekleurd met Hoechst 33342 (blauw) voor de kernen. De rode fluorescentie duidt op de aanwezigheid van het celoppervlak receptor-eiwit ADRB2 terwijl blauw fluorescentie identificeert de kern.

<ol><li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biochemical+activities+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing biochemical activities in living cells.</a> Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).</li>
<li>Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP-tag+Technologies%3A+Novel+Tools+to+Study+Protein+Function%5BTitle%5D)+AND+%22NEB+Expressions%22%5BJournal%5D)">SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function.</a> NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).</li>
</ol>

De auteurs zijn in dienst van New England Biolabs dat de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

Er zijn een aantal variabelen die de waargenomen resultaten, zoals scherpstelling, laser intensiteit, de uitrusting mogelijkheden, lens gebruikt, enz. De fotostabiliteit van de fluorofoor bepaalt hoe snel de fluorescentie moet worden vastgelegd voordat vervagen. Deze methode van eiwit labeling is veelzijdig en geschikt voor vele toepassingen. SNAP-tag en CLIP-tag technologieën voor de specifieke etikettering van fusie-eiwitten met synthetische probes in staat stellen de verschillende aspecten van eiwitten functie, zoals een verscheidenheid aan dynamische processen in levende cellen en in cellysaten. SNAP-, clip-, MCP-en de ACS-tag technologieën bieden eenvoud en buitengewone veelzijdigheid aan de beeldvorming van eiwitten in levende cellen en vaste en de studie van eiwitten in vitro. De oprichting van een enkel gen te bouwen levert een gecodeerde fusie-eiwit in staat is de vorming van een covalente binding aan een verscheidenheid van functionele groepen, waaronder fluoroforen, biotine, of kralen. Het eiwit van de rente moet worden gekloond en uitgedrukt slechts een keer en dan is de fusie kan worden gebruikt met een verscheidenheid van fluorescerende substraten voor tal van stroomafwaartse toepassingen zoals gelijktijdige eiwit-etiket aan de binnenzijde levende cellen, eiwit lokalisatie en translocatie, pulse-chase experimenten, receptor internalisatie studies , selectieve celoppervlak etikettering, eiwit pull-down assays, eiwit detectie in SDS-PAGE, flowcytometrie, high-throughput bindingsassays in microtiterplaten, biosensor interactie experimenten en FRET-gebaseerde binding assays.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1 cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Serumvrij F-12K</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II chambered coverglass met #1.5 borosilicaat dekglas kamers</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td>Lot: 100808-8-0</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342, trihydrochloride, trihydraat (10 mg/ml oplossing in water, 16.2 mM oplossing)</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>470519</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescentiemicroscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transpass V</td><td>New England Biolabs</td><td>M2561S</td><td>0030709</td></tr><tr><td>Transpass D2</td><td>New England Biolabs</td><td>M2554S</td><td>0060802</td></tr><tr><td>SNAP-Cell TMR Star</td><td>New England Biolabs</td><td>S9105S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-ADBR2 controleplasmide</td><td>New England Biolabs</td><td>N9178S</td><td>0010811</td></tr><tr><td>pSNAP-H2B controleplasmide</td><td>New England Biolabs</td><td>N9179S</td><td>0010811</td></tr></tbody></table>

fluorescerende labeling van cos-7 tot expressie snap-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Deze systemen bieden een brede selectie van fluorescerende substraten geoptimaliseerd voor een reeks van imaging instrumentatie. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen. Er zijn twee stappen voor het gebruik van dit systeem: klonering en expressie van het eiwit van belang als een SNAP-tag fusion, en de etikettering van de fusie met de SNAP-tag substraat van keuze. De SNAP-tag is een klein eiwit gebaseerd op menselijke O<sup&gt; 6</sup&gt;-Alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), een DNA-herstel eiwit. SNAP-tag labels zijn kleurstoffen geconjugeerd aan guanine of chloropyrimidine vertrekkende groepen via een benzyl linker. In de etikettering reactie, is de gesubstitueerd benzyl groep van het substraat covalent gebonden aan de SNAP-tag. CLIP-tag is een aangepaste versie van SNAP-tag, ontworpen om te reageren met benzylcytosine in plaats van benzylguanine derivaten. Bij gebruik in combinatie met SNAP-tag, CLIP-tag maakt het mogelijk orthogonale en aanvullende etikettering van twee eiwitten tegelijk in dezelfde cellen.

SNAP-tag en CLIP-tag eiwit labeling systemen maken het mogelijk de specifieke, covalente aanhechting van moleculen, inclusief fluorescente kleurstoffen, om een ​​eiwit van interesse in levende cellen. Eenmaal gekloond en uitgedrukt, kunnen de gelabelde eiwit gebruikt worden met een verscheidenheid van substraten voor tal van downstream-applicaties zonder opnieuw te klonen.

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

De eiwitlabelingsystemen SNAP-tag en CLIP-tag maken de specifieke, covalente binding van moleculen, waaronder fluorescerende kleurstoffen, mogelijk aan een eiwit van belang ...

SNAP- en clip-tag. Eiwitlabelingsystemen maken de specifieke covalente binding van vrijwel elk molecuul aan een eiwit van belang mogelijk. Het gen van belang kan aan weerszijde van de tag in de vector worden gekloond; de expressie van het gekloonde gen resulteert in een SNAP-tag-fusie-eiwit.Het SNAP-tag substraat bestaat uit twee delen: het benzoguanine, dat door de SNAP-tag wordt herkend, en de functionele groep. De functionele groep kan biotine, een bead of een fluorescerende groep zijn, beschikbaar in verschillende kleuren. Tijdens de labelingsreactie bindt de gesubstitueerde benzogroep covalent aan de SNAP-tag, waarbij guanine vrijkomt. Als er een Fluora 4 aan het gewenste eiwit is gekoppeld, fluoresceert het label, waardoor visualisatie van het eiwit in levende of gefixeerde cellen mogelijk is.Hoi, ik ben Chris Provost van New England Bile Labs. Vandaag laten we u een procedure zien voor de fluorescentie-imaging van levende COS seven-cellen die snap tag-fusie-eiwitten tot expressie brengen. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen waar eiwitten in cellen gelokaliseerd zijn.Laten we beginnen. Om cos 7-cellen voor transfectie voor te bereiden, trypsiniseer deze volgens standaardprotocollen en voeg 50 tot 100 µL cellen toe aan 6 mL compleet DMEM-medium. Meng de celsuspensie door meerdere keren op en neer te pipetteren. Verdeel vervolgens aliquoten van 300 µL van de getrypsiniseerde celsuspensie over elke put van een steriele Lab-Tech eight chamber two chambered cover glass. Incubeer de monsters gedurende één nacht bij 37 °C en 5% CO2. Op de volgende dag.Controleer de celkweekkamers op celdichtheid en vitaliteit. Label het juiste aantal microcentrifugebuisjes voor de transfectiecomplexmengsels. In een laminaire flowkast.Stel de transfectiecomplexmengsels voor elke reactie op. Gebruik 0,3 micrograms snap fusion plasma DNA, verdund in serumvrij medium en één microliter. Elk van de TPAs D twee en TPAs v transfectiereagentia controleplasmiden is beschikbaar om de efficiëntie van de transfectiereagentia te analyseren.We raden ook aan om een mock-getransfecteerd monster en/of een niet-gereseceerd monster als negatieve controles voor elk complex mengsel op te nemen. Meng eerst het serumvrije DMEM met het betreffende plasma-DNA. Voeg vervolgens het TPAs D transfectiereagens toe, gevolgd door het TPAs v transfectiereagens.Meng de componenten goed door na de toevoeging van elk reagens meerdere keren voorzichtig met de pipet op en neer te zuigen en incubeer de reacties gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur; was de cellen tijdens de incubatie één keer met 600 µL compleet DMEM en voeg 450 µL compleet DMEM toe aan elk monster. Wanneer de incubatie is voltooid, voeg dan langzaam en druppelsgewijs 50 µL van het transfectiecomplexmengsel toe aan elk monster. Incubeer de monsters overnight bij 37 °C, 5% CO2.De volgende dag. De getransfecteerde COS-7 cellen kunnen worden gelabeld met het snap-cell TMR-star substraat om deze procedure te starten; voeg 50 µL DMSO toe aan het snap-cell TMR-star substraat en meng door herhaaldelijk op te pipetteren of door één minuut te vortexen. Verwijder vervolgens voorzichtig het transfectiecomplexmedium van elk monster via vacuümsuctorisatie en was de cellen twee keer met 600 µL compleet DMEM.Vervang vervolgens het medium in elke put door 600 µL compleet DMEM. Plaats de monsters terug in de incubator. Meng het D-labelingsmedium door 995 µL compleet DMEM en vijf µL 0,6 mM toe te voegen.Pipette het Snap cell TMR star-substraat na toevoeging meerdere keren op en neer om het te mengen. De uiteindelijke concentratie van snap cell TMR STAR moet 3 µM zijn. Verwijder voorzichtig het groeimedium uit de monsters en voeg 200 µL DIA-labelingsmedium toe aan elke put; incubeer de monsters bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 minuten. Tijdens deze stap zal de benzeelgroep op het TMR-substraat covalent binden aan de snap-tag en quain vrijgeven terwijl de monsters worden geïncubeerd.Bereid de HX-oplossing voor voor de kernkleuring van de monsters. Meng één microliter HSED 3 33 42 Tri Hydrochloride TRI in 10 milliliters compleet DMEM. Wanneer de incubatie is voltooid, verwijder dan het labelingsmedium uit alle monsters en voeg 600 microliters van de verdunde hooked-oplossing toe aan elk monster.Incubeer de monsters bij 37 °C, 5% CO2 gedurende vijf minuten. Verwijder na vijf minuten de verdunde hooked-oplossing uit elk monster en was de monsters drie keer met 600 µL compleet DMEM. Voeg na de laatste wasbeurt 600 µL compleet DMEM toe aan elk monster.Incubeer de monsters nogmaals 30 minuten bij 37 °C en 5% koolstofdioxide om niet-ingebouwde Fluor buiten de cellen te laten diffunderen, wat noodzakelijk is voor intracellulaire labeling. Vervang na 30 minuten voor de laatste keer het medium in de snap cell-monsters door 600 µL compleet DMEM. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming met een Zeiss AOME vert 200 M fluorescentiemicroscoop.Hier zijn enkele representatieve resultaten van fluorescentie-imaging met behulp van standaard fluorescentiemicroscopie van levende COS 7-cellen die tag-fusies tot expressie brengen. Deze eerste afbeelding toont levende COS 7-cellen die PNAP H2B tot expressie brengen, gelabeld met snap cell TMR*. Het pnap H2B-construct is gegenereerd met behulp van de PNAP TAG M-vector.De cellen werden 30 minuten gelabeld met snap cell TMR star en tegengekleurd met Hoechst 33342 voor de kernen. De roze fluorescentie toont de overlay van rode fluorescentie waar het histoneproteïne aanwezig is. Naast de blauwe fluorescentie die de kern aangeeft, is de expressie van het H2B-proteïne duidelijk en eenvoudig te identificeren.Deze volgende twee afbeeldingen tonen levende cost seven-cellen die transient zijn getransfecteerd met pnap. A DR beta twee-cellen werden gelabeld met snap cell, tmr, star, en tegengekleurd met HUX 3 33 42. Het pnap A DR beta twee-construct werd gegenereerd met behulp van de PNAP TAG M-vector.De cellen werden gedurende 30 minuten gelabeld met snap cell TMR star en tegengekleurd met hooks 3 33 42 voor de kernen. De rode fluorescentie geeft de aanwezigheid aan van het celoppervlakreceptoreiwit A DR beta two, terwijl de blauwe fluorescentie de kern identificeert. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u fluorescentie-imaging uitvoert van levende cough seven-cellen die snap tag-fusie-eiwitten tot expressie brengen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken het transfectiecomplex langzaam en druppelgewijs toe te voegen en het snap tag-substraat bij -20 °C in het donker te bewaren wanneer het niet in gebruik is. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

fluorescent-labeling-cos-7-expressing-snap-tag-fusion-proteins-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De biarsenical kleurstoffen Flash en ReAsH binden specifiek aan tetracysteine ​​motieven in eiwitten en kan selectief label eiwitten in levende cellen. Onlangs is dit de etikettering strategie is gebruikt om sensoren voor verschillende eiwitten conformaties of oligomere staten te ontwikkelen. Beschrijven we de etikettering van aanpak en methoden om kwantitatief te analyseren bindend.

ReAsH / Flash Labeling en beeldanalyse van Tetracysteine ​​Sensor eiwitten in cellen

We hebben een celfusie test die SNARE-gemedieerde membraanfusie events kwantificeert door geactiveerde expressie van β-galactosidase.

Analyse van SNARE gemedieerde membraanfusie gebruiken enzymatische celfusie Assay

Dit protocol beschrijft hoe totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie te gebruiken om enkele receptoren op het oppervlak van levende cellen te visualiseren en te volgen en daarmee de laterale mobiliteit van receptoren, de grootte van receptorcomplexen te analyseren, evenals om voorbijgaande receptor-receptorinteracties te visualiseren. Dit protocol kan worden uitgebreid tot andere membraaneiwitten.

Hoge-resolutie Spatiotemporal Analyse van Receptor Dynamics door Single-molecule fluorescentie microscopie

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.

Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Eiwit-eiwitinteractie zijn kritisch voor biologische systemen, en studies over de bindende kinetiek inzicht verwerven in de dynamiek en de functie van eiwitcomplexen. Beschrijven we een methode die kwantificeert de kinetische parameters van een eiwit complex met behulp van fluorescentie resonantie-energie-overdracht en de techniek gestopt-flow.

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Leer fluorescerende labeling van SNAP-tag fusieproteïnen in COS-7 cellen voor live cell imaging. Deze methode maakt real-time visualisatie van eiwitdynamiek en lokalisatie in levende cellen mogelijk.

Fluorescerende Labeling van COS-7 tot expressie SNAP-tag fusieproteïnen voor live cell imaging

Meer video's verkennen