Name: Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-06T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Leer tijdopnamebeeldvorming van mitose na siRNA-transfectie in levende zoogdiercellen. Deze methode kwantificeert mitotische timing en chromosoomdynamiek voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), de National Institutes of Health (R01 GM61275 en P30 CA042014), de leukemie en lymfoom Society, en de Huntsman Cancer Foundation.

siRNA transfectie en celpreparaat <ol><li> Bereid een 4-goed LabTek II chambered dekglaasje door het toevoegen van 0,5 ml van fibronectine (10μg/mL) aan elk goed, dat zal worden gebruikt. Incubeer gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Bereid siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) complexen voor reverse transfectie volgens de fabrikant de instructies. Gebruik de aanbevolen hoeveelheden voor een well van een 24-wells gerecht per kamer om te worden gebruikt (100μL totaal). Een analoge product / protocol voor siRNA transfectie kan worden vervangen. </li><li> Haal de fibronectine uit de bronnen van de chambered dekglaasje. Voeg 100μL van siRNA / Lipofectamine RNAiMAX complexen aan elk goed, dat zal worden gebruikt. </li><li> Aliquot 20.000 histon H2B-mCherry expressie cellen (in 500μL) per putje met transfectie mengsel. </li><li> Laat cellen voor ~ 24 uur geïncubeerd voordat u transfectie mengsel met 1 ml van de reguliere celkweekmedium. </li><li> Incubeer cellen een extra 24 uur voordat de foto acquisitie (48 uur na transfectie). </li></ol> Microscoop setup en beeldacquisitie <ol start="7"><li> Er zijn drie belangrijke onderdelen om het beeld overname setup: 1) een cel incubator die past op de microscoop podium en een constante vochtige omgeving van 37 ° C, en 5% CO 2, 2) een omgekeerde microscoop uitgerust met een geautomatiseerd stadium, geautomatiseerde fluorescentie en helderveld luiken, en geautomatiseerde filter wielen, en 3) een software pakket dat integreert en controleert het podium, rolluiken, en filter wielen. In onze beeldvorming opstelling maken we gebruik van een aangepaste cel incubator van OKO Lab die kunnen worden gebruikt met de LabTek II chambered dekglaasje. Het podium, rolluiken, en filter wielen worden gecontroleerd door de Metamorph software Hint:. De OKO Lab stage-top incubator systeem bevat adapters voor een verscheidenheid van verschillende bord, schotel, of dekglaasje maten. </li><li> Plaats de LabTek II chambered dekglaasje in de couveuse door het openen van het deksel van de voorverwarmde en in evenwicht incubator, het plaatsen van de chambered dekglaasje in de adapter, en op de plaats houden met boetseerklei. Laat de deksel op de chambered dekglaasje, zodat het celkweekmedium niet zal uitdrogen. Sluit het deksel en de positie van de hele couveuse op de microscoop podium, ervoor te zorgen dat de incubator stevig op zijn plaats gehouden. </li><li> Met behulp van Metamorph, het instellen van uw experiment door te kiezen voor &quot;Applicaties / Multidimensional Acquisition&quot; in de menubalk van de software. Dit zal een venster waarin u de frequentie en de lengte van de timelapse selecteert, wordt de belichtingstijd voor elke kleur (als dit meerdere instellingen), het aantal en de locatie van het podium posities, en het aantal z-profielen (indien gewenst). . Selecteren waar u de data bestanden op te slaan Tip: Bij gebruik van andere software dan Metamorph, de functies kunnen worden iets anders, maar het totale concept is hetzelfde. Micromanager, een open source ImageJ-gebaseerde acquisitie software die compatibel is met de meeste hardware opstellingen, is een uitstekend alternatief. </li><li> . Voor de toepassing van dit protocol zullen we beelden te verwerven bij twee golflengten (helderveld en mCherry) elke 15 minuten gedurende 8 uur bij 15 stadium posities Hint: Als een betere tijdsresolutie gewenst is, dan kun je verkorten van de tijdsduur tussen overnames, maar , kan er minder podium posities worden gebruikt, en dus minder mitotische cellen zullen beschikbaar zijn voor analyse. Het is belangrijk bij het ​​overwegen van tijdsintervallen om rekening te houden met de tijd die nodig is voor het filter wiel om te schakelen tussen filter sets. </li><li> Bepaal de optimale belichting voor elke golflengte door eerst richten op een veld van cellen met behulp van helderveld verlichting. In de software, stelt u de autofocus-functie alleen voor de helderveld kanaal (dit is de software te laten autofocus in elke fase positie voor elke acquisitie). Tip: We maken gebruik van een 40x droge fase-contrast doel om uitstekende resolutie geven zonder de behoefte aan olie . Andere doelstellingen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de gewenste optische resolutie. </li><li> Schakel over naar de mCherry golflengte en snap een afbeelding met behulp van een 50 msec blootstelling. Pas de belichting aan tijd om het vereiste minimum om een ​​goed beeld te zien. Het is essentieel om de hoeveelheid licht blootstelling aan duurzame levensvatbaarheid van de cellen te verzekeren. Als algemene regel geldt, kan dat het beste worden bereikt door het gebruik van een grijsfilter (de excitatie lichtstroom te verminderen) en een langere belichting tijd in plaats van door het verhogen van de verlichting sterkte. Herhaal deze procedure voor eventuele extra golflengten om te worden gebruikt. Tip: Om de lange termijn levensvatbaarheid van de cellen te bepalen op een gegeven blootstelling voor je experiment, dan kunt u het totaal aantal opnamen een cel kan overleven over de gewenste timelapse bekijken door tijdelijke aanpassing van de meetpunt afstand van minuut tot seconde (dat wil zeggen, 10 minuten. raakt 10 seconden). Als uw cellen overleven 100-200 blootstelling (of dejuiste nummer), dan is uw belichting is prima. Zo niet, verminderen uw excitatielicht, belichtingstijd, of het totale aantal van beelden om uw volledige experiment simuleren. </li><li> Vervolgens selecteren en markeren een passend aantal podium posities, zodat u kunt een adequate bemonstering van de cel bevolking te bereiken. Metamorph registreert de posities en zal er aangifte in voor elk acquisitie Hint:. Ik probeer gewoonlijk posities waarin er genoeg cellen zijn om de afbeelding te vinden, maar niet zoveel dat ze te dicht. Ook is het belangrijk om voldoende functies te selecteren, zodat u een goede kans op het waarnemen van een groot aantal cellen doorlopen mitose hebben. </li><li> Immers timelapse, golflengte belichtingstijd, en het podium positie-informatie zijn opgenomen, selecteert u de &quot;Preview&quot; knop op het scherm om te bepalen of de software is het beheersen van de apparatuur naar behoren. </li><li> Als u tevreden bent, selecteert u de &quot;Acquire&quot; knop op het scherm om acquisitie te beginnen. Vervolgens achterover leunen en laat de computer en microscoop om het werk te doen Hint:. Observeer de automatisering door middel van ten minste een volledige ronde van de overname om ervoor te zorgen dat alles goed werkt. </li></ol> Beeldverwerking en analyse <ol start="16"><li> Na de overname heeft voltooid, wordt de volgende stap is het beeld overdracht van gegevens in een vorm die is gemakkelijker te hanteren. Voor de toepassing van dit protocol, zal ik eerst laten zien hoe je films met Metamorph te genereren, maar ook hoe u foto montages met behulp van het ImageJ programma te genereren. Beide formaten zal nuttig zijn voor de kwantificering doeleinden. </li><li> De eerste stap is om herziening van de gegevens. Om dit te doen, selecteer &quot;Applicaties / Review Multidimensional Data&quot; in de menubalk. Selecteer de locatie van uw bestanden, en kies vervolgens &quot;View&quot;. Dit zal u toelaten om de stapel foto&#39;s afzonderlijk recensie van elke fase positie. Selecteer de gewenste podium positie, dan &quot;Load Images&quot;. Je zult in staat zijn om vooraf door de data frame-by-frame. </li><li> Voor degenen die het podium posities in die cellen gaan door mitose (zoals bepaald door zowel de DNA en cellulaire morfologie), kunt u films en montages met behulp van Metamorph, of met andere programma&#39;s zoals ImageJ (gratis beschikbaar via NIH). </li><li> Om een ​​film in Metamorph, selecteert u &quot;Proces / Save movie&quot; in de menubalk. Je zult in staat zijn om die frames te gebruiken, de snelheid, en het bestandstype van de film te selecteren. Selecteer vervolgens &quot;Save Movie&quot;. </li><li> Om een ​​montage, ik sla de afbeelding op stapel als een. Stk bestand, dat gebruikt kan worden in andere programma&#39;s zoals ImageJ. </li><li> Open het bestand in ImageJ en vooraf de kaders tot je een cel gaat door mitose. . Gewas het gebied rond de cel en &quot;Image / Dupliceren&quot; te selecteren Tip: Zorg ervoor dat alle frames te dupliceren. </li><li> Om een ​​montage, selecteer &quot;Image / Stacks / Maak Montage&quot; in de menubalk. Hier kunt u opgeven welke kaders u wilt opnemen, de grootte en de vorm van de montage, en of u wilt dat de grenzen tussen de frames. Selecteer deze en druk op &quot;Okay&quot;. .. Sla de montage als een tif-bestand en voert u een verdere verwerking in een van beide ImageJ of Adobe Photoshop Hint: Verander montage bestanden van de 16-bit formaat wordt gebruikt door Metamorph om 8-bit formaat voor eenvoudiger beeldverwerking. </li><li> Voor het berekenen van de tijd in verschillende stadia van de mitose, vast te stellen t = 0 (eerste teken van DNA condensatie of cel afronding), het aantal frames tellen tot de chromosomen worden uitgelijnd op de evenaar (tijd in profase / prometafase), frames tot de chromosomen beginnen te scheiden (tijd in metafase), en frames tot de cellen beginnen af ​​te vlakken (anafase / telofase / cytokinese). De berekende tijd in elke mitotische fase is afhankelijk van het tijdsinterval tussen elke frame. </li></ol> Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1878/1878fig1tmb.jpg" border="0" /> Figuur 1 toont de resultaten van een typische controle siRNA transfectie experiment met behulp van een HeLa cellijn die histon H2B-mCherry. Deze methode van daadwerkelijk is gebruikt om de mitotische timing kwantificeren, onthullen een onverwachte rol voor de nucleoporin Nup153 in de timing van late mitose 1. Gelieve <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1878/1878fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

<ol><li>Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup153+has+separable+roles+in+both+early+mitotic+progression+and+the+resolution+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+checkpoints+in+the+regulation+of+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression.</a> Dev Cell. 7, 45-60 (2004).</li>
<li>Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+structural+dynamics+of+chromosomes+in+living+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy.</a> Methods. 41, 158-167 (2007).</li>
<li>Prosser, S. L., Fry, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+the+centrosome+cycle+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).</li>
<li>Malureanu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BubR1+N+terminus+acts+as+a+soluble+inhibitor+of+cyclin+B+degradation+by+APC%2FC%28Cdc20%29+in+interphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase.</a> Dev Cell. 16, 118-131 (2009).</li>
<li>Anderson, D. J., Hetzer, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaping+of+the+endoplasmic+reticulum+limits+the+rate+for+nuclear+envelope+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation.</a> J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).</li>
<li>Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+breakdown+proceeds+by+microtubule-induced+tearing+of+the+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina.</a> Cell. 108, 83-96 (2002).</li>
<li>Marcus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spindle+behavior+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Visualization of spindle behavior using confocal microscopy.</a> Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).</li>
<li>Steigemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint+protects+against+tetraploidization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization.</a> Cell. 136, 473-484 (2009).</li>
<li>Draviam, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+screen+identifies+a+role+for+TAO1+kinase+in+spindle-checkpoint+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling.</a> Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).</li>
<li>Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNAi+screening+by+time-lapse+imaging+of+live+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells.</a> Nat Methods. 3, 385-390 (2006).</li>
<li>Stegmeier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+initiation+is+regulated+by+antagonistic+ubiquitination+and+deubiquitination+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities.</a> Nature. 446, 876-881 (2007).</li>
</ol>

Met de recente ontwikkelingen in de beeldvorming en fluorescerend eiwit-technologie, is er live imaging uitgegroeid tot een routine aspect van cellulaire analyse 2. Een verscheidenheid van GFP (en andere kleurvarianten 3)-gemerkte eiwitten worden op grote schaal beschikbaar of relatief eenvoudig te bouwen en kan worden gebruikt om een aantal van de celdeling kenmerken waaronder DNA / chromosoom dynamiek van 4, 5, 6 centrosoom duplicatie, cycline B dynamiek spoor 7, nucleaire envelop afbraak en heropbouw 8, 9, mitotische spindel vorming van 10, en de verschillende stadia van cytokinese 11. Gemerkte eiwitten kan alleen of in combinatie worden gebruikt wanneer de excitatie / emissie spectra van fluorescerende labels zijn compatibel, waardoor de coördinatie tussen bepaalde gebeurtenissen te worden beoordeeld. Indien een grotere ruimtelijke en / of temporele resolutie is / zijn gewenst, confocale microscopie of laser scanning, draaiende schijf, of resonantie scan kan worden gebruikt, en de lijst van geavanceerde microscopie opties met steeds grotere resolutie blijft groeien. Live-beeldvorming van de mitose in zoogdiercellen is ook aangepast voor gebruik in high-throughput RNAi en kleine molecule schermen 12-14. Dus, terwijl een s eerste experimenten met deze techniek kan zijn relatief eenvoudig, de mogelijkheden voor het bouwen op deze strategie zijn uitgebreid.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>12-565-337</td><td>Andere kamergroottes zijn beschikbaar</td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top celincubator</td><td>OKO Lab</td><td></td><td>Elke geschikte kamer kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Geautomatiseerde geïnverteerde fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Elke geschikte microscoop kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Softwarepakket</td><td>Metamorph</td><td></td><td>Elke geschikte software kan worden gebruikt</td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging van mitose na sirna transfectie

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Veranderingen in de cellulaire organisatie en chromosoom dynamiek die zich voordoen tijdens de mitose zijn nauw afgestemd op accurate erfenis van genomische en cellulaire inhoud te verzekeren. Hallmark gebeurtenissen van mitose, zoals chromosoom beweging, gemakkelijk kan worden gevolgd op een individuele cel basis met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie van zoogdiercellijnen expressie van specifieke GFP-gelabelde eiwitten. In combinatie met RNAi-gebaseerde uitputting, kan dit een krachtige methode voor het aanwijzen van de fase (n) van de mitose waar de gebreken zich voordoen na het niveau van een bepaald eiwit zijn verlaagd. In dit protocol, presenteren we een eenvoudige methode voor de beoordeling van het effect van uitputting van een potentiële mitotische regulatie-eiwit op de timing van de mitose. Cellen worden getransfecteerd met siRNA, geplaatst in een stage-top incubatiekamer en beeld gebracht met behulp van een geautomatiseerd fluorescentie microscoop. We beschrijven hoe software te gebruiken om het opzetten van een time-lapse experiment, hoe het beeld sequenties proces om ofwel stilstaande beelden of films te maken montages, en hoe te kwantificeren en analyseren van de timing van de mitotische fase met behulp van een cellijn tot expressie mCherry- getagd histon H2B. Tot slot bespreken we belangrijke overwegingen voor het ontwerpen van een time-lapse experiment. Deze strategie is complementair aan andere benaderingen en biedt de voordelen van een) gevoeligheid voor veranderingen in de kinetiek dat misschien niet in acht worden genomen bij het bekijken van cellen als een bevolking en 2) analyse van de mitose, zonder de noodzaak om de celcyclus met behulp van behandeling met medicijnen te synchroniseren. De visuele informatie uit deze beeldvorming experimenten kunnen niet alleen de sub-stadia van mitose te beoordelen, maar kan ook onverwacht inzicht dat niet zou blijken uit de celcyclus analyse door FACS.

Hier beschrijven we een basic protocol om beeld en kwantificeren van de mitotische timing van levende zoogdieren weefselkweek cellen na siRNA transfectie.

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Veranderingen in de cellulaire organisatie en chromosoomdynamiek die tijdens de mitose optreden, zijn nauw gecoördineerd om een nauwkeurige overdracht van het genoom en ...

Veranderingen in de cellulaire organisatie en chromosoomdynamiek die tijdens de mitose optreden, zijn nauw gecoördineerd om een nauwkeurige overdracht van de genomische en cellulaire inhoud te waarborgen. In dit video-artikel wordt een methode getoond voor het volgen van kenmerkende gebeurtenissen tijdens de mitose. De beweging van chromosomen wordt op individueel celniveau gemonitord met behulp van cellijnen die fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen.Transfectie met siRNA gericht tegen mitotische eiwitten resulteert in celcyclusveranderingen die gevisualiseerd kunnen worden met time-lapse imaging en gekwantificeerd kunnen worden via beeldanalyse. Hallo, ik ben Douglas Mackey van het laboratorium van Katie Oman aan het Huntsman Cancer Institute van de University of Utah. Vandaag laten we u een procedure zien voor het imagen van levende cellen terwijl ze door de mitose gaan na siRNA-transfectie.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen welke effecten de verstoring van specifieke eiwitten kan hebben op de timing van de mitotische progressie. Laten we beginnen. Bereid een four wall lab tech twee-kamerig dekglas voor door aan elke kamer 0.5 milliliters fibronectine toe te voegen.Incubeer gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen de irna- en lip RNAI max-complexen voor voor reverse transfectie. Gebruik voor elke kamer de hoeveelheid die door de fabrikant wordt aanbevolen voor één putje van een 24-wells plaat.Verwijder na 15 minuten het fibronectine uit de wells van het chambered cover glass. Voeg vervolgens 100 µL irna-complexen toe aan elke well. Aliquoteer 20.000 cellen in 500 µL in elke well. Plaats de cellen gedurende 24 uur in de incubator.Vervang de volgende dag het transfectiemengsel door één milliliter regulier celkweekmedium en incubeer de cellen vervolgens nogmaals 24 uur voordat de beeldacquisitie plaatsvindt. De opstelling voor de beeldacquisitie bestaat uit een aangepaste celincubator die op de tafel van een geïnverteerde microscoop past en wordt aangestuurd door beeldacquisitiesoftware. Zorg ter voorbereiding op de beeldacquisitie dat de incubator is voorverwarmd en geëquilibreerd.Open vervolgens het deksel van de incubator en plaats de cellen met het gesloten kamerdeksel in de adapter. Gebruik een kleine hoeveelheid boetseerklei om deze op zijn plaats te houden. Sluit het deksel en positioneer de gehele incubator op de objecttafel van de microscoop, waarbij u ervoor zorgt dat de incubator stevig vastzit.Gebruik vervolgens MetaMorph om het experiment in te stellen door in de menubalk van de software 'apps multidimensional acquisition' te selecteren. Er verschijnt dan een venster waarin de beeldvormingsparameters kunnen worden gekozen. Geef aan waar de gegevensbestanden moeten worden opgeslagen.Select vervolgens de golflengten voor brightfield en m cherry met behulp van het 4x TX droge fasecontrastobjectief, stel de focus in op een veld cellen via de software en pas de autofocusfunctie alleen aan voor het Brightfield-kanaal. Hierdoor kan de software bij elke stagepositie automatisch scherpstellen vóór elke acquisitie. Leg voor de eerste golflengte een afbeelding vast met een belichtingstijd van 50 milliseconden; pas de belichtingstijd aan naar het minimum dat vereist is om een goed beeld te verkrijgen.Het is essentieel om de hoeveelheid lichtblootstelling te beperken om een aanhoudende celviabiliteit te waarborgen. In het algemeen kan dit het beste worden bereikt door gebruik te maken van een neutraal dichtheidsfilter en een langere belichtingstijd van de camera, in plaats van de verlichtingssterkte te verhogen.Herhaal deze procedure voor alle aanvullende golflengten. Stel vervolgens de belichtingstijd voor elk kanaal in. Bepaal daarna een time-lapse interval van 15 minuten gedurende acht uur op 15 stageposities.Indien een betere tijdsresolutie gewenst is, verkort dan het tijdsinterval tussen de acquisities. Houd er rekening mee dat hoe meer stageposities worden gebruikt, hoe langer de acquisitie in beslag neemt. Selecteer en markeer bij elk tijdsinterval een passend aantal stageposities om de celpopulatie adequaat te bemonsteren.Metamor registreert de posities en keert voor elke acquisitie terug naar de aangewezen locatie. Na de time-lapse golflengteblootstelling zijn de tijd- en tafelpositie-informatie vastgesteld. Selecteer de preview-knop op het scherm om te bevestigen dat de software de apparatuur correct aanstuurt.Nadat is vastgesteld dat het systeem naar behoren functioneert, selecteert u de knop 'acquire' op het scherm om met de acquisitie te beginnen. Observeer de automatisering gedurende ten minste één volledige acquisitieronde om er zeker van te zijn dat alles correct werkt. Laat vervolgens de computer en de microscoop het werk doen.Om de gegevens te bekijken, selecteert u apps, review multidimensional data in de menubalk, selecteert u de weergave van de bestandslocatie en selecteert u vervolgens een stage-positie. Klik op load images om de stapel afbeeldingen van die positie te bekijken. Zodra de afbeeldingen zijn geladen, gebruikt u de muis om frame voor frame door de gegevens te bladeren.Hier worden films van mitotische cellen gegenereerd met behulp van Metamorph. Om een film in Metamorph te maken, selecteert u stack make movie. In de menubalk selecteert u welke frames moeten worden gebruikt, de snelheid en het bestandstype van de film.Selecteer vervolgens opslaan om een montage te maken. Sla de gegevens eerst op als een .stk-bestand in Metamorph. Open daarna ImageJ, open het .stk-bestand in ImageJ en snijd een regio van belang uit door het gebied te markeren en in de menubalk te kiezen voor afbeelding bijsnijden.Select vervolgens de beeldstapels. Geef bij het maken van de montage aan welke frames moeten worden opgenomen en bepaal de grootte en vorm van de montage, alsook of er randen tussen de frames gewenst zijn.Klik vervolgens op oké. Sla de montage op als een .tiff-bestand. Bereken tot slot de tijd in elke fase van de mitose, waarbij het frame waarin het eerste teken van DNA-condensatie of celronding zichtbaar is, wordt aangemerkt als T=0 voor de profase.De prometafase eindigt wanneer de chromosomen op de equator zijn uitgelijnd, waarna de metafase volgt tot het DNA begint te scheiden in de anafase en telofase. Ten slotte volgt de cytokinese en beginnen de cellen af te platten. Time-lapse beelden van hilarcellen die histone expresseren.Twee BCFP-cellen worden getoond. Deze cellen werden getransfecteerd met controle-irna en doorlopen normaal gesproken de celcyclus. In vergelijking hiermee vertonen cellen die werden getransfecteerd met siRNAs gericht tegen nucleair porie-eiwit NUP 1 53 ernstige afwijkingen in de progressie van de mitose.We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u een time-lapse imaging-experiment opzet, uitvoert en analyseert om de timing van de mitotische progressie van cellen na een transfection te bepalen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de cellen zo voorzichtig mogelijk te behandelen door de juiste temperatuur en CO2-concentraties te handhaven en de hoeveelheid licht waaraan de cellen worden blootgesteld te beperken. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

time-lapse-imaging-of-mitosis-after-sirna-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

FRET-gebaseerde reporters steeds vaker gebruikt voor het kinase en fosfatase activiteiten in levende cellen te volgen. Hier beschrijven we een methode voor het FRET-gebaseerde verslaggevers gebruiken om celcyclus-afhankelijke veranderingen te beoordelen in doel fosforylering.

Monitoring Kinase en fosfatase activiteiten door middel van de celcyclus door Ratiometrische FRET

Source: Daniele, F., et. al TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the imaging of human neuroblastoma cells using a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope to visualize fluorophore-tagged synaptic vesicles. The cells are first focused in epifluorescence mode. Adjustments are then made to achieve total internal reflection,...

Cell Imaging Using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Hier presenteren we de real-time bewaking van de cel migratie in een wondgenezing assay met behulp van TIP60-verarmd MCF10A borst epitheliale cellen. De uitvoering van live-cel beeldvormingstechnieken in ons protocol kan we analyseren en visualiseren van eencellige verkeer in real time en in de tijd.

Live-imaging van borst epitheliale cel migratie na de voorbijgaande uitputting van TIP60

Presenteren we een protocol voor de dubbele thymidine synchronisatie van HeLa cellen gevolgd door analyse met behulp van hoge resolutie confocale microscopie. Deze methode is de sleutel tot het verkrijgen van groot aantal cellen die zich synchroon van S-fase naar mitose, studies over mitotische rollen van multifunctionele eiwitten die ook interfase functies bezitten inschakelen.

Het combineren van de mitotische cel synchronisatie en hoge resolutie confocale microscopie om te bestuderen van de rol van multifunctionele celcyclus eiwitten tijdens de mitose

Het protocol beschrijft specifieke etikettering van mitochondriale nucleoïden met een commercieel verkrijgbare DNA-gel vlek, verwerving van time lapse-serie van live gelabelde cellen door super-resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SR-SIM), en automatische tracking van nucleoïde beweging.

Specifieke etikettering van Mitochondriale nucleoïden voor time-lapse Structured Illumination Microscopie

Hier presenteren we een protocol om de dynamiek van spindel vorming en mitotische progressie te beoordelen. Onze toepassing van time-lapse Imaging stelt de gebruiker in staat om cellen te identificeren in verschillende stadia van mitose, sporen en identificeren mitotische defecten, en analyseren spil dynamiek en mitotische cel lot bij blootstelling aan anti-mitotische drugs.

Live Cell Imaging om de dynamiek van de metafase timing en het lot van de cel na de mitotische spindel perturbations te beoordelen

Dit protocol illustreert een chemisch geïnduceerd eiwitdimeerisatiesysteem om condensaten op chromatine te maken.  De vorming van promyelocytaire leukemie (PML) nucleair lichaam op telomeren met chemische dimerizers is aangetoond. Druppelgroei, oplossing, lokalisatie en samenstelling worden gemonitord met live cell imaging, immunofluorescentie (IF) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH).

Chemische dimerisatie-geïnduceerde eiwitcondensaten op telomeren

Dit protocol presenteert een nieuw reporter-gensysteem en de experimentele opstelling om transcriptie te detecteren bij DNA-dubbelstrengsbreuken met gevoeligheid van één molecuul.

Live-Cell Imaging van transcriptionele activiteit bij DNA Double-Strand Breaks

Time-lapse microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van meiose in ontluikende gist. Dit protocol beschrijft een methode die celcyclussynchronisatie, time-lapse-microscopie en voorwaardelijke uitputting van een doeleiwit combineert om aan te tonen hoe de functie van een specifiek eiwit tijdens meiotische chromosoomsegregatie kan worden bestudeerd.

Gebruik van time-lapse microscopie en stadiumspecifieke nucleaire uitputting van eiwitten om meiose in S. cerevisiae te bestuderen

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Leer tijdopnamebeeldvorming van mitose na siRNA-transfectie in levende zoogdiercellen. Deze methode kwantificeert mitotische timing en chromosoomdynamiek voor celbiologisch onderzoek.

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Meer video's verkennen