Name: Plastic Inbedding en snijden van Xenopus laevis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Leer plastic inbedding en snijden van Xenopus laevis embryo's voor immunofluorescentie en hoogresolutiebeeldvorming. Deze methode behoudt de weefselmorfologie beter dan traditionele paraffine-inbedding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bevestiging <ol><li> Overdracht gehele embryo&#39;s of ontleed explanten in MEMFA of 3,7% FA + PBS in een kleine glazen scintillatieflesje (Fisher cat # 03 tot 339-25B). Incubeer flacon op de nutator bij kamertemperatuur, alleen voor 2 uur, en niet meer dan dat. Laat de embryo in de FA voor meer dan 2 uur. Langere incubatietijd in FA zal de embryonale weefsel harder en resulteren in een slechte penetratie van antilichamen in de detectie proces. </li><li> Aspireren het grootste deel van FA en voeg Dent&#39;s fixatief naar de top van de flacon (~ 4.5ml). Zwenk de flacon voor een paar keer om de embryo&#39;s wassen in Dent&#39;s, uitwisseling met een andere 4.5ml van verse Dent, en incuberen in -20 º C gedurende ten minste 48 uur. &#39;S nachts is niet genoeg. Deze stap maakt de embryo&#39;s meer doorlaatbaar voor het antilichaam. Embryo&#39;s kunnen worden gehouden in deze toestand gedurende enkele weken. </li></ol> Immunofluorescentie <ol><li> Hydrateren het monster. Incubeer het in een gegradeerde reeks van methanol, als volgt: <table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3"><tbody><tr><td> 75% MeOH / H 2 O </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 50% MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> 25% MeOH / PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 10min </td></tr></tbody></table> </li><li> Maak 1,5% agarose / PBS platen met 60mm plastic schaaltjes. Giet PBS op de top van de agarose nadat deze is geworden solide. </li><li> Hemi-snijden van de embryo&#39;s: Zet de embryo&#39;s in een 1,5% agarose / PBS plaat. Pak een embryo met een pincet en snijd het in half door het centrum van het embryo met behulp van een dun scheermesje. Kies degene die je succes hebben in de helft gesneden met een rechte snijvlak. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="Figuur 1" width="591" height="193" /> </li><li> Breng de doorsneden embryo&#39;s in een glazen scintillatieflesje met PBT. Uitwisseling met 4.5ml van 20% geit serum + PBT. Incubeer bij RT gedurende 2 uur op een nutator (Blocking). </li><li> Bereid een geschikte verdunning van het primaire antilichaam in PBT. 0,5 ml van deze per monsters nodig. Zo gebruikte ik 1 / 200 verdunning van konijn anti-C-cadherine pAb om de subcellulaire lokalisatie van C-cadherine in 5mm plastic delen te bestuderen. </li><li> Aspireren de blockingbuffer en voeg 0,5 ml van de verdunde primaire antilichaam. Zet de flacons in de stand-up positie op een piepschuim buis houder. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een nutator. </li><li> Verwijder de verdunde primaire antilichaam (deze verdunde primaire antistof kunnen worden opgeslagen en hergebruikt in de komende 1-2 weken). Wassen met 4.5ml van PBT voor 4 keer (40-60 minuten per stuk) bij RT. </li><li> Uitwisseling met 0,5 ml van 1 / 100 verdunning van biotine-geconjugeerd secundair antilichaam in PBT. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een nutator. Bedek de flacons met aluminiumfolie om biotine te beschermen tegen licht. </li><li> Vanaf dit punt moet erop worden genomen om het monster te beschermen tegen licht, dat wil zeggen, houd de vaatjes onder een deksel of aluminiumfolie. </li><li> Verwijder de biotine-secundair antilichaam (dit kan ook worden hergebruikt in de komende 1-2 weken). Wassen met of 4.5ml van PBT voor 4 keer (40-60 minuten per stuk) bij RT. </li><li> Uitwisseling met 0,5 ml van 1 / 200 verdunning van fluorescent-gelabeld (FITC, Texas-rood, etc.) Streptavidine in PBT. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een nutator. </li><li> Verwijder de streptavidine (dit kan worden hergebruikt, ook). Wassen met 4.5ml van PBT voor de 3 keer (15 - 30 minuten per stuk) bij RT. </li><li> Bevestig de embryo&#39;s in 4.5ml van 3,7% FA + PBS gedurende 30 minuten bij RT. </li><li> Twee keer wassen met 4.5ml van PBS. </li><li> Uitdrogen van het preparaat. Incubeer het in een gegradeerde reeks van ethanol, als volgt: <table style="width: 172px; height: 80px;" border="0"><tbody><tr><td> 30% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 50% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 75% EtOH / H 2 O </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> 100% EtOH </td><td> 10 min </td></tr></tbody></table> </li><li> Het monster kan worden opgeslagen in 100% EtOH bij 4 º C met een dekking van het te beschermen tegen licht. </li></ol> Infiltratie <ol><li> Maak Technovit 7100 infiltratie mix. Ik heb meestal 15 ml van de basis vloeistof in een 50 ml conische buis, voeg 150 mg van de verharder I en meng het door schommelen op een nutator gedurende 15 minuten. Deze infiltratie mix kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. </li><li> Infiltreren het exemplaar met de infiltratie mix door het uitwisselen met een gesorteerde reeks Technovit infiltratie mix / EtOH combo, als volgt: <ol><li> 50% Technovit / EtOH - 1 uur </li><li> 100% Technovit - 1 uur </li><li> 100% Technovit - &#39;s nachts </li></ol></li><li> De specimen kan worden opgeslagen in de 100% infiltratie mix voor maximaal een maand bij 4 º C. Leg een deksel op de monsters om ze te beschermen tegen licht. </li></ol> Inbedding <ol><li> Maak Technovit 7100 embedding mix: Neem 0.75ml van de infiltratie mix in een 1,5 ml tube en voeg 50 ml verharder II. Meng het door het omkeren van de buis een paar keer. </li><li> Met behulp van een plastic overdracht Pipetteer een exemplaar geïnfiltreerd &#39;s nachts in 0,5 ml dunne wand PCR-buis. Verwijder het merendeel van het supernatant. </li><li> Voeg 0,25 ml van de inbedding mix gemaakt in stap 1 van deze paragraaf, &quot;Embedding &#39;, het model. Orient de embryo doorkruist om de dissectie vliegtuig gericht naar de bodem van de buis te maken, door zachtjes wenkt met een doffe-tip dissectie naald (houten handvat dissectie naald). </li><li> Sluit de dop en incubeer de buis in een donkere plaats voor ongeveer vier uur om de plastic polymeriseren. </li><li> Maak Technovit 3040 mix. Neem 1 gram van het poeder om een ​​droogschaal, en voeg 0,5 ml van de vloeistof. Onmiddellijk, mix poeder en vloeistof met behulp van een bluetip. Giet op de top van de geharde spacimen. Deze gele Technovit 3040 wordt voorkomen dat de hele plastic blok van coming out van de buis. </li></ol> Snijden <ol><li> Veeg Histoknife H met xyleen (EtOH is vaak niet goed genoeg) en zet het op uw microtoom. Hoek van het blad op ongeveer 45 °. Veeg het toneel in de voorkant van het blad met xyleen, ook, omdat de zuiverheid van dit gebied is cruciaal voor de kwaliteit van de doorsnede plakjes. </li><li> Snijd de zijkant van de buis en schil de tip uit met een kartonnen mes. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Figuur 2" width="818" height="243" /> </li><li> Zet het preparaat in de klauw houder van het microtoom. </li><li> Bevestig een &quot;pers-to-seal&quot; silicon isolator op een dia glas om een ​​bevestiging kamer voor sectie plakjes te maken. Druk stevig op de isolator op de dia op schone werkblad en zie van de andere kant om ervoor te zorgen dat de isolator geheel is bevestigd zonder luchtbellen. Giet schoon en warm dH 2 O (~ 40 ° C) naar het zwembad op de dia met behulp van een Pasteur pipet, tot op het niveau waar het kan worden gezien dat het wateroppervlak wordt plat, geen holle of bolle vorm. </li><li> Begin met het maken sectie plakjes. Voor de immunofluorescentie studies, Ik maak 5 mm sectie plakjes. Voor de in situ hybridisatie monsters, kan de dikte van de plakjes worden ingesteld in het bereik van ~ 3 - 8 mm, afhankelijk van het doel en de intensiteit van de signalen. </li><li> Draag de sectie plakjes vanaf het podium in de voorkant van het blad aan de montage kamer met water, met behulp van een klein penseel. Houd de kwast met een schijfje op de top van het water zwembad en laat de slice naar het water door kloppen met een dof-tip dissectie naald. Het schijfje zal uitgroeien tot een ronde vorm zodra hij raakt het oppervlak van het water. </li><li> Wanneer de meeste van het water oppervlakte van de montage-kamer gevuld is met sectie plakken, zuigen bijna de helft van het water met behulp van een Pasteur pipet. Incubeer de foto op een dia warmere &#39;s nachts om de sample volledig droog is. </li><li> Counter-vlek met 1 ml van DAPI (0.1mg/ml in TE) gedurende vijf minuten. Aspireren DAPI en droog het monster. </li><li> Verwijder de siliconen rubber isolatie uit de dia. Nu foto&#39;s kunnen worden genomen van het monster. Bewaar het monster bij 4 ° C, beschermd tegen licht. </li></ol>

Primair antilichaam tegen je antigeen of epitoop tags: Maak een geschikte verdunning in PBT. Biotine-geconjugeerd secundair antilichaam: verschillende leveranciers verkopen biotine-geconjugeerde antilichamen.

plastic inbedding en snijden van xenopus laevis embryo&#39;s

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic onderdelen te behouden waar weefsel morfologie in dunne secties van weefsel dat kan worden immunostained met fluorescerende secundaire antilichamen, waardoor deze methode meer nuttiger dan in paraffine ingebedde of bevroren secties voor vele soorten weefsel. De methode voor het kleuren, plastic inbedding, en snijden wordt gedemonstreerd in deze video.

Plastic Inbedding en snijden van Xenopus laevis embryo&#39;s

Hallo, mijn naam is Sochi ota. Ik ben postdoc-onderzoeker in het laboratorium van Dr. Ken Cho bij de afdeling Developmental and Cell Biology aan de University of California, Irvine. Vandaag zal ik u de bereiding van eenvoudige coupes van xenopus-embryo's tonen.Deze procedure omvat het bisecteren van kikkervisjesembryo's in een laat gasstadium, kleuring met antilichamen tegen het molecuul van belang, infiltratie in plastic en het maken van plastic doorsneden van vijf micron. Deze procedure kan worden gebruikt voor het bestuderen van immunofluorescentie, immunohistochemie of in situ hybridisatie met beelden van zeer hoge resolutie. Dit zijn de kleine, handige hulpmiddelen die ik gebruik voor het plastisch doorsnijden van 10+ embryo's.Dit is een metalen pincet met een delta-punt en deze, nummer één, kan worden gebruikt om het embryo in plastic te oriënteren. En nummer twee kan, samen met deze penseel, worden gebruikt om het embryo van de microtoom naar het montageoppervlak over te brengen. Dit is een siliconen rubberen isolator, die ik op het oppervlak van het objectglas plaats en die een waterpool creëert waarin ik de plastic coupes van de embryo's kan monteren.Nu laat ik zien hoe he

plastic-embedding-and-sectioning-of-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.

Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Neurale Explantatie Culturen van<em&gt; Xenopus laevis</em

Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.

Dissectie van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neurale lijst voor<em&gt; In vitro</em&gt; Explantaatkweek of<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantatie

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

Dit artikel een gemakkelijke en snelle werkwijze voor het visualiseren van verschillende neuronale celpopulaties in het centrale zenuwstelsel van embryonale ontwikkeling middels immunofluorescentiekleuring op de afdelingen.

Het beoordelen van Primary neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s met behulp van Immunokleuring

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

We beschrijven een fysieke constrictiemethode om mini-embryo's te maken van Xenopus laevis 1-cel embryo's.

Fysieke manipulatie om Xenopus mini-embryo's te genereren

Leer plastic inbedding en snijden van Xenopus laevis embryo's voor immunofluorescentie en hoogresolutiebeeldvorming. Deze methode behoudt de weefselmorfologie beter dan traditionele paraffine-inbedding.

Plastic Inbedding en snijden van Xenopus laevis embryo's

Meer video's verkennen