Voorbereiding van oligomere β-amyloïde 1-42 En Inductie van synaptische plasticiteit Waardevermindering op hippocampus Slices
14 juli 2010
Een kenmerk van de ziekte van Alzheimer is de hoogte van Aß 1-42 Peptide. Hier hebben we een protocol voor het bereiden van synthetische Aß 1-42 Oligomeren, die hippocampus Long-Term Potentiëring ernstig schaadt, een cellulair correlaat van het geheugen. Deze procedure is handig voor het onderzoeken van de mechanismen van Aß-geïnduceerde pathologie en drug discovery.
Synthetisch bèta-amyloïde 1-42 wordt geresuspendeerd in HFIP om het peptide eerst te monomeriseren en vervolgens geconcentreerd tot een film voor ligandisatie. De film wordt geresuspendeerd in DMSO, verdund in fosfaatbuffer en overnacht geïncubeerd. Ten slotte wordt het oligomeerpeptide verdund met registratiebuffer en geperfuseerd op acute hippocampale coupes, waarbij het effect van de bèta-amyloïde-blootstelling op de synaptische plasticiteit wordt beoordeeld.
Welkom in het laboratorium van Avio Orio aan de Columbia University in New York City. Hallo, vandaag laten we u een procedure zien die we hebben geoptimaliseerd voor de bereiding van oligomeer bèta-amyloïde, gebaseerd op een protocol dat oorspronkelijk in 2003 is voorgesteld door Stein en collega's. In dit laboratorium hebben we deze procedure gebruikt om door bèta-amyloïde geïnduceerde synaptische dysfunctie te bestuderen.
Laten we beginnen. Laat het flesje met geliofiliseerd bèta-amyloïdepoeder 30 minuten op kamertemperatuur komen om condensvorming te voorkomen wanneer het onder de zuurkast wordt geopend. Open het flesje en voeg ijskoud HFIP toe om een uiteindelijke bèta-amyloïdeconcentratie van één millimolair te verkrijgen.
Sluit het vial en meng door te vortexen. Verdeel de oplossing met een Hamilton-spuit snel in gelijke delen over drie polypropylene microcentrifugebuisjes met lage binding. Sluit de buisjes en incubeer deze twee uur bij kamertemperatuur om het peptide te laten mengen. Open de buisjes en plaats ze in een speedvac om de oplossing te concentreren. Centrifugeer bij 800 Gs onder vacuüm gedurende ongeveer 15 minuten.
Zorg ervoor dat de temperatuur niet boven de 25 °C komt om proteinedegradatie te voorkomen. Het centrifugeren is voltooid wanneer een heldere, droge peptidefilm onderin de buis zichtbaar is. De film kan moeilijk te zien zijn; sluit de buizen af en bewaar ongebruikte aliquots tot zes maanden bij -80 °C. Voeg in de zuurkast DMSO toe om de peptidefilm te resuspenderen tot een uiteindelijke concentratie van 5 mM en soniceer 10 minuten in een waterbad.
Om een volledige resuspensie van het peptide te garanderen, bewaart u aliquots van 1,6 µL van de 5 mM bèta-amyloïde oplossing bij -20 °C. Elke aliquot mag slechts één keer worden ontdooid. Ontdooi op de dag vóór het experiment één aliquot van de 5 mM bèta-amyloïde oplossing en voeg 98,4 µL steriele fosfaatbuffer toe tot een eindvolume van 100 µL. Vortex gedurende 30 seconden en incubeer gedurende 12 uur bij 4 °C. Om de ligamentisatie te laten starten vóór een experiment, incubeert u verse hippocampuslyse gedurende 90 minuten.
In standaardregistratiebuffer wordt de stimulerende elektrode geplaatst op de collateralen van Shafer en de registreerelektrode op het stratum radiatum. Zodra er een respons is gevonden en de basislijn gedurende 10 minuten stabiel is, wordt het all liga bèta-amyloïd verdund tot 200 nano molar. Bèta-amyloïd bindt in registratiebuffer aspecifiek aan glas, gebruik daarom zoveel mogelijk plastic.
Perfundeer de bèta-amyloïde oplossing gedurende 20 minuten over de coupes. Dien de gewenste toan X-stimulatie toe. Bijvoorbeeld een theta-burst direct na de tetanus, waarna wordt teruggeschakeld naar perfusie met normale registratiebuffer.
Monitor de opname gedurende ten minste twee uur na tetanus om de inductie van LTP te bevestigen en de effecten van de bèta-amyloïdebehandeling te observeren. We hebben zojuist aangetoond hoe u oligomere bèta-amyloïde 1-42 kunt prepareren voor de inductie van een verslechtering van de synaptische plasticiteit in hippocampussneden. Het is bij deze procedure belangrijk om te onthouden dat het te ver uitdrogen van de peptidefilm kan leiden tot een onvolledige aggregatie.
Het is daarnaast essentieel om plastic te gebruiken voor bèta-amyloïde oplossingen om aspecifieke peptidebinding te voorkomen. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bereiden van synthetische Aβ 1-42 oligomeren, waarvan bekend is dat ze de langetermijnpotentiatie in de hippocampus belemmeren, een sleutelmechanisme dat gerelateerd is aan het geheugen. De procedure is essentieel voor het bestuderen van Aβ-geïnduceerde pathologie en voor doeleinden van drugscreening.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Cellulaire biologie
- Onderzoek naar de ziekte van Alzheimer
Achtergrond
- De ziekte van Alzheimer wordt gekenmerkt door verhoogde spiegels van het Aβ 1-42 peptide.
- Aβ 1-42 oligomeren zijn betrokken bij synaptische dysfunctie.
- Long-Term Potentiation (LTP) is een cellulair correlaat van het geheugen.
- Inzicht in de effecten van Aβ kan bijdragen aan de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor de synthese van Aβ 1-42 oligomeren.
- Om de mechanismen van Aβ-geïnduceerde synaptische beperking te onderzoeken.
- Om het screenen van geneesmiddelen voor potentiële behandelingen van de ziekte van Alzheimer te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Resuspensie van synthetisch bèta-amyloïd in HFIP.
- Concentreren van het peptide tot een film voor ligamentisatie.
- Resuspensie in DMSO en incubatie in fosfaatbuffer.
- Beoordeling van de blootstelling aan bèta-amyloïd op acute hippocampale coupes.
Belangrijkste resultaten
- De geprepareerde Aβ 1-42 oligomeren belemmeren de synaptische plasticiteit effectief.
- Het protocol maakt reproduceerbare resultaten mogelijk bij het bestuderen van synaptische dysfunctie.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de rol van Aβ in de pathologie van de ziekte van Alzheimer.
- Potentiële toepassingen in drugscreening voor behandelingen van de ziekte van Alzheimer.
Conclusies
- Het protocol voor de synthese van Aβ 1-42 oligomeren is effectief en betrouwbaar.
- Deze studie vergroot het inzicht in de impact van Aβ op geheugenprocessen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische opties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De door oligomere β-amyloïd1-42 geïnduceerde verslechtering van de hippocampale synaptische plasticiteit biedt een robuust, ziekterelevant model voor onderzoek naar de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer. Dit paradigma maakt mechanistische risicoreductie en voorspellend vertrouwen mogelijk bij de validatie van targets en het screenen van verbindingen voor synaptische dysfunctie. De aanpak ondersteunt de triage van portfolio's door de translationele relevantie te verduidelijken van kandidaat-interventies die gericht zijn op amyloïd-gedreven pathologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het onderzoeken van amyloïde-gestuurde synaptische dysfunctie mogelijk in een gecontroleerd ex vivo-systeem.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door de beperking van LTP te kwantificeren na blootstelling aan oligomeer β-amyloïde.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor hypothesen over de ziekte van Alzheimer op synaptisch niveau.
- Biedt een platform voor voorspellend vertrouwen bij de beoordeling van verbindingen in een vroeg stadium.
Screening & assayontwikkeling
- Stelt een reproduceerbare assay vast voor het kwantificeren van verstoringen in de synaptische plasticiteit in hippocampale coupes.
- Standaardiseert de preparatie en applicatie van oligomeer β-amyloïde voor consistente assay-resultaten.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van kandidaatverbindingen wat betreft hun vermogen om de verstoring van LTP te verminderen.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform voor high-throughput screening-initiatieven.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante mechanismen die betrokken zijn bij vroege Alzheimer-pathologie.
- Biedt continuïteit van moleculaire target-interactie tot functionele synaptische uitkomsten.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door effecten van verbindingen te koppelen aan translationele biomarkers van synaptische gezondheid.
- Ondersteunt de selectie en validatie van preklinische modellen voor daaropvolgende in vivo studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinische validatie door hypothesetoetsing, het verminderen van risico's bij targets en een kwantitatieve beoordeling van de synaptische functie als reactie op amyloïde-blootstelling mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert het toetsen van de nulhypothese met betrekking tot amyloïde-geïnduceerde synaptische beschadiging en de verduidelijking van signaalpaden.
- Screening: Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare assay voor de evaluatie van verbindingen tegen LTP-verstoring.
- Analytiek: Levert kwantitatieve read-outs van synaptische plasticiteit voor robuuste statistische vergelijking tussen condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ex vivo bevindingen met ziekterelevante biomarkers en preklinische eindpunten.
- Hergebruik in Bedrijfsvoering: Biedt een herbruikbare workflow voor doorlopende targetvalidatie en screeningcampagnes binnen portfolio's voor neurodegeneratie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van targets voor de ziekte van Alzheimer.
- Operationele waarde: Verbeterde standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays voor synaptische beperkingen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming en kapitaalefficiëntie door te focussen op functionele uitkomsten die relevant zijn voor de ziekte.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van activa voor neurodegeneratie mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met peptiden, de preparatie van hippocampale coupes en elektrofysiologische registratie.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor LTP-meting en gecontroleerde perfusiesystemen.
- Noodzaakt strikte standaardisatie van peptidepreparatie en assayprotocollen tussen teams.
- Kan aanpassingen vereisen voor verschillende modelsystemen of verbindingklassen, afhankelijk van de oplosbaarheid en bindingseigenschappen.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in peptideaggregatie en gevoeligheid voor experimentele condities.
