Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo's

Het algemene doel van het volgende experiment is om een specifiek lichtgevoelig agens, zoals een chemisch gecageerde fluorescente kleurstof, te fotoactiveren in een levend zebravisembryo met een resolutie van één enkele cel. Dit wordt bereikt door een lichtgevoelig agens in embryo's in het eencellige stadium te injecteren die een levende genetische marker tot expressie brengen, om zo elke cel van belang te lokaliseren en nauwkeurig te targeten. Als tweede stap worden de embryo's opgekweekt en gemonteerd in een laag-smeltende agarose, waardoor het levende embryo geïmmobiliseerd wordt.

Vervolgens wordt tweefotonmicroscopie gebruikt om een zichtbaar fluorescerend transgeen referentiepunt te lokaliseren. Het lichtgevoelige agens wordt daarna geactiveerd in een gewenst brandvlak en de omvang van de fotoactivatie wordt gemonitord. Het lot van de resulterende gelabelde cellen kan vervolgens in latere embryonale stadia worden gevolgd.

Deze procedure kan worden gebruikt voor de activatie van diverse verbindingen met een resolutie van een enkele cel in levende specimens. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals confocale microscopie of flitslampen, is dat het fotoactivatie van relatief diepe weefsels mogelijk maakt op een axiaal niveau van enkele microns met relatief lage fototoxiciteit. De hier gepresenteerde methode wordt gebruikt voor het traceren van de middellijn en kan worden toegepast voor de fotoactivatie van diverse componenten, wat een gerichte controle over ontwikkelings- en fysiologische processen mogelijk maakt. Bereid de avond voor de injectie de paringstanks voor; scheid de mannelijke en vrouwelijke zebravissen van een transgene lijn die een zichtbaar fluorescent kenmerk tot expressie brengt.

In dit experiment drukt de transgene lijn GFP uit onder controle van de neurogene N1-promotor. Ontdooi een aliquot van 5% dextraan-geconjugeerde gecageerde fluoresceïne in 0,2 molaire kaliumchloride op ijs. Verdun de gecageerde fluoresceïne in 0,2 molaire kaliumchloride tot een eindconcentratie van 1%. Houd de fluoresceïne op ijs en bescherm deze tegen licht. Laat de zebraviskruisingen paren, verzamel de bevruchte eieren zodra ze zijn gelegd en spoel ze af zoals beschreven in de tekst. Gebruik een plastic pipet om embryo's in het ééncelstadium over te brengen naar een 1% agarose-injectieplaat die is bedekt met vers E3-medium onder een dissectiemicroscoop.

Gebruik de pipet om de embryo's in de injectiegootjes te positioneren. Breek de punt van een capillaire injectienaald die tot een lange taps toelopende vorm is getrokken. Gebruik een microloader-tip om de naald te vullen met ongeveer 1 µL 1% caged fluoresceïne.

Plaats de gevulde naald in een micromanipulator die is verbonden met een pneumatische micro-injector. Injecteer elk embryo met twee tot drie nanoliters caged fluoresceïne direct in het cytoplasma van de cel. Injecteer ten minste 50 embryo's per experiment.

Breng de geïnjecteerde embryo's over naar een Petrischaal met vers E3-medium en incubeer deze in het donker bij 28,5 °C tot de gewenste ontwikkelingsfase. Om pigmentatie te remmen, wordt 0,1% fenylthreïn aan de embryo's toegevoegd na 24 uur, ter voorbereiding op het monteren van de embryo's. Bedek 15 tot 20 Petrischalen van 60 mm met een dunne laag 1% agarose opgelost in vers E2-medium. Wanneer de agarose is gestold, wordt de schaal onder een dissectiemicroscoop gevuld met E2-medium.

Gebruik scherpe pincetten om de geïnjecteerde embryo's op gecoate platen te plaatsen. Voorkom dat de embryo's aan de lucht worden blootgesteld. Houd een aliquot van 2% low melting point agarose in water bij de hand.

In een warmteblok bij 72 °C. Gebruik een vuurgepolijste glaspipet om één gecoat embryo in ongeveer 150 µL medium over te brengen naar een petrischaal van 60 mm. Plaats een vergelijkbaar volume 2% Agros naast het embryo en meng de twee druppels snel met elkaar om een homogene Agros-druppel van 1% te verkrijgen.

Positioneer het embryo zodanig dat de dorsale zijde naar de objectieflens is gericht. Laat het agarose stollen en dompel het ingebedde embryo onder in E2-medium. Plaats het vers gemonteerde embryo op een platenhouder onder een tweefotonmicroscoop die is uitgerust met een breedband-turntable-laser.

Voordat u begint met het proces van fotoactivatie, maakt u een beeldserie van de meest ventrale naar de dorsale rand van het tot expressie komende weefsel bij 860 nanometer en ruimte. De beelden worden met een tussenpoos van zes micron op het Z-vlak gemaakt. Selecteer het doelvlak in de Z-as voor fotoactivatie en breng dit in focus met GFP als referentiepunt.

Lokaliseer het gebied van interesse. Maak één afbeelding bij 860 nanometer en houd deze open in een apart venster voor een juiste uitlijning. Het is essentieel dat de laser bij 720 nanometer zich in een mode-locked toestand bevindt voordat het menu voor bleach-bewerking wordt geopend.

Gebruik de afbeelding die is gemaakt bij 860 nanometer om het interessegebied of ROI voor fotoactivatie te definiëren. Pas in het venster 'edit bleach' het relatieve laservermogen, het aantal iteraties en de scansnelheid aan. Druk voor fotoactivatie op 'bleach' wanneer de laser is gestopt, schakel terug naar 860 nanometer en neem een enkelvoudige vlakafbeelding op om de intensiteit van het resulterende fotogeactiveerde materiaal te evalueren.

Verzamel een image stack om de z-scan of de dikte van het geactiveerde domein te evalueren. Op deze manier is het mogelijk om de laserintensiteit en de blootstellingsduur empirisch te bepalen. Activeer voor een optimale fotoactivatie van elke kloon of cross-foto alle overgebleven embryo's voor het experiment.

Kweek onder deze condities de gemonteerde, foto-geactiveerde embryo's in het donker bij 28,5 °C in E2-medium met 0,1% fenylthio-ureum tot ze het gewenste ontwikkelingsstadium hebben bereikt. Maak onder een dissectiemicroscoop met een spits scalpel een V-vormige inkeping in het koord nabij het gemonteerde embryo, waarbij de punt van de inkeping naar de kop van het embryo is gericht. Plaats een set gesloten pincetten bij het punt van de inkeping.

Open de pincet voorzichtig om de chorion langs de lengte van het embryo te scheiden en het embryo in het medium vrij te laten. Gebruik na het vrijlaten van elk embryo een vuurgepolijste Pasteurpipet om het in een microcentrifugebuis over te brengen. Fixeer de embryo's gedurende drie uur met 4% formaldehyde in een zuurkast.

Ga bij kamertemperatuur verder met dehydratatie, rehydratatie, kleuring met geconjugeerde alkalische fosfatase, anti-fluoresceïne en alle bijbehorende wasstappen zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Voeg 500 µL gefilterde fast red-oplossing toe aan de embryo's. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur en vul elk uur aan met nieuwe fast red-kleuringsoplossing totdat de gewenste signaal-ruisverhouding is bereikt.

Stop de kleuringsreactie met drie wasbeurten in PBST van vijf minuten elk. Fixeer de kleuring in de zuurkast in 4%formaldehyde gedurende 20 minuten. Was tweemaal in PBST gedurende vijf minuten per keer.

Was de transparante embryo's via een reeks gradiënten van 25%, 50% en 75% glycerol in PBS totdat elk embryo op de bodem van de buis is gezakt. Bewaar de embryo's bij vier graden Celsius tot ze klaar zijn voor visualisatie onder de microscoop. Om de embryo's te monteren voor visualisatie, gebruik een spuit van één milliliter om vier druppels van 20 microliter transparant siliconenvet aan te brengen op een microscoopglas, op de hoeken van een vierkant van 15 millimeter.

Plaats een embryo in ongeveer 200 µL 75% glycerol tussen de vetdruppels. Plaats een dekglas over het embryo. Druk het dekglas voorzichtig recht naar beneden tot de glyceroloplossing de ruimte vult.

De ruimte tussen de druppels vet waarin de embryo's zijn gemonteerd, kan enkele dagen bij vier graden Celsius worden bewaard voordat de visualisatie met confocale microscopie plaatsvindt. Deze afbeelding toont een levend zebravisembryo dat GFP tot expressie brengt onder controle van de neurogenin1-promoter, waarbij in het ééncelstadium de voorgaande methode is gebruikt om caged fluoresceïne-tracerkleurstof te injecteren in het stadium van drie tot vijf somieten.

Een afgebakend gebied van de vier hersenprimordia werd foto-geactiveerd met een tweefotonenlaser, waarna de ontkapselde fluoresceïne-tracerkleurstof kon worden gedetecteerd. Na de foto-activatieprocedure werd het embryo geïncubeerd bij 28,5 °C en werden de hersencellen die de ontkapselde fluoresceïne bevatten getraceerd middels anti-fluoresceïne immunostaining in rood, 24 uur na bevruchting. Let op het kleine aantal gelabelde cellen. Zodra de procedure onder de knie is, kan de foto-activatie in slechts enkele uren worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de optimale parameters te beheersen, zodat nauwkeurige foto-activatie op resolutie van een enkele cel mogelijk is.