Name: Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer fotoactivatie met twee-fotonmicroscopie in levende zebravisembryo's voor celtraceringsonderzoek. Deze methode maakt precieze labelen op enkelcelniveau mogelijk met lage fototoxiciteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dank gaat uit naar Genia Brodsky voor figuur graphics, Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, en Leonid Roitman voor technisch advies en assistentie met de twee-foton uncaging, Maayan Tahor en Suliman Elsadin voor technische bijstand; Uwe Strahle zo vriendelijk het verstrekken van de neurogenin1 verslaggever lijn en Amos Gutnick voor reacties op dit manuscript. Het onderzoek in de Levkowitz lab is ondersteund door de Duits-Israëlische Foundation (subsidie ​​nummer 183/2007); Israel Science Foundation (subsidie ​​nummer 928/08) en de Harriet &amp; Marcel Dekker Foundation. GL is een taak van de Tauro Career Development Chair in biomedisch onderzoek.

Beschrijven we een protocol van de cel etikettering gebruik van gekooide fluoresceïne, maar ook andere foto-activeerbare kleurstoffen en eiwitten op dezelfde manier worden gebruikt. 1. Injectie van Gekooide Fluoresceïne <ol><li> Bereid 5% stockoplossing (5mg gekooid-fluoresceïne / 100 pi 0,2 M KCl) van dextran-geconjugeerde 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) gekooide fluoresceïne (10.000 MW dextran, anionische, Invitrogen, moleculaire probes, Carlsbad, Californië , cat. nee. D-3310). Aliquot en op te slaan in -20 ° C. Merk op dat DMNB-kooi fluoresceïne is gevoelig voor licht en moet worden bewaard in het donker. </li><li> Bereid een injectie via gemaakt van 1% agarose (Sigma, St. Louis, MO, cat. Nee. A9539), zoals beschreven in "De zebravis boek" 1. </li><li> Bereid 2 liter E3 medium door verdunning van een 100 x E3 stamoplossing. </li><li> Op de avond voor injectie, voor te bereiden paring kooien scheiden van het mannetje (s) van de vrouwelijke (s) van het gewenste transgene lijn te drukken een zichtbare fluorescerende mijlpaal (GFP, RFP enz.) die worden gebruikt voor het lokaliseren van de doelcellen voor fotoactivatie. </li><li> Bereid capillaire injectienaalden (Thin Wall glazen capillairen met gloeidraad, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, cat. Nee. TW100F-6) met behulp van een micropipet trekker (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97). </li><li> Dooi een hoeveelheid van 5% kooi fluoresceïne op ijs. </li><li> Verdun de 5% gekooide fluoresceïne stockoplossing in 0,2 M KCl tot een uiteindelijke concentratie van 1%, en blijf op ijs. Vermijd blootstelling aan licht. </li><li> Setup paring kruizen bereid in stap 4. </li><li> Het verzamelen van de bevruchte eicellen zodra ze worden gelegd. Orient een-cellig stadium embryo's in de agarose spuitgietmatrijs bedekt met een E3. </li><li> Met behulp van een microloader tip (Eppendorf, Hamburg, Duitsland, cat. Nee. 5.242 956.003) backfill een injectienaald met ~ 1 pl van 1% gekooide fluoresceïne-oplossing. </li><li> Plaats geladen naald in een micromanipulator aangesloten op een gas-powered microinjector (pneumatisch picopump, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, PV820). </li><li> Pas de injectie volume op 2-3nl en direct te injecteren de gekooide-fluoresceïne in het cytoplasma van de cel. Injecteer een minimum van 50 embryo's per experiment. </li><li> Incubeer embryo's in het donker bij 28,5 ° C in E3 om de gewenste ontwikkelingsstadium. Als embryo's die ouder zijn dan 24 uur na de bevruchting worden geanalyseerd, voeg 0,1% phenylthiourea (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Nee. 22290-9) naar pigmentatie remmen. </li></ol> 2. Embryo Montage <ol><li> Bereid verse E2-oplossing (zie oplossingen voor een deel, kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor een week). </li><li> Coat 60 mm petrischalen met een dun laagje van 1% agarose opgelost in E2 medium. </li><li> Bereid 2% laag smeltpunt agarose (Ultra Pure LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, cat geen 16520100..) Voor het inbedden van: los de agarose in steriel dubbel gedistilleerd water verwarmen in de magnetron aan de kook. Houd de buis kap te openen tijdens het opwarmen. Aliquot 1 mL in microcentrifugebuizen en te houden in een verwarmings-blok bij 72 ° C. </li><li> Verwijder de chorions van de embryo's door zachtjes te trekken van de chorion apart met een scherp pincet (nr. 5). Houden embryo's in E2 oplossing op een agar-gecoate schaal (zie stap 2). Dechorionated embryo's moeten worden behandeld met vuur-gepolijst glas Pasteur pipet omdat ze kunnen blijven plakken aan polypropyleen pipetten. Niet bloot te stellen de dechorionized embryo aan de lucht als deze embryo's zouden kunnen worden beschadigd door de vloeistof oppervlaktespanning. </li><li> Verzamel de geselecteerde embryo in een klein volume van E2 met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet, en plaats het embryo op 60 mm petrischaaltje. Monteer een druppel (~ 150 pi) van 2% agarose (stap 3) naast de embryo. Snel meng de twee druppels op een homogene finale ~ 1% agarose mengsel te verkrijgen en het gebruik van een dissectiemicroscoop oriënteren het embryo met de dorsale zijde van de objectief lens. </li><li> Wacht tot de agarose is gestold en voeg E2 medium totdat de embedded embryo is ondergedompeld in vloeistof. Het verdient de voorkeur om een ​​enkel embryo per schotel te krijgen als het kan worden vrijgesteld van de agarose na het fotoactivatie proces. </li></ol> 3. Fotoactivatie <ol><li> We maken gebruik van een Zeiss LSM 510 META NLO twee-foton microscoop uitgerust met een breedband instelbare (700-1020nm) Mai Tai-HP-femtoseconde laser uit Spectraphysics. </li><li> Plaats de gemonteerde embryo op een bord de houder onder de microscoop. De fluorescerende mijlpaal in het embryo wordt gevisualiseerd met behulp van 40x/0.8W Achroplan water ondergedompeld doelstelling. Voor de volgende stappen die we niet descanned detector (NDD) te gebruiken met een band pass filter (BP) van 500-550nm. </li><li> Als voorwaarde voor het fotoactivatie proces, het verkrijgen van ruimtelijke fluorescerende informatie van de regio van belang door de overname van foto-serie van de meest ventrale aan dorsale deel van de gedetecteerde fluorescerende signaal met twee-foton laser golflengte van 860nm (voor GFP detectie). Te dien einde kan voldoende resolutie worden verkregen met een spanwijdte van 6μm tussen ieder verworven focal plane. </li><li> Selecteer het doelz-vlak voor fotoactivatie en breng deze regio in beeld. Afhankelijk van het doel van het experiment, kan de regio van belang kan zijn binnen of buiten de GFP zichtbaar landmark. Neem een ​​enkel beeld in deze z-vlak. Sla de afbeelding en bewaar deze te openen in een apart venster. </li><li> Stel de twee-foton laser golflengte 720nm en wanneer de laser is in mode-slot open de 'Edit bleekmiddel' menu. Definiëren de regio van belang (ROI) voor fotoactivatie volgens de afbeelding die op 860nm (stap 4) met behulp van de 'Define regio' menu. Het is cruciaal om de ROI op deze afbeelding te selecteren na het verschuiven van de laser golflengte 720nm als de laatste handeling verandert de x, y posities van de waargenomen veld. </li><li> Pas de volgende parameters voor fotoactivatie in het menu 'Bewerken bleekmiddel' (zie stap 9): a) de relatieve laservermogen; b) het aantal iteraties, c) scansnelheid. </li><li> Druk op 'Bleach' in het venster 'Bewerken bleekmiddel' en wacht tot de laser stopt. </li><li> Schakel terug naar 860nm, het verwerven van een enkel vlak afbeelding om de intensiteit van het resulterende gefotoactiveerd materiaal en een tweede reeks van het beeld overname van de Z-span (dikte) van de geactiveerde domeinnaam te evalueren evalueren. </li><li> Beschouw de volgende parameters voor fotoactivatie: <ol class="lalpha"><li> Men moet empirisch vast te stellen de optimale omstandigheden voor fotoactivatie door het variëren van twee parameters: laser intensiteit en duur van fotoactivatie. De relatieve laservermogen kan worden gecontroleerd door de akoestisch-optische modulator (AOM) transmissie. De duur van fotoactivatie is een functie van het aantal iteraties en de scansnelheid. </li><li> Bepaal het lineaire bereik van de fluorescentie-intensiteit, om verzadiging van het Uncaged fluorescentie te vermijden. </li><li> Er is een lineaire correlatie bestaat tussen de verkregen fluorescentie-intensiteit van de Uncaged moleculen en de z-as spanwijdte van de gefotoactiveerd kloon 2. </li></ol></li></ol> 4. Detectie van de Uncaged Fluoresceïne <ol><li> Na fotoactivatie, verhogen de embryo's in het donker bij 28,5 ° C in E2 medium met 0,1% PTU om het uiterlijk van de pigmentatie van de huid te voorkomen. </li><li> Op het gewenste ontwikkelingsstadium, verwijder het embryo uit de agarose onder een dissectie microscoop. Met behulp van een puntig scalpel, dus maak een "V"-vormige incisie in de agarose de buurt van de embryo dat de "V" wijst naar het hoofd van de embryo's. Plaats een gesloten tang op het punt van de "V" bij het hoofd van het embryo en duw opent de tang het scheiden van de agarose langs de lengte van het embryo en het vrijgeven van het embryo in het medium. </li><li> Verzamel de embryo's met een vuur-gepolijste Pasteur pipet en bevestig met paraformaldehyde (PFA, 4% in 1 x PBS, pH 7,2) voor een van beide 3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de fixeer-oplossing en spoel 2-3 keer in PBST voor minstens 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de embryo's met 100% methanol gedurende 10 minuten, te vullen met verse methanol en incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste twee uur. </li><li> Hydrateren embryo's van opeenvolgende incubaties (5 min elk) in een reeks van verdunde methanol in PBSTr: 80%, 60%, 40% en 20%. Was 2 x 10 minuten in PBSTr. </li><li> Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in 500 pi van Blocking oplossing. </li><li> Voeg een anti-fluoresceïne-alkalische fosfatase (AP) Fab fragmenten (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nee. 11426338910), verdund 1:500 in het blokkeren oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C (plaats microcentrifugebuizen op hun kant) . </li><li> Was 5 x 15 minuten in PBST. </li><li> Was 5 minuten in 0,2 M NaCl in TNT. </li><li> Was 5 minuten in 0,4 M NaCl in TNT. </li><li> Equilibreren 3 x 5 minuten in vers bereide Prestain oplossing. </li><li> Los een Fast Red tablet (Roche, Palo Alto, CA, cat. Nee. 11496549001) in 2 ml Prestain oplossing. Het wordt aanbevolen om de oplossing om met Whatman nr. 2 papier om niet-opgeloste deeltjes weg te laten filteren. Als alternatief, spin down oplossing en gebruik van de heldere bovenstaande vloeistof af. </li><li> Voeg 500 ul Fast Red oplossing aan elke buis, incubeer in het donker bij kamertemperatuur, en de monitor kleur ontwikkeling tot het gewenste signaal-achtergrond verhouding is bereikt (20 minuten tot enkele uren). Als achtergrond ontwikkelt, transfer naar 4 ° C. Na een uur incubatie, te vullen met een nieuwe Fast Red kleuroplossing. </li><li> Stop de kleuring reactie van 3 x 5 minuten wassen in PBST. </li><li> Fix voor 20 minuten in 4% PFA bij kamertemperatuur. </li><li> Was 2 x 5 minuten in PBST. </li><li> Duidelijk embryo's door middel van een serie van 25%, 50% en 75% glycerol in PBS tot embryo's worden afgerekend op de bodem van de buis. Embryo's kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor een paar dagen. </li></ol> 5. Fluorescerende Visualisatie van de Uncaged omgeving <ol><li> Bereid een microscoop glijbaan voor montage: het gebruik van een 1 ml injectiespuit toe te passen vier plaatsen van duidelijke siliconenvet op de dia, geplaatst op een afstand van ~ 15 mm van elkaar. Monteer het embryo in de center in ~ 200 pi van 75% glycerol en plaats een dekglaasje (nr. 0; 18x18mm) aan de bovenkant en zachtjes tegen de silicone tot de glycerol oplossing beslaat het oppervlak tussen de dia's te duwen. </li><li> Plaats de gemonteerde embryo op het podium en breng het in beeld met behulp van een 40x objectief. Schaf een confocale Z-serie van afbeeldingen met behulp van 488nm en 543nm Argon HeNe lasers als de excitatie bron. </li><li> De z-as spanwijdte van de photoactivatated domein kan worden geanalyseerd met behulp van 3D-reconstructie van de Uncaged embryo met behulp van een beeldanalyse-software. </li></ol> 6. Oplossingen <table border="1"><tbody><tr><td> 100 x E3 </td><td> 174mM NaCl, KCl 21mm, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> 20 x E2 </td><td> 0,3 M NaCl, 10 mM KCl, 20mm CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 mm Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtraat en bewaar bij kamertemperatuur </td></tr><tr><td> 1 x E2 </td><td> Verdun 20 x E2 in dubbel gedistilleerd water en voeg vers gemaakte NaHCO 3 (aan de uiteindelijke concentratie van 0,7 mm), penicilline en streptomycine (verdun pen STREP oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 x 100 E, die van penicilline en streptomycine 100mg per ml (Invitrogen bevat , Carlsbad, CA, cat. nee. 15140-122)) </td></tr><tr><td> PBST </td><td> 0,1% Tween-20 in PBS </td></tr><tr><td> PBSTr </td><td> 0,3% Triton in PBS </td></tr><tr><td> Blockingbuffer </td><td> 10% BSA, 0,3% Triton, een% DMSO in PBS </td></tr><tr><td> TNT </td><td> 100mm Tris-HCl pH-7.5, 150mm NaCl, 0,5% Tween-20 in dubbel gedistilleerd water </td></tr><tr><td> Prestain oplossing </td><td> 100mm Tris-HCl pH-8.2, 0,4 miljoen NaCl, 0,1% Tween-20 in dubbel gedistilleerd water </td></tr></tbody></table> 7. Representatieve resultaten Een voorbeeld van het gebruik van twee-foton microscopie aan agenten photoactivate in een levend zebravis embryo wordt gepresenteerd. Met behulp van een soortgelijke aanpak die we eerder volgde de lijn van de gefotoactiveerd gelabeld neurale voorlopercellen in de zebravis hersenen 2,3. Figuur 1 toont fotoactivering van een gekooide fluoresceïne geconjugeerd tracer kleurstof in voorste neurale plaat van de zebravis embryo's met een neurog1:: GFP reporter transgene, die diende als een live-intrinsieke mijlpaal. Embryo's werden geïnjecteerd met gekooide fluoresceïne aan de ene cel podium en ingebed in agarose in knopstadium. Bij 3 - 5-somiet stadium de ruimtelijke coördinaten werden gemeten in de neurog1:: GFP transgene embryo naar de regio van belang (ROI) te bepalen voor uncaging (Figuur 1A, A '). We Uncaged het fluoresceïne afstamming tracer in een specifiek domein van de neurale plaat (Figuur 1B, B '). Vervolgens was het lot van dit gegeven gelabeld neurale progenitor subdomein vastgesteld op prim5 (24 uur na bevruchting) fase door immunokleuring van de Uncaged fluoresceïne (figuur 1C, C '). De omvang van twee-foton laser uncaging, dat wil zeggen de intensiteit van de Uncaged fluorescentie en de dikte van de gefotoactiveerd domein (z-span), kunnen worden aangestuurd door het aanpassen van twee parameters: laser intensiteit en duur. Dit laatste kan worden gecontroleerd door aanpassing van de iteratie aantal en de scansnelheid (zie deel 3, stap 9; Russek-Blum, 2009). In het voorbeeld in figuur 1, gebruikten we de relatieve laservermogen van 12% AOM transmissie, 20 iteraties en scansnelheid van 25,6 μsec / pixel. Met behulp van deze instellingen hebben we het label een ROI met 90 tot 10 cellen en een gefotoactiveerd z-spanwijdte van 30μm (~ 1-2 cel rijen). <img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een vertegenwoordiger resultaat van fotoactivering van gekooide fluoresceïne in levende zebravis embryo met behulp van twee-foton microscopie. Schematische afbeelding (AC) en representatieve beelden (A'-C ') van de fotoactivatie proces. Live-zebravis embryo (A, A ') tot uitdrukking GFP onder de controle van neurogenin-1 promotor (neurog1:: GFP), dat was met gekooide fluoresceïne kleurstof ingespoten tracer op de 1 cellig stadium. Bij de 3-5 - somiet podium, was een discrete deel van de voorhersenen primordium (diencephalon) gefotoactiveerd en de Uncaged fluoresceïne kleurstof tracer kon worden gedetecteerd (B, B '). Na de fotoactivatie procedure, was het embryo geïncubeerd bij 28,5 ° C en de hersenen cellen met de Uncaged fluoresceïne werden opgespoord door anti-fluoresceïne immunokleuring 24 uur na de bevruchting (HPF, C, C '). Dien, diencephalon,. Tel, telencephalon..

<ol><li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li>
<li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li>
<li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+precursors+of+glutamate%3A+synthesis%2C+photochemical+properties%2C+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li>
<li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li>
<li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li>
<li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li>
<li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li>
<li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA%2FDNA+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li>
</ol>

Foto-activeerbare verbindingen zijn moleculen waarvan de functie wordt gemaskeerd totdat ze worden verlicht met een specifieke golflengte (meestal UV), het induceren van een fotochemische reactie die de moleculen omgezet in een biologisch of chemisch actieve toestand. Deze probes geven een zeer krachtige tools in de celbiologie onderzoek, omdat de activering kan nauwkeurig worden tijdelijk en ruimtelijk gecontroleerd door beperking van hun blootstelling aan licht. Het grote voordeel van mult...

<table><tbody><tr><td>Dextran-geconjugeerde 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) gekooide fluoresceïne (10.000 MW dextran, anionisch)</td><td>Invitrogen</td><td>D-3310</td><td>moleculaire probes</td></tr><tr><td>Agarose voor injectiegoot en gecoate platen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Dunwandige glazen capillairen met filament</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet-puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microloader-tip</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatische picopomp</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Fenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22290-9</td><td></td></tr><tr><td>Agarose met laag smeltpunt voor montage van embryo's</td><td>Ultra Pure LMP agarose</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fluoresceïne-alkalische fosfatase (AP) Fab-fragmenten</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red</td><td>Roche Group</td><td>11496549001</td><td></td></tr></tbody></table>

twee-foton-based fotoactivatie in de live zebravis embryo&#39;s

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Fotoactivatie van target verbindingen in een levend organisme heeft bewezen een waardevolle benadering van de verschillende biologische processen, zoals de embryonale ontwikkeling, cellulaire signalering en volwassen fysiologie te onderzoeken. In dit opzicht is het gebruik van multi-foton microscopie mogelijk kwantitatieve fotoactivering van een bepaalde licht reagerende agent in diepe weefsels op een enkele cel resolutie. Omdat zebravis embryo&#39;s worden optisch transparant, kan hun ontwikkeling worden gevolgd in vivo. Deze eigenschappen maken de zebravis een perfecte modelorganisme voor het regelen van de activiteit van een groot aantal chemische stoffen en de eiwitten door gericht licht. Hier beschrijven we het gebruik van twee-foton microscopie om de activering van chemisch gekooide fluoresceïne, die op zijn beurt laat ons toe om het lot van cellen te volgen in live zebravis embryo&#39;s induceren. We maken gebruik van embryo&#39;s uiten van een live-genetische mijlpaal (GFP), te lokaliseren en precies te richten alle cellen van belang. Deze procedure kan eveneens worden gebruikt voor exacte licht geïnduceerde activatie van eiwitten, hormonen, kleine moleculen en andere gekooide verbindingen.

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo&#39;s. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Fotoactivatie van doelverbindingen in een levend organisme is een waardevolle methode gebleken om diverse biologische processen te onderzoeken, zoals embryonale ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een specifiek lichtgevoelig agens, zoals een chemisch gecageerde fluorescente kleurstof, te fotoactiveren in een levend zebravisembryo met een resolutie van één enkele cel. Dit wordt bereikt door een lichtgevoelig agens in embryo's in het eencellige stadium te injecteren die een levende genetische marker tot expressie brengen, om zo elke cel van belang te lokaliseren en nauwkeurig te targeten. Als tweede stap worden de embryo's opgekweekt en gemonteerd in een laag-smeltende agarose, waardoor het levende embryo geïmmobiliseerd wordt.Vervolgens wordt tweefotonmicroscopie gebruikt om een zichtbaar fluorescerend transgeen referentiepunt te lokaliseren. Het lichtgevoelige agens wordt daarna geactiveerd in een gewenst brandvlak en de omvang van de fotoactivatie wordt gemonitord. Het lot van de resulterende gelabelde cellen kan vervolgens in latere embryonale stadia worden gevolgd.Deze procedure kan worden gebruikt voor de activatie van diverse verbindingen met een resolutie van een enkele cel in levende specimens. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals confocale microscopie of flitslampen

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een methode voor het monteren van zebravis embryo's voor de lange termijn imaging, twee-foton beeldvorming en weefsel-schade technieken en time-lapse confocale beeldvorming.

Twee-foton axotomy en time-lapse confocale imaging in levende zebravis embryo&#39;s

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

Hier presenteren we een methode voor het foto-geactiveerd schakelen van photoconverteerbare fluorescerende eiwitten (PCFPs) in het levende zebravisembryo en het verdere volgen van het photoconverteerde eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen te monitoren die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme.

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Optogenetische manipulatie van signaalroutes kan een krachtige strategie zijn om te onderzoeken hoe signalering wordt gedecodeerd bij ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van licht-zuurstof-spanningsgevoelige domeingebaseerde Nodale en botmorfogene proteïne (BMP) signaleringsactivatoren in het vroege zebravisembryo.

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

Leer fotoactivatie met twee-fotonmicroscopie in levende zebravisembryo's voor celtraceringsonderzoek. Deze methode maakt precieze labelen op enkelcelniveau mogelijk met lage fototoxiciteit.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo's

Meer video's verkennen