Directe Start van een replicatievork vast door een Head-On RNA polymerase

Het algemene doel van deze procedure is om het lot van de Repli-zone en RNA-polymerase of RNAP te observeren na een frontale botsing. Dit wordt bereikt door eerst het transcriptiecomplex te assembleren op gebiotineerd DNA en dit te immobiliseren op Stripp-tabletten en kraaltjes, wat resulteert in een gestopt RNAP-elongatiecomplex. De tweede stap van de procedure is het ligeren van vooraf voorbereid gevorkt DNA aan het RNAP-elongatiecomplex om een replicatievork stroomafwaarts van de frontale RNAP te vormen.

De derde stap van de procedure is het assembleren van de replizone en het initiëren van de synthese van de leidende streng bij de replicatievork. De laatste stap van de procedure is het isoleren van het DNA van de magnetische kraaltjes en het zuiveren van het DNA via een PCR-opzuikingskolom. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die aantonen dat de roso stopt bij een botsing met het frontale transcriptiecomplex, via een alkalische agarosegel van de gezuiverde radioactief gemarkeerde DNA-producten.

Hallo, ik ben Richard Pomerance van het laboratorium van Mike O'Donnell aan de Rockefeller University. Vandaag laat ik u de procedure zien om een botsing van het ribosoom met een RNA-polymerase in de vaste fase uit te voeren. Ik gebruik deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe het replicatieproces wordt beïnvloed door transcriptiecomplexen langs het DNA.

Laten we beginnen. Om dit protocol te starten, mengt u RNAP holo-enzym met een gebiotineerde DNA-template van 3,6 KB die de T7 A1-promotor bevat in 100 µL buffer A. Incubeer het mengsel 10 minuten bij 37 °C. Voeg na de incubatie van 10 minuten ribonucleotiden toe: adenosinetrifosfaat, cytidinefosfaat en adenine-uridine, wat de RNA-synthese zal beperken tot 20 nucleotiden.

Incubeer de oplossing nog 10 minuten bij 37 °C om het gestopte RNase-elongatiecomplex op de beads te immobiliseren. Voeg de oplossing toe aan streptavidine-gecoate magnetische beads. Laat het mengsel 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Zuiver het geïmmobiliseerde gestopte RNAP-elongatiecomplex door de kraaltjes te wassen met 0,9 milliliter hoogzoute buffer. Om na elke wasbeurt aspecifieke R-N-A-P-D-N-A-complexen te verwijderen, dient het supernatant via magnetische scheiding te worden verwijderd. Deze wasstap moet vijf keer worden herhaald.

Was de beads vervolgens nog twee keer met 0,9 milliliter buffer A. Na de laatste wasbeurt kan de downstream replicatievork worden geassembleerd om een replicatievork downstream van de head-on RNAP te vormen. Resuspendeer de magnetische strip met de beads die gebonden zijn aan het gestopte RNAP-elongatiecomplex in 100 microliter New England Biolabs buffer vier. Voeg vervolgens 10 units garnalen-alkalische fosfatase of SAP 1 toe en incubeer het monster 10 minuten bij 37 graden Celsius. Was de beads drie keer met 0,9 milliliter buffer A. Resuspendeer de beads daarna in 50 microliter Quick T4-ligatiereactiebuffer.

Voeg twee µL quick T4-ligase toe aan het voorbehandelde gevorkte DNA en incubeer de oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was de beads vervolgens nog drie keer met 0,9 mL buffer A. Meng hexameer-DNA-helicase met de magnetische streptavidine-beads die zijn gebonden aan het gestopte RNAP-elongatiecomplex en de stroomafwaartse replicatievork. Bereid de oplossing voor in 150 µL buffer A en incubeer deze gedurende 30 seconden bij 23 °C.

Na de korte incubatie van 32 minuten bij 23 °C wordt aan polymerase three beta clamp A-T-P, D-G-T-P, D-A-T-P, α-P³² gelabelde DGTP en α-P³² gelabelde DATP toegevoegd tot een volume van 200 µL. Incubeer het monster gedurende vijf minuten bij 37 °C.

Start de replicatie door enkelstrengs-DNA-bindend eiwit, DCTP en DTTP toe te voegen. Voeg daarnaast alpha P 32-gelabelde DTTP en DCTP toe tot een eindvolume van 250 µL. Beëindig de reacties na 10 minuten door 12 µL 0,5 M EDTA toe te voegen.

Kook vervolgens de strp din-beads om het DNA van de beads vrij te maken. Verwijder eventueel resterend DNA door de beads 30 minuten lang bij 50 °C te behandelen met proteinase K. Kook de beads opnieuw en verwijder het supernatant via magnetische scheiding.

Purificeer het gecombineerde supernatant dat het DNA bevat met de Kyogen PCR cleanup kit. Analyseer tot slot de gezuiverde radiogemarkeerde DNA-producten in een alkalische agarosegel. Een botsing van de zone met een head-on RNAP resulteert gewoonlijk in twee producten met een lengte van 2,5 KB en 3,6 KB. Het product van 2,5 KB vertegenwoordigt de lengte van het DNA van de vork tot de gestopte RNAP.

Dit is het gevolg van replicatiestagnatie bij een botsing met de RNAP. Het product van 3,6 KB vertegenwoordigt DNA van volledige lengte en is het resultaat van ofwel onvolledige bezetting van de promoter door RNAP, ofwel gedeeltelijke replicatie-readthrough van de tegengestelde RNAP. Een goed resultaat is wanneer ongeveer 50% DNA van volledige lengte wordt geproduceerd.

In sommige gevallen treedt er echter een lagere bezetting van de promoter door RNAP op en wordt een hoger percentage DNA van volledige lengte waargenomen. Dit komt doordat een grotere populatie replicatiezones in de afwezigheid van een gestopte RNAP geen frontale botsing met RNAP ondervindt, wat resulteert in uitsluitend DNA van volledige lengte. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe replicatie en solid-phase synthese kunnen worden uitgevoerd in de aanwezigheid van een gestopt RNA-polymerase-elongatiecomplex dat aan het DNA is gebonden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het gestopte transcriptiecomplex te wassen met een hoge zoutconcentratie om overtollig RNA-polymerase te verwijderen, dat aspecifiek aan het DNA bindt en de replicatie remt.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.