Name: Directe Start van een replicatievork vast door een Head-On RNA polymerase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer hoe de replicatievork stilstaat bij een frontale botsing met RNA-polymerase en hoe Mfd de herstart van DNA-replicatie bevordert. Deze methode onthult essentiële mechanismen van transcriptie-replicatie-interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn vooral dankbaar voor het verstrekken van Seth Darst RNAP en MFD eiwitten en expressievectoren. We zijn ook bedanken Sergei Borukhov voor het verstrekken van Greb en Dan Zhang voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (MOD) en door een Marie-Josee en Henry Kravis Fellowship aan de Rockefeller University (RTP).

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz en O&#39;Donnell, Science 327, 590-592 (2010)</a> . 1. Montage van een stil RNAP rek complex werd als volgt uitgevoerd: 500 nM uiteindelijke concentratie van E. coli RNAP σ 70 HE werd gemengd met 5 nM uiteindelijke concentratie van een gebiotinyleerd 3,6 kb DNA-template met daarin de T7A1 promoter in 100 ul buffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) gedurende 10 min bij 37 ° C. 100 pM van de APU en 40 uM elk van GTP, ATP, en CTP werden toegevoegd voor een extra 10 min bij 37 ° C. 2. Immobilisatie van het gestopt RNAP rek complex op streptavidine parels werd als volgt uitgevoerd: 200 ul van streptavidine magnetische gecoate kralen (Invitrogen) werden toegevoegd aan de reactie hierboven voor 10 min bij kamertemperatuur. 3. Zuivering van het geïmmobiliseerde gestopt RNAP rek complex werd als volgt uitgevoerd: De kralen (van boven) werden gewassen 5 keer met 0,9 ml buffer A met 0,75 M NaCl, 200 ug / ml heparine en 20 microgram / ml ssDNA (Het supernatant werd verwijderd na elke wasbeurt stap voor magnetische scheiding.) Vervolgens wordt het bolletjes werden gewassen 2 keer met 0,9 ml buffer A. 4. Vorming van een replicatie vork stroomafwaarts ten opzichte van de kop-op RNAP werd als volgt uitgevoerd: De kralen (van boven) werden geresuspendeerd in 100 pi van de New England Biolabs buffer 4 en 10 eenheden van Sap I (New England Biolabs) werd toegevoegd gedurende 10 min bij 37 ° C. De kralen werden 3 maal gewassen met 0,9 ml buffer A en vervolgens geresuspendeerd in 50 ui van Quick T4 ligatiereactie buffer (New England Biolabs). 2 pi van Quick T4 ligase (New England Biolabs) werd toegevoegd, samen met 6 nM uiteindelijke concentratie van de pre-gegloeid gevorkte DNA (RP10, RP22, RP25) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De kralen werden 3 maal gewassen met 0,9 ml buffer A. 5. Vergadering van de replisome en de inleiding van de leidende streng synthese bij de replicatie vork werd als volgt uitgevoerd: 448 pmol van DnaB (zoals hexameer) werd geïncubeerd met de kralen 150 ul buffer A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glycerol) gedurende 30 s bij 23 ° C. 4,9 pmol van Pol III * (Pol III HE minus β), 15 pmol van β, 2 mM ATP, en 60 uM elk van dGTP en dATP werden toegevoegd tot een volume van 200 ul en geïncubeerd nog eens 5 min op 37 ° C. Replicatie werd gestart op het toevoegen van 10 microgram SSB en 24 pM elk van dATP en dTTP, samen met [α-32 P] dTTP en [α-32 P] dCTP (specifieke activiteit, 3,000-5,000 cpm / pmol) tot een eindvolume van 250 pi. Reacties waren beëindigd na 10 min op het toevoegen van 12 pi van 500 mM EDTA. 6. Zuivering en concentratie van de radio-gelabelde DNA-producten werd als volgt uitgevoerd: De kralen (van boven) werden gekookt na de reactie werd beëindigd om het DNA te verwijderen uit de kralen. Eventueel resterende DNA dat aan de kralen werd verwijderd door de behandeling van de korrels met proteinase K in een volume van 10 ul gedurende 30 minuten bij 50 ° C. De parels werden dan gekookt en het supernatant werd verwijderd door middel van magnetische scheiding. De gecombineerde supernatant met het DNA werd gezuiverd met behulp van de PCR Qiagen Cleanup kit. Gezuiverd radio-gelabelde DNA-producten werden vervolgens geanalyseerd in een alkalisch agarose gel. * Replicatie in de afwezigheid van een head-on RNAP gestopt verlenging complex werd uitgevoerd zoals hierboven, echter, σ 70 werd weggelaten. Representatieve resultaten: Botsing van de replisome met een kop-on RNAP resulteert meestal in twee producten van 2,5 kb en 3,6 kb in lengte. Het 2,5 kb product vertegenwoordigt de lengte van het DNA van de vork aan de RNAP gestopt en de resultaten van replisome stalling bij botsing met de RNAP. Het 3,6 kb product vertegenwoordigen full-length DNA en de resultaten van beide onvolledige bezetting van de promotor door RNAP of gedeeltelijke replisome lezen-through van het hoofd-on RNAP. Een goede of een nauwkeurig resultaat toont aan dat ongeveer 50% full-length DNA wordt geproduceerd. Echter, in sommige gevallen minder bezetting van de promotor door RNAP optreedt en een hoger percentage van de volledige lengte DNA wordt waargenomen, omdat een grotere bevolking van replisomes niet geconfronteerd met een head-on RNAP. Replicatie in de afwezigheid van een stilstand RNAP resulteert in enige full-length DNA (3,6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur. 1 De replisome is belemmerd door een head-on RNAP. (A) Experimentele opstelling. Een E. coli RNAP gestopt rek complex was gemonteerd op een gebiotinyleerde DNA dat de T7A1 promoter zoals eerder beschreven (9). In het kort, was een stil rek complex gevormd 20 basispunten stroomafwaarts van de promoter door incuberen RNAP holoenzyme met gebiotinyleerd DNA gedurende 10 minuten, gevolgd door de toevoeging van Apu, GTP, ATP, en CTP voor nog eens 10 minuten. Streptavidine kralen werden toegevoegd voor een extra 10 minuten toen de bolletjes werden vijf keer gewassen met elk 0,9 ml van de buffer die 0,75 NaCl, 200 mg / ml heparine, en 100 nM enkelstrengs DNA tot instabiele RNAP-DNA complexen en overtollige NTP&#39;s te verwijderen . Het DNA werd vervolgens gedigereerd met Sapi, gewassen, en geligeerd aan een pre-uitgegloeid gevorkte DNA. De kralen werden weer voor gewassen om de montage van de replisome. De promotor ligt op 2,5 kb van de vork en is gericht op directe transcriptie de richting van de vork. (B) DnaB werd toegevoegd toen de replisome werd samengesteld en replicatie werd ofwel ingewijd in de aanwezigheid (laan 2) of afwezigheid (baan 1) van een head-on RNAP.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
<li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li>
<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li>
<li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+barriers%3A+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li>
<li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+mechanics%3A+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li>
<li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li>
<li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li>
<li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li>
<li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+Transcription+repair+coupling+factor+%28Mfd+protein%29+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li>
<li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li>
<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

Wassen van het gestopte rek complex gebonden aan de kralen met een hoog zoutgehalte is van cruciaal belang om eventuele instabiele of niet-specifiek gebonden RNAP moleculen te verwijderen. RNAP heeft een zeer hoge affiniteit voor primer-template type DNA-structuren. Zo is het noodzakelijk om dergelijke niet-specifieke RNAP-DNA complexen verwijderen om replicatie uit te voeren vanaf de primer-template. Het concentreren van de radio-gelabelde DNA-producten met behulp van de Qiagen PCR zuivering kit is ook van cruciaal belang voor het verkrijgen van een voldoende hoog radioactief signaal dat kan worden waargenomen in de gel.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

directe start van een replicatievork vast door een head-on rna polymerase

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggereren dat replicatie vorken zijn gearresteerd te wijten aan ontmoetingen met het hoofd-on transcriptie complexen. Toch is het lot van de replisome-en RNA-polymerase (RNAP) na een frontale botsing is onbekend. Hier vinden we dat de E. coli replisome kramen op botsing met een head-on transcriptie complex, maar in plaats van storten, de replicatie vork blijft zeer stabiel en uiteindelijk hervat rek na het verplaatsen van de RNAP uit DNA. We vinden ook dat de transcriptie-reparatie koppeling factor, MFD, directe herstart van de vork na de botsing door het vergemakkelijken van verplaatsing van de RNAP bevordert. Deze bevindingen tonen de intrinsieke stabiliteit van de replicatie apparatuur en een nieuwe rol voor de transcriptie-gekoppelde reparatie route in het bevorderen van replicatie verleden een RNAP blok.

Het lot van de replisome na een botsing met een head-on RNA-polymerase (RNAP) is onbekend. We vinden dat de replisome kraampjes bij botsing met een head-on RNAP, maar rek hervat na het verplaatsen van de RNAP uit DNA. MFD bevordert replicatie opnieuw op te starten door het vergemakkelijken van verplaatsing van de RNAP na de botsing.

Directe Start van een replicatievork vast door een Head-On RNA polymerase

In vivo-studies suggereren dat replicatievorken worden gestopt door ontmoetingen met frontale transcriptiecomplexen. Toch blijven het lot van het replisoom en RNA ...

Het algemene doel van deze procedure is om het lot van de Repli-zone en RNA-polymerase of RNAP te observeren na een frontale botsing. Dit wordt bereikt door eerst het transcriptiecomplex te assembleren op gebiotineerd DNA en dit te immobiliseren op Stripp-tabletten en beads, wat zal resulteren in het gestopte RNAP-elongatiecomplex. De tweede stap van de procedure is het ligeren van vooraf gevormd gevorkt DNA aan het RNAP-elongatiecomplex om een replicatievork stroomafwaarts van de frontale RNAP te vormen.De derde stap van de procedure is het assembleren van de replizone en het initiëren van de synthese van de leidende streng bij de replicatievork. De laatste stap van de procedure is het isoleren van het DNA van de magnetische kralen en het zuiveren van het DNA via een PCR-opreinigingskolom. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via een alkalische agarosegel van de gezuiverde radiogemarkeerde DNA-producten aantonen dat de roso stopt bij een frontale botsing met het transcriptiecomplex.Hoi, ik ben Richard Pomerance van het laboratorium van Mike O'Donnell aan de Rockefeller University. Vandaag laat ik u de procedure zien voor het uitvoeren van een collisie van het ribosoom met een RNA-polymerase in de vaste fase. Ik gebruik deze procedure in ons laboratorium om te bestuderen hoe het replicatieproces wordt beïnvloed door transcriptiecomplexen langs het DNA.Laten we beginnen. Meng voor dit protocol RNAP holo-enzym met een gebiotineerd 3,6 KB DNA-template dat de T7 A1-promotor bevat in 100 µL buffer a en incubeer het mengsel 10 minuten bij 37 °C. Voeg na de incubatie van 10 minuten ribonucleotiden adenosine-trifosfaat, cytidine-fosfaat en adenine-uridine toe, waarmee de RNA-synthese wordt beperkt tot 20 nucleotiden.Incubeer de oplossing nog 10 minuten bij 37 °C om het gestopte RN ape-elongatiecomplex op de kralen te immobiliseren. Voeg de oplossing toe aan streptavidine-gecoate magnetische kralen. Laat het mengsel 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur.Zuiver het geïmmobiliseerde gestopte RNAP-elongatiecomplex door de kraaltjes te wassen met 0,9 milliliter hoog-zoutbuffer. Verwijder na elke wasbeurt het supernatant via magnetische scheiding om aspecifieke R-N-A-P-D-N-A-complexen te verwijderen. Deze wasbeurt dient vijf keer herhaald te worden.Was de kralen vervolgens nog twee keer met 0,9 milliliters buffer A. Na de laatste wasbeurt kan de downstream replicatievork worden geassembleerd om een replicatievork downstream van de head-on RNAP te vormen. Resuspendeer de magnetische strip met de kralen die gebonden zijn aan het gestopte RNAP-elongatiecomplex in 100 microliters New England Biolabs buffer vier. Voeg vervolgens 10 units shrimp alkaline phosphatase of SAP toe en incubeer het monster 10 minuten bij 37 degrees Celsius. Was de kralen drie keer met 0,9 milliliters buffer A. Resuspendeer de kralen daarna in 50 microliters quick T four ligatiereactiebuffer.Voeg twee µL quick T4-ligase toe aan het vooraf gevormde geforkte DNA en incubeer de oplossing 10 minuten bij kamertemperatuur. Was daarna de beads nog drie keer met 0,9 mL buffer A. Meng hexameer-DNA-helicase met de magnetische streptavidine-beads die zijn gebonden aan het gestopte RNAP-elongatiecomplex en de stroomafwaartse replicatievork. Bereid de oplossing voor in 150 µL buffer A en incubeer deze 30 seconden bij 23 °C.Na de korte incubatie bij 23 °C, voeg aan polymerase drie beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P α P 32 gelabelde DGTP en α P 32 gelabelde DATP toe tot een volume van 200 µL. Incubeer het monster vijf minuten bij 37 °C.Start de replicatie door enkelstrengs-DNA-bindend eiwit, DCTP en DTTP toe te voegen. Voeg daarnaast alpha P 32-gelabelde DTTP en DCTP toe tot een eindvolume van 250 µL. Beëindig de reacties na 10 minuten door 12 µL 0,5 M EDTA toe te voegen.Kook vervolgens de strp din-beads om het DNA van de beads vrij te maken. Verwijder eventueel resterend DNA door de beads 30 minuten lang te behandelen met proteinase K bij 50 °C. Kook de beads opnieuw en verwijder het supernatant via magnetische scheiding.Zuiver het gecombineerde supernatant dat het DNA bevat met de Kyogen PCR-zuiveringskit. Analyseer vervolgens de gezuiverde radiogemarkeerde DNA-producten in een alkalische agarosegel. Een botsing van de zone met een RNAP resulteert gewoonlijk in twee producten met een lengte van 2,5 KB en 3,6 KB. Het product van 2,5 KB representeert de lengte van het DNA vanaf de replicatievork tot aan de gestopte RNAP.Dit is het resultaat van het stilvallen van de replicatievork bij collisie met de RNAP. Het product van 3,6 KB vertegenwoordigt DNA van volledige lengte en is het resultaat van ofwel een onvolledige bezetting van de promotor door RNAP of een gedeeltelijke replicatiedoorbraak van de frontale RNAP. Een goed resultaat laat zien dat ongeveer 50% DNA van volledige lengte wordt geproduceerd.In sommige gevallen treedt er echter een lagere bezetting van de promotor door RNAP op en wordt een hoger percentage volledig lengte DNA waargenomen. Dit komt omdat een groter deel van de replicatiezones in afwezigheid van een gestopte RNAP geen frontale botsing met de RNAP-replicatie ondervindt, wat resulteert in uitsluitend volledig lengte DNA. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u replicatie en vastfase-analyse uitvoert in de aanwezigheid van een gestopt RNA-polymerase-elongatiecomplex dat aan het DNA is gebonden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het gestopte transcriptiecomplex met een hoge zoutconcentratie te wassen om overtollig RNA-polymerase te verwijderen, dat aspecifiek aan het DNA bindt en de replicatie remt.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

direct-restart-replication-fork-stalled-head-on-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

DT40, een model gewerveld genetisch systeem, biedt een krachtig hulpmiddel om eiwit functie te analyseren. Hier beschrijven we een eenvoudige methode die kwalitatieve analyse van de parameters die invloed hebben DNA-synthese in de S-fase in DT40-cellen op de single molecule-niveau mogelijk maakt.

Visualisatie van DNA-replicatie in de gewervelde Model Systeem DT40 met behulp van de DNA-Fiber Techniek

We beschrijven hier een systeem dat gebruikmaakt van een locatie-specifieke, omkeerbare in vivo eiwitblokkering om replicatievorken in Escherichia coli te stoppen en te laten instorten. De totstandkoming van de replicatieblokkering wordt geëvalueerd door middel van fluorescentiemicroscopie en neutrale-neutrale 2-dimensionale agarosegelelektroforese wordt gebruikt om replicatie-intermediaten te visualiseren.

Induceren van een Site Specific Replication Verstopping in<i&gt; E. coli</i&gt; Met behulp van een TL-repressor aandrijfsysteem

Hier schetsen we de procedure voor het analyseren van replicatieprogressie door pathogene, structuurgevoelige herhalingen met behulp van 2-dimensionale gelelektroforese.

Elektroforetische analyse van replicatie door middel van structuurgevoelige DNA-herhalingen binnen het op SV40 gebaseerde menselijke episoom

Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.

De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

Dit protocol laat een eenvoudige single-molecule fluorescentie microscopie technieken voor het visualiseren van DNA-replicatie door individuele replisomes in real time.

Visualiseren van Single-molecule DNA-replicatie met fluorescentiemicroscopie

We beschrijven een methode voor de waarneming real-time replicatie van individuele DNA-moleculen gemedieerd door eiwitten van de bacteriofaag replicatie systeem.

Directe observatie van Enzymen repliceren DNA met behulp van een Single-molecule DNA Stretching Assay

Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

Een methode om rechtstreeks te leveren morpholinos in de zebravis otocyst op 24hpf is ontwikkeld. Met behulp van micro-injectie van morpholinos in het lumen van otic blaasje en elektroporatie tegen penetratie effect, waren we in staat om het effect van morpholinos op de hersenen te omzeilen en de effecten die specifiek zijn voor het binnenoor te verkrijgen.

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

Deze methode beschrijft de hoge opbrengst in vitro synthese van zowel gecapte als ongecapte mRNA vanuit een gelineariseerd plasmide dat het Gaussia luciferase (GLuc) gen bevat. Het RNA wordt gezuiverd en een fractie van het ongecapte RNA wordt enzymatisch gecapt met behulp van het capping-enzym van het Vaccinia virus. In de laatste stap wordt het mRNA getransfecteerd in HeLa-cellen en worden de supernatanten van de celcultuur geanalyseerd op luciferase-activiteit.

In vitro transcriptie en aftopping van Gaussia Luciferase mRNA Gevolgd door HeLa celtransfectie

Door het combineren van methoden voor RNA whole...

RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie in Hele Mount Embryo&#39;s en histologie Aangepast voor Marine kraakbeenvissen

Leer hoe de replicatievork stilstaat bij een frontale botsing met RNA-polymerase en hoe Mfd de herstart van DNA-replicatie bevordert. Deze methode onthult essentiële mechanismen van transcriptie-replicatie-interacties.

Directe Start van een replicatievork vast door een Head-On RNA polymerase

Meer video's verkennen