Het meten van de 50% Hemolytische Complement (CH ₅₀) Activiteit van Serum

Het meten van de 50% hemolytische complementactiviteit (CH 50) van serum. U heeft een pipet nodig die 200 µL kan afmeten en één die 1000 µL testserum kan afmeten, dat op ijs is bewaard, gesensitiseerde schapeneritrode bloedcellen, Verone gebufferde zoutoplossing en gedestilleerd water, buisjes voor de testserum, en buisjes voor de baseline en totale lysis, een vortexmixer en een 96-wells plaat met platte bodem. Label de buisjes individueel met 'controle' en de uiteindelijke verdunning. In dit geval beginnen we met een verdunning van 1 op 8.

Zet voort met tweevoudige verdunningen om verdunningen van 1 op 16, 1 op 32, 1 op 64 en 1 op 128 te verkrijgen; label de overige buisjes als blanco en totale lysis. Zodra alle buisjes zijn gelabeld, kunt u beginnen met het verdunnen van uw testserum. Begin met het overbrengen van 300 µL R-buffersaline naar een nieuw buisje.

Overbreng nu 100 µL serum naar de 300 µL R-buffersaline. Dit resulteert in een beginverdunning van één op vier. Zorg ervoor dat het serummonster grondig is gemengd.

Breng nu 200 µL RBS over naar de buisjes die eerder zijn gelabeld. Voeg daarnaast 200 µL RBS toe aan de twee blanco buisjes in de totale lysisbuisjes. Voeg 200 µL gedestilleerd water toe, geen RBS.

Breng nu 200 µL van het één-op-vier verdunde serum over naar de buis met het label één-op-acht. We hebben eerder 200 µL fosfaatgebufferde saline overgebracht naar de reeks buizen van één-op-acht tot één-op-128. Dit zal nu resulteren in een één-op-acht verdunning.

Meng het monster goed en breng vervolgens 200 µL over naar de buis die in stap 16 als één is gelabeld. Herhaal dit totdat de gehele reeks buizen is verdund. Verwijder 200 µL uit de buis met een verdunning van 1:28, zodat het uiteindelijke volume 200 µL is.

De gesensitiseerde schapenrode bloedcellen kunnen na verloop van tijd zijn bezonken. Deze moeten opnieuw worden gesuspendeerd door de buis een aantal keer voorzichtig om te keren. Zodra ze volledig zijn geresuspendeerd, worden 200 µL van de gesensitiseerde schapenrode bloedcellen overgebracht in elk van de voorbereide buizen.

Zorg ervoor dat het serum grondig is gemengd met de rode bloedcellen. Gevoeliggemaakte schapenrode bloedcellen die aan de blanco buis zijn toegevoegd, maken het mogelijk om de spontane lysis te bepalen, terwijl bloed dat is toegevoegd aan de totale lysis enables het bepalen van de 100%-waarde. Meng elke buis voorzichtig met een vortexmixer op een lage stand. Plaats de buisen vervolgens in een waterbad van 37 °C en incubeer gedurende 30 minuten.

Vortex de buizen na 15 minuten incubatie voorzichtig nogmaals en incubeer ze nog eens 15 minuten. Breng de buizen na incubatie over naar een centrifuge die is ingesteld op vier graden Celsius en centrifugeer 5 minuten bij 1500 G. Verwijder de buizen na centrifugatie voorzichtig en plaats ze in een geschikte houder. Hier is de pellet van rode bloedcellen zichtbaar, terwijl de SNA rood kleurt.

Vanwege de afgifte van hemoglobinetransfer worden 100 microliter gedestilleerd water in het vereiste aantal wells van een 96-well flat bottom plate gegoten. Zorg ervoor dat het pellet niet wordt overgebracht en transfer 100 microliter van het supernatant naar een passende well van de 96-well plate. Zodra alle monsters op de plaat zijn geladen, wordt de absorptie gemeten met een plaat-spectrofotometer ingesteld op 540 nanometer.

Hier hebben we de ruwe absorptiegegevens voor de twee replica's. A1 en B1. Raadpleeg de verdunning van 1:8.

Vervolgens hebben we de gegevens voor de verdunningen 1:16, 1:32, 1:64 en 1:128. A6 en B6 zijn de blanco's, terwijl A7 en B7 de totale lyses zijn.

Zodra de gegevens zijn verzameld, moet de gemiddelde absorptie voor elk dubbel monster worden berekend. Trek vervolgens de absorptie van de blanco, wat de spontane lysis is, af van alle monsters. Wanneer alle gegevens zijn verzameld, kan het percentage lysis voor elke verdunning worden berekend met behulp van de volgende formule.

Zodra alle gegevens zijn berekend, wordt het percentage lysis op de verticale as uitgezet tegenover de serumverdunning op de horizontale as. De resulterende grafiek kan vervolgens worden gebruikt om de serumverdunning te bepalen die nodig is om 50% van de gesensitiseerde schapenbloedcellen te lyseren. Deze grafiek toont het percentage lysis uitgezet tegenover de verdunningsfactor van het serum.

Vervolgens kan er een lijn worden getrokken vanaf de 50% lysis tot deze de curve snijdt. Op het punt waar de curve wordt gesneden, wordt een verticale lijn naar beneden getrokken naar de horizontale as. Deze waarde vertegenwoordigt de verdunningsfactor waarmee het serum moet worden verdund om 50% lysis te garanderen. Bij het vergelijken van twee serummonsters om te bepalen of er een verschil is in de CH 50, kan de verdunning die 50% lysis oplevert, als maatstaf worden gebruikt.