Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana

Om fytochroomresponsen in specifieke plantenceltypen te onderzoeken. GAL 4G FP enhancer trap- en U-A-S-B-V-R transgene lijnen worden gekruist om fytochroom-deficiënte nakomelingen te produceren. Bladprotoplasten worden geïsoleerd van planten uit de U-A-S-B-V-R kruising met GA 4G FP.

Vervolgens worden de protoplasten gesorteerd op basis van kenmerken om GFP-negatieve en GFP-positieve protoplasten in afzonderlijke monsters te isoleren; de geïsoleerde protoplasten worden geanalyseerd met confocale laserscanmicroscopie. Om de collectie GFP-positieve protoplasten te bevestigen, wordt RNA uit de protoplasten geëxtraheerd en spectraal geanalyseerd. Hallo, ik ben Sanka Pivar van het laboratorium van BARDA Montgomery in het Department of Energy Plant Research Laboratory aan de Michigan State University.

Vandaag tonen we u een procedure voor het isoleren van bladprotoplasten uit Arabidopsis thaliana voor fluorescentie-geassisteerde cel sortering en celtype-specifieke genexpressieanalyse. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om weefsel- en orgaanspecifieke fytochroom-afhankelijke reacties te bestuderen. Laten we beginnen.

De Arabidopsis ANA-lijn die in deze procedure is gebruikt, werd gegenereerd via een bipartiete enhancer-trap aanpak met twee ouderplanten. Eén is afkomstig uit een bibliotheek van enhancer-trap lijnen met verschillende patronen van gal-expressie. Ouder één tot expressie brengt tevens GFP onder controle van een upstream activation sequence of UAS.

Kortom, de transcriptiefactor GAL4 activeert elk gen dat onder controle staat van de UAS. In ouder één activeert GAL4 GFP; ouder één werd gekruist met ouder twee. In ouder twee staat het BVR-gen onder controle van GAL4 via UAS.

De lijn die voortvloeit uit de kruising is U-A-S-B-V-R cross G 4G FP. In de ouderlijnen verloopt de biosynthese van het fytochroomchromofoor van LA via heem naar biver, afgekort als bv. In de nakomelingen blokkeert het BVR-genproduct echter de biogenese van het fytochroomchromofoor door de BV-precursor te reduceren. Deze enhancer-trap BVR-nakomingslijn is bevestigd en kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe een verlaging van de actieve fytochroomniveaus verschillende planteweefsels beïnvloedt.

Begin deze procedure met het voorbereiden van de grond en potten voor het kweken van planten om bladprotoplasten te genereren. Zaai ongeveer 2000 gesteriliseerde zaden per monster per experiment in potten met grond. Voeg water toe aan de bodem van de tray waarin de potten staan en dek de gehele tray af met vershoudfolie.

Kweek de planten vijf weken onder witte verlichting bij 22 °C en een luchtvochtigheid van 70%. Na de eerste vijf tot zes dagen is de kieming van de zaden bevestigd en wordt de plastic folie van de schaal verwijderd. Om protoplasten te isoleren, dient eerst TEX-buffer te worden bereid; weeg voor één liter buffer GA's B vijf zouten af: MES, calciumchloride, ammoniumnitraat en sucrose.

Los de componenten volledig op in ongeveer 900 milliliter gedeïoniseerd gedestilleerd water (afgekort DD H2O) en breng de pH naar 5,7 met één molaire KOH. Vul vervolgens aan tot een eindvolume van één liter en steriliseer door filtratie.

Verzamel vervolgens groene, gezonde bladeren van de planten. Verzamel ongeveer 250 milliliters bladeren, losjes gestapeld in een bekerglas. Spoel de bladeren af met 40 milliliters.

Viermaal spoelen met DD H2O, gevolgd door twee spoelbeurten met steriel DD H2O met behulp van een scalpel nummer 20. Snijd de bladeren in dunne reepjes en verdeel het weefsel gelijkmatig over twee steriele plastic buisjes van 50 ml. Eén x bladeren-digestiemix wordt bereid door een aliquot van 5 ml van een 10 x stockoplossing, bereid door 2% (w/v) mazy R 10 en 4% (w/v) cellulase on azua R 10 op te lossen in TEX-buffer, toe te voegen aan 45 ml verse TEX-buffer.

Voeg ongeveer 25 milliliters van een één x bladdigestie toe. Meng dit met de bladstrips in elke buis, zodat al het bladweefsel bedekt is. Ga over tot vacuümfiltratie om het bladweefsel in de digestie te infiltreren.

Meng gedurende één uur bij kamertemperatuur in open buisjes met behulp van een vacuümdesiccator die is aangesloten op een waterpomp. Houd de dopbuisjes met het bladweefsel en de bladdigestiemix gewikkeld in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Volg dit op met een incubatie van drie uur bij kamertemperatuur op een rocker met voorzichtig schudden.

Verhoog na drie uur de snelheid van de schudplaat gedurende twee minuten om de protoplasten vrij te maken. Filtreer de ruwe protoplastensuspensie door twee lagen steriel kaasdoek om debris te verwijderen en verzamel het filtraat in een steriel glazen bekerglas. Filtreer het filtraat door een steriel nylon gaas van 100 micrometer in een steriele Petri-schaal.

Verzamel het doorstroomvolume en breng dit over naar een nieuwe steriele buis van 50 milliliter. Gebruik ongeveer 15 milliliter verse TEX-buffer om de steriele petri-schaal te wassen en verzamel alle protoplasten die aan het oppervlak kleven. Centrifugeer het doorstroomvolume bij 100 ×g bij 10 °C gedurende 15 minuten met een swing-bucket centrifuge, waarbij de acceleratie is ingesteld op zes en de deceleratie op nul wanneer de centrifugatie is voltooid.

Gebruik een steriele glazen pipette van negen inch, aangesloten op een peristaltische pomp, om ongeveer 25 tot 30 milliliter van de vloeistof onder de zwevende protoplastlaag te verwijderen. Deze vloeistof bevat residueel en gepelleteerd debris; zorg dat de zwevende protoplastlaag hierbij niet wordt verstoord, zodat er ongeveer 10 tot 50 milliliter overblijft. Voeg na het verwijderen van het gepelleteerde debris verse TEX-buffer toe tot een eindvolume van 40 milliliter. Herhaal het verwijderen van debris en het resuspenderen van de overgebleven zwevende protoplasten terwijl u de protoplasten voorzichtig resuspendeert.

Nog twee keer om zoveel mogelijk cellulair debris te verwijderen. De centrifugatietijd wordt verkort naar 10 minuten bij de eerste herhaling en naar vijf minuten bij de laatste herhaling. Gebruik tot slot een steriele transferpipet van één milliliter om de zwevende protoplasten op te zuigen en over te brengen naar een nieuwe buis van 15 milliliter.

Ga direct over tot het sorteren voorafgaand aan de sortering. Onderzoek de protoplasten kort via confocale laser scanning microscopie of CLSM, waarbij een laser van 488 nanometer voor excitatie wordt gebruikt om de integriteit van de protoplasten en de aanwezigheid van GFP-fluorescentie in de protoplastenpool te bevestigen. Een minimaal gehalte aan celdebris is noodzakelijk om verstopping van de sorteermondstuk te voorkomen; sorteer de geïsoleerde protoplasten in TEX-buffer via FACS.

Gebruik een nozzle van 200 micrometer op een macro sort head bij event rates tussen 6.000 en 15.000 met een systeemdruk van ongeveer negen PSI volgens een aangepast protocol. Gebruik wild-type non-GFP PROTOPLASTEN om de autofluorescentiedrempels te bepalen voor het verzamelen van GFP-positieve protoplasten; sorteer de cellen met een argonlaser die werkt op 100 milliwatt op een 488 nanometer argonlijn. Om GFP-fluorescentie te identificeren, wordt na de verzameling van GFP-positieve protoplasten een 530/30 banddoorlaatfilter gebruikt. Onderzoek vervolgens de gesorteerde protoplasten onder de microscoop, zoals reeds gedaan vóór de start van de sortering, voor expressieprofilering.

Extraheer totaal RNA uit de gesorteerde protoplasten. Vervolgens kan cDNA worden geprepareerd voor hybridisatie. Het cDNA wordt daarna ingezet voor hybridisatie op TH one OPSYS Ametri whole genome arrays.

Hier zijn enkele representatieve resultaten van de sortering van protoplasten van de wildtype-controle. Protoplasten vertonen geen signalen in de GFP-positieve gate. Er worden echter GFP-positieve signalen geïdentificeerd voor protoplastmonsters die zijn geïsoleerd uit GAL 4G FP-lijnen; vóór de sortering vertonen protoplasten geïsoleerd uit wildtype-planten geen GFP-fluorescentie in CLSM-analyses.

Terwijl een mengsel van protoplasten dat GFP-fluorescentie mist en vertoont wordt gedetecteerd in protoplastmonsters van GAL 4G FP-lijnen na feiten. CLSM-analyse wijst op de isolatie van GFP-positieve protoplasten uit een representatieve gal 4G FP-lijn; RNA is extraheerbaar uit geïsoleerde protoplasten en één milliliter levert een RNA-hoeveelheid op die voldoende is voor detectie via fluorospectrometrie. We hebben u zojuist laten zien hoe u bladprotoplasten uit atopy ANA kunt isoleren voor fluorescentie-geassisteerde cel sortering en celtype-specifieke genexpressie-analyse.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig om te gaan met de protoplasten en hun blootstelling aan licht te beperken. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.