Name: Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer hoe je weefsel- en orgaanspecifieke fytochroomreacties onderzoekt in Arabidopsis thaliana met FACS-ondersteunde celtypspecifieke expressieprofilering. Deze methode identificeert genen betrokken bij lichtgevoelige groeiregulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk in de Montgomery lab op fytochroom reacties in planten wordt ondersteund door de National Science Foundation (subsidie ​​niet. MCB-0919100 naar BLM) en de Chemische Wetenschappen, Geowetenschappen en Biosciences Division, Bureau van Basic Energy Sciences, Office of Science, het Amerikaanse ministerie van energie (subsidie ​​niet. DE FG02 91ER20021 naar BLM). Wij danken Melissa Whitaker voor technische bijstand tijdens het filmen en kritisch lezen van het manuscript, Stephanie Costigan voor experimentele bijstand, dr. Louis King voor hulp bij het ontwikkelen en optimaliseren van fluorescentie-Activated Cell Sorting protocollen voor Arabidopsis protoplast sorteren en dr. Melinda Frame voor hulp bij confocale microscopie. Wij danken Marlene Cameron voor grafische vormgeving bijstand en Karen Vogel voor redactionele ondersteuning.

1. Plant Groei <ol><li> Bevestigd UAS-BVR X GAL4-GFP enhancer geïsoleerd trap lijn zoals beschreven 4 (voor samenvatting zie Fig. 1) en de wild-type-of ouderschapsverlof lijnen zijn gezaaid op aarde, dat wil zeggen ~ 2000 gesteriliseerd zaden per lijn. </li><li> Planten worden gekweekt voor 5 weken op bodem onder witte verlichting van 100 μmolm -2 s -1 bij 22 ° C en 70% luchtvochtigheid. </li></ol> 2. Leaf protoplast Isolatie (aangepast uit Denecke en Vitale 9) <ol><li> Te isoleren protoplasten, voor te bereiden TEX buffer. Voor 1 liter TEX buffer, wegen uit de volgende onderdelen: 3,1 g Gamborg's B5 zouten, 0,5 g 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES, 2,56 mM), 0,75 g calciumchloride-dihydraat (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g ammoniumnitraat (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g sucrose (0,4 miljoen). volledig oplossen componenten in ~ 900 ml gedeïoniseerd, gedistilleerd water (DDH 2 O) en breng de pH op 5,7 met een M KOH. Breng uiteindelijke volume van 1 liter en filter steriliseren met een 0,2 um fles-top filter aangesloten op een vacuümpomp. </li><li> Verzamel groene, gezonde bladeren van planten (~ 250 ml van de bladeren los verpakt in een bekerglas) en spoel met ~ 40 ml DDH 2 O 4 keer, gevolgd door spoelen tweemaal met steriele DDH 2 O. Met behulp van een # 20 scalpel, gesneden blaadjes in dunne reepjes en verdeel het weefsel even in twee 50 ml steriele plastic buizen. Bereid 1x blad spijsvertering mengsel door toevoeging van 5 ml van 10x blad spijsvertering stockoplossing (10x blad spijsvertering voorraad: los op 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v Cellulase "Onozuka" R-10 in TEX buffer, filter steriliseren met 0,2 um filter en 5 ml porties invriezen bij -80 ° C) tot 45 ml vers TEX buffer. Voeg ~ 25 ml 1x blad spijsvertering mix per 50 ml tube om alle bladweefsel te dekken. </li><li> Vacuüm infiltreren bladweefsel in de spijsvertering mengsel in open buizen voor 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een vacuümexsiccator aangesloten op een waterpomp, gevolgd door 3-uur incubatie bij kamertemperatuur op een rocker met een zacht schudden. Capped buizen met bladweefsel in 1x blad spijsvertering mix worden gehouden gewikkeld in aluminiumfolie tijdens dit proces om blootstelling aan licht te voorkomen. </li><li> Na 3 uur, verhoging van de rocker snelheid van ~ 2 minuten protoplasten vrij te geven. Filter de ruwe protoplast schorsing door de twee lagen van steriele kaas doek om vuil te verwijderen en het filtraat verzamelen in een steriele glazen beker. Filter het filtraat door middel van een steriele 100-um mesh nylon in een steriele petrischaal. Verzamel de stroom door en breng het naar een nieuwe steriele 50 ml buis. Gebruik ongeveer 15-20 ml vers TEX buffer om de steriele petrischaal wassen en eventuele protoplasten zich te houden aan het oppervlak te verzamelen. </li><li> Centrifugeer de stroom door het gebruik van een schommel emmer rotor op 100xg bij 10 ° C gedurende 15 minuten (Acceleration 6, Deceleration 0). </li><li> Verwijder ~ 25 - 30 ml van de vloeistof onder de drijvende protoplast laag, die rest-en gepelleteerd puin bevat, met een steriele 9 "glas Pasteur pipet verbonden met een peristaltische pomp zonder de drijvende protoplast laag en het verlaten van ~ 10 - 15 ml volume. </li><li> Voeg verse TEX buffer tot een uiteindelijk volume van 40 ml, terwijl zachtjes resuspenderen de protoplasten. </li><li> Herhaal de stappen 2,5 tot 2,7 twee keer zo veel cellulaire vuil te verwijderen mogelijk te maken. De centrifugeertijd wordt teruggebracht tot 10 minuten in de eerste herhaling en tot 5 minuten in de laatste herhaling. </li><li> Aspireren drijvende protoplasten met een cut, steriele 1 ml transferpipet naar een nieuwe 15 ml buis. Ga direct naar het sorteren of op te slaan in het donker tot 2 uur bij 4 ° C tot sorteren. </li></ol> 3. Protoplast Sorteren op Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Voor het sorteren, te onderzoeken protoplasten door Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM) met behulp van een 488-nm laser voor excitatie te protoplast integriteit en de aanwezigheid van GFP fluorescentie in de protoplast zwembad te bevestigen. Minimale puin is nodig om te voorkomen verstopping van de FACS-sortering mondstuk. </li><li> Sorteer geïsoleerde protoplasten in TEX buffer via FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) met behulp van een 200-um mondstuk op een macro soort hoofd event rates tussen 6.000 en 15.000, met een systeem de druk van ongeveer 9 psi na een aangepast protocol 10. </li><li> Wild-type niet-GFP protoplasten worden gebruikt om de autofluorescentie drempelwaarden vast te stellen. </li><li> Om GFP-positieve protoplasten, een soort cellen met behulp van een luchtgekoelde argon laser (Spectra Physics Model 177, Newport Corporation, Irvine, CA) die worden geëxploiteerd op 100 mW op een 488-nm argon lijn om GFP-fluorescentie te identificeren met behulp van een 530/30 band te verzamelen pass filter. </li><li> Na het verzamelen van GFP-positieve protoplasten, onderzoeken gesorteerd protoplasten door CLSM zoals beschreven in stap 3.1. </li><li> Extract totaal RNA van gesorteerde protoplasten met behulp van een Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. cDNA kan dan worden voorbereid voor hybridisatie, zoals beschreven in Affymetrix GeneChip Expression Analyse technische handleiding en vervolgens gehybridiseerd met AtH1 Arabidopsis Affymetrix hele genoom van arrays. </li></ol> Representatieve resultaten We hebben gedetecteerd een groot aantal GFP-positieve cellen in het GFP-kanaal door FACS (afb. 2). In optimalisatie testen met behulp van GFP enhancer-trap ouders, het constitutief GFP-expressie lijn, J0571, weergegeven ~ 17% tot 24% GFP-positieve protoplasten, terwijl de lijn met vasculaire en dermale expressie, J1071, had ~ 1,4% GFP-positieve protoplasten (tabel 1). Sorteren van 3 x 500 pi (~ 1,5 ml in totaal protoplast schorsing) van J0571 protoplasten gedurende 1 uur gaf ~ 100.000 GFP-positieve protoplasten. Sorteren van 3 x 500 pi (~ 1,5 ml in totaal protoplast schorsing) van J1071 protoplasten gedurende 1,5 uur gaf ~ 3000 GFP-positieve protoplasten. Confocale beelden aangegeven een zeer hoge opbrengst van protoplasten voor zowel de J0571 en J1071 monsters voor sorteren werd uitgevoerd (Fig. 3C en 3E), en de gesorteerde fracties bevatte slechts lichte GFP-fluorescentie protoplasten (Fig. 3G en gegevens niet getoond). Deze bevinding bevestigt dat intact GFP-positieve protoplasten kunnen worden gesorteerd via FACS. De niet-GFP protoplasten kunnen ook worden gesorteerd en verzameld in een apart kanaal. De niet-GFP protoplasten dienen als een ideaal negatieve controle voor latere microarray analyses aan de specifieke veranderingen in genexpressie te detecteren na verlaging van holophytochrome niveaus. RNA-extractie uit geïsoleerde protoplasten (1 ml) geeft RNA van voldoende hoeveelheid voor detectie door fluorospectrometry (afb. 4). Geïsoleerde RNA werd gemeten met een NanoDrop instrument (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) en gekwantificeerd door NanoDrop 3.7.1 RNA kwantificatie software. RNA opbrengsten van voorgesorteerd C24 wild-type protoplasten of FACS-gesorteerd, GFP-positieve enhancer trap protoplasten boven het minimum 20 ng die nodig zijn voor gebruik in de RNA-etikettering van assays voor microarray (tabel 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Enhancer Trap Line </td><td> % Van het GFP-positieve protoplasten </td><td> Aantal gesorteerde GFP protoplasten </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17,18% 24,06% ~ </td><td> 26.400 ~ 36.000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1,43% </td><td> 1000 ~ 1300 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Percentage van GFP-positieve protoplasten van twee enhancer trap rijen voor het sorteren en het aantal GFP-positieve protoplasten verzameld door het uitvoeren van 500 pi van protoplast schorsing door de Fluorescence Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Plant Line </td><td> RNA opbrengst (ng) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12.486,5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71,5 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Opbrengst van de RNA isolatie van protoplasten. RNA werd geïsoleerd uit voorgesorteerd C24 wild-type of gesorteerd GFP-positieve protoplasten van twee enhancer trap lijnen en gekwantificeerd. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. GAL4 enhancer-trap-op basis van inductie van biliverdine reductase (BVR) expressie in transgene Arabidopsis thaliana planten. (A). Een individuele geselecteerd uit een bibliotheek van GAL4-based enhancer trap lijnen, die een GAL4-responsieve GFP-marker-gen bevatten, kunnen worden gekruist met een regel met een GAL4-responsieve doelwitgen om expressie van het target-gen te induceren in GAL4-bevattende gemarkeerde cellen door de GFP fluorescentie. Op basis van een figuur van Dr Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) De productie van fytochroom chromofoor, phytochromobilin (PΦB) en holophytochrome in ouder lijnen. (C) Links, Vermindering van biliverdine IXα (BV IXα) en PΦB door biliverdine reductase (BVR) activiteit aan BR en PΦR, respectievelijk. BVR activiteit leidt tot uitputting van PΦB en leidt tot een vermindering van de productie van fotoactieve holophytochrome. Rechts, is de reactie gekatalyseerd door BVR getoond. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) overname dot percelen. Vergelijking van de protoplast celsortering voor C24 wild-type (A), J0571 (B) en J1071 (C). (A) Overname dot plot van de niet-fluorescerende GFP C24 wild-type protoplasten opgewekt door een 488-nm argon laser en worden gebruikt om autofluorescentie drempel te bepalen. (B) en (C) het verwerven dot plots tonen proporties van protoplasten die GFP positieve reactie op excitatie door een 488-nm laser. R3 sorteren poorten in B en C af te bakenen van de GFP-positieve doelen die zijn gesorteerd op Fluorescentie-Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD) en verzameld. Rode kanaal geeft vAARDEN voor chlorofyl autofluorescentie van protoplasten en groene kanaal geeft waarden voor GFP fluorescentie. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Confocale microscopie van plantenprotoplasten gebruikt voor celsortering. Confocale laser beelden van protoplasten gescand voordat (A, C, E) en na (G) sorteren via fluorescentie-Activated Cell Sorter (FACS). B, D, F en H zijn DIC beelden. Protoplasten van de C24 wild type (A, B), J1071 (C, D) en J0571 (E, F, G, H) worden getoond. Afbeeldingen C, E en G zijn samengevoegd beelden van GFP fluorescentie (BP 505 nm - 575 nm) en autofluorescentie (LP 650 nm) verkregen van excitatie met een 488-nm laser. A tot en met H zijn gemiddeld vier scans onder 63x olie. Bar = 10 urn. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Kwantificering van RNA geïsoleerd uit protoplasten door fluorospectrometry. RNA geëxtraheerd uit (A) C24 wild type, (B) J0571, en (C) J1071. A geeft RNA voor pre-gesorteerde wild-type protoplasten. B en C geven aan RNA van GFP-positieve protoplasten gesorteerd op Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS). RNA kwantificatie software, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

<ol><li>Franklin, K. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochrome+functions+in+Arabidopsis+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phytochrome functions in Arabidopsis development.</a> J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).</li>
<li>Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+place%2C+right+time%3A+Spatiotemporal+light+regulation+of+plant+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development.</a> Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4-GFP+enhancer+trap+lines+for+genetic+manipulation+of+lateral+root+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).</li>
<li>Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root-localized+phytochrome+chromophore+synthesis+is+required+for+tissue-specific+photoregulation+of+root+elongation+and+impacts+sensitivity+to+jasmonic+acid+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana.</a> , Submitted Forthcoming.</li>
<li>Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+photomorphogenesis+by+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Cell. , 675-688 (1997).</li>
<li>Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+distinct+aspects+of+photomorphogenesis+via+targeted+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+spatial-specific+phytochrome+responses+using+targeted+expression+of+biliverdin+reductase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+anthocyanin+accumulation+and+phytochromes+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana.</a> , Submitted Forthcoming.</li>
<li>Denecke, J., Vitale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+protoplasts+to+study+protein+synthesis+and+transport+by+the+plant+endomembrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system.</a> Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).</li>
<li>Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+expression+profiling+in+plants+via+cell+sorting+of+protoplasts+from+fluorescent+reporter+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines.</a> Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+control+of+Arabidopsis+development+entails+coordinated+regulation+of+genome+expression+and+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways.</a> Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).</li>
<li>Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+signal+transduction+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Light signal transduction in higher plants.</a> Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).</li>
<li>Ulm, R., &amp, N. agy, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+and+gene+regulation+in+response+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+expression+of+Arabidopsis+genome+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development.</a> Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).</li>
<li>Neff, M. M., Fankhauser, C., &amp, C. hory, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light%3A+an+indicator+of+time+and+place%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Light: an indicator of time and place.</a> Genes Dev. 14, 257-271 (2000).</li>
<li>Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A gene expression map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
</ol>

Gen expressie profilering door middel van microarrays (1) heeft uitgewezen dat meer dan 30% van de genen in Arabidopsis zaailingen zijn licht gereguleerd 11 en (2) heeft een grote groep genen die coderen voor licht signaaltransductie eiwitten betrokken bij de fytochroom signaalcascade 12, 13 . Dergelijke experimenten suggereren dat licht een snelle en lange-termijn veranderingen in genexpressie induceert. Elke pool van phytochromes mag alleen van een subset van ontwikkelings-en adaptieve reacties. ...

<table><tbody><tr><td>Anti-BVR-antilichaam</td><td>QED Bioscience Inc.</td><td>56257-100</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase &amp;#8220;Onozuka&amp;#8221; R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>MSPC 0930</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s B5 basaalzoutmengsel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5768</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>SERVA Electrophoresis</td><td>PTC 001</td><td></td></tr><tr><td>MES, laag vochtgehalte</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Murashige en Skoog-zouten</td><td>Caisson Laboratories</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>Phytablend</td><td>Caisson Laboratories</td><td>28302</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant Minikit</td><td>Qiagen</td><td>16419</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoeken tissue-en orgel-specifieke fytochroom reacties met behulp van facs-assisted cell-type-specifieke expressie profilering in arabidopsis thaliana</em

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Licht bemiddelt een scala van ontwikkelings-en adaptieve processen in de levenscyclus van een plant. Planten gebruiken licht-absorberende moleculen, de zogenaamde fotoreceptoren te voelen en aan het licht aan te passen. De rood / ver-rood licht-absorberende fytochroom fotoreceptoren zijn uitgebreid bestudeerd. Phytochromes bestaan ​​als een familie van eiwitten met verschillende en overlappende functies in alle hogere plant systemen waarin ze zijn bestudeerd<sup&gt; 1</sup&gt;. Fytochroom-gemedieerde lichte reacties, die variëren van zaadkieming tot bloei en senescentie, zijn vaak gelokaliseerd in specifieke plant weefsels of organen<sup&gt; 2</sup&gt;. Ondanks de ontdekking en de opheldering van de individuele en redundante fytochroom functies door mutatie-analyses, sluitend rapporten over verschillende sites van photoperception en de moleculaire mechanismen van gelokaliseerde poelen van phytochromes die bemiddelen ruimtelijk-specifieke fytochroom reacties zijn beperkt. We ontwierpen experimenten op basis van de hypothesen die specifieke sites van fytochroom photoperception regelen weefsel-en orgaan-specifieke aspecten van fotomorfogenese, en dat de lokale fytochroom zwembaden gaan verschillende subsets van de downstream-doelwitgenen in cel-cel signalering. We ontwikkelden een biochemische benadering om selectief functionele phytochromes te verminderen in een orgaan-of weefsel-specifieke wijze binnen transgene planten. Onze studies zijn gebaseerd op een tweedelige versterker-trap aanpak die resulteert in transactivatie van de expressie van een gen onder controle van de Upstream Activatie Sequence (UAS) element door de transcriptionele activator GAL4<sup&gt; 3</sup&gt;. De biliverdine reductase (<em&gt; BVR</em&gt;) Gen onder de controle van de UAS wordt stil gehouden in de afwezigheid van GAL4 transactivatie in de UAS-BVR ouder<sup&gt; 4</sup&gt;. Genetische kruisingen tussen een UAS-BVR transgene lijn en een GAL4-GFP enhancer trap lijn resulteren in bijzondere uitdrukking van het<em&gt; BVR</em&gt; Gen in cellen gekenmerkt door<em&gt; GFP</em&gt; Uitdrukking<sup&gt; 4</sup&gt;. BVR accumulatie in Arabidopsis-planten resulteert in fytochroom chromofoor tekort<em&gt; In planta</em<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Zo, transgene planten die we hebben vertonen GAL4-afhankelijke activering van de geproduceerde<em&gt; BVR</em&gt; Gen, resulterend in de biochemische inactivatie van fytochroom, evenals GAL4-afhankelijke<em&gt; GFP</em&gt; Expressie. Fotobiologische en moleculair genetische analyse van<em&gt; BVR</em&gt; Transgene lijnen worden waardoor inzicht in de weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom-gemedieerde reacties die in verband zijn gebracht met de bijbehorende sites van photoperception<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) van GFP-positieve, enhancer-trap-geïnduceerde<em&gt; BVR</em&gt;-Expressie plantenprotoplasten gekoppeld aan cel-type-specifieke gen expressie profilering door middel van microarray-analyse wordt gebruikt om de vermeende downstream doelwit genen die betrokken zijn bij het bemiddelen ruimtelijk-specifieke fytochroom reacties te identificeren. Dit onderzoek is de uitbreiding van onze kennis van de gebieden van het licht waarnemen, de mechanismen waardoor verschillende weefsels of organen samen te werken in het licht-gereguleerde planten groei en ontwikkeling, en het bevorderen van de moleculaire dissectie van complexe fytochroom-gemedieerde cel-cel signalering cascades.

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Licht medieert een reeks ontwikkelings- en adaptatieprocessen gedurende de gehele levenscyclus van een plant. Planten maken gebruik van lichtabsorberende moleculen genaamd ...

Om fytochroomresponsen in specifieke plantenceltypen te onderzoeken. GAL 4G FP enhancer trap- en U-A-S-B-V-R transgene lijnen worden gekruist om fytochroom-deficiënte nakomelingen te produceren. Bladprotoplasten worden geïsoleerd van planten uit de U-A-S-B-V-R kruising met GA 4G FP.Vervolgens worden de protoplasten gesorteerd op basis van kenmerken om GFP-negatieve en GFP-positieve protoplasten in afzonderlijke monsters te isoleren; de geïsoleerde protoplasten worden geanalyseerd met confocale laserscanmicroscopie. Om de collectie GFP-positieve protoplasten te bevestigen, wordt RNA uit de protoplasten geëxtraheerd en spectraal geanalyseerd. Hallo, ik ben Sanka Pivar van het laboratorium van BARDA Montgomery in het Department of Energy Plant Research Laboratory aan de Michigan State University.Vandaag tonen we u een procedure voor het isoleren van bladprotoplasten uit Arabidopsis thaliana voor fluorescentie-geassisteerde cel sortering en celtype-specifieke genexpressieanalyse. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om weefsel- en orgaanspecifieke fytochroom-afhankelijke reacties te bestuderen. Laten we beginnen.De Arabidopsis ANA-lijn die in deze procedure is gebruikt, werd gegenereerd via een bipartiete enhancer-trap aanpak met twee ouderplanten. Eén is afkomstig uit een bibliotheek van enhancer-trap lijnen met verschillende patronen van gal-expressie. Ouder één tot expressie brengt tevens GFP onder controle van een upstream activation sequence of UAS.Kortom, de transcriptiefactor GAL4 activeert elk gen dat onder controle staat van de UAS. In ouder één activeert GAL4 GFP; ouder één werd gekruist met ouder twee. In ouder twee staat het BVR-gen onder controle van GAL4 via UAS.De lijn die voortvloeit uit de kruising is U-A-S-B-V-R cross G 4G FP. In de ouderlijnen verloopt de biosynthese van het fytochroomchromofoor van LA via heem naar biver, afgekort als bv. In de nakomelingen blokkeert het BVR-genproduct echter de biogenese van het fytochroomchromofoor door de BV-precursor te reduceren. Deze enhancer-trap BVR-nakomingslijn is bevestigd en kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe een verlaging van de actieve fytochroomniveaus verschillende planteweefsels beïnvloedt.Begin deze procedure met het voorbereiden van de grond en potten voor het kweken van planten om bladprotoplasten te genereren. Zaai ongeveer 2000 gesteriliseerde zaden per monster per experiment in potten met grond. Voeg water toe aan de bodem van de tray waarin de potten staan en dek de gehele tray af met vershoudfolie.Kweek de planten vijf weken onder witte verlichting bij 22 °C en een luchtvochtigheid van 70%. Na de eerste vijf tot zes dagen is de kieming van de zaden bevestigd en wordt de plastic folie van de schaal verwijderd. Om protoplasten te isoleren, dient eerst TEX-buffer te worden bereid; weeg voor één liter buffer GA's B vijf zouten af: MES, calciumchloride, ammoniumnitraat en sucrose.Los de componenten volledig op in ongeveer 900 milliliter gedeïoniseerd gedestilleerd water (afgekort DD H2O) en breng de pH naar 5,7 met één molaire KOH. Vul vervolgens aan tot een eindvolume van één liter en steriliseer door filtratie.Verzamel vervolgens groene, gezonde bladeren van de planten. Verzamel ongeveer 250 milliliters bladeren, losjes gestapeld in een bekerglas. Spoel de bladeren af met 40 milliliters.Viermaal spoelen met DD H2O, gevolgd door twee spoelbeurten met steriel DD H2O met behulp van een scalpel nummer 20. Snijd de bladeren in dunne reepjes en verdeel het weefsel gelijkmatig over twee steriele plastic buisjes van 50 ml. Eén x bladeren-digestiemix wordt bereid door een aliquot van 5 ml van een 10 x stockoplossing, bereid door 2% (w/v) mazy R 10 en 4% (w/v) cellulase on azua R 10 op te lossen in TEX-buffer, toe te voegen aan 45 ml verse TEX-buffer.Voeg ongeveer 25 milliliters van een één x bladdigestie toe. Meng dit met de bladstrips in elke buis, zodat al het bladweefsel bedekt is. Ga over tot vacuümfiltratie om het bladweefsel in de digestie te infiltreren.Meng gedurende één uur bij kamertemperatuur in open buisjes met behulp van een vacuümdesiccator die is aangesloten op een waterpomp. Houd de dopbuisjes met het bladweefsel en de bladdigestiemix gewikkeld in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Volg dit op met een incubatie van drie uur bij kamertemperatuur op een rocker met voorzichtig schudden.Verhoog na drie uur de snelheid van de schudplaat gedurende twee minuten om de protoplasten vrij te maken. Filtreer de ruwe protoplastensuspensie door twee lagen steriel kaasdoek om debris te verwijderen en verzamel het filtraat in een steriel glazen bekerglas. Filtreer het filtraat door een steriel nylon gaas van 100 micrometer in een steriele Petri-schaal.Verzamel het doorstroomvolume en breng dit over naar een nieuwe steriele buis van 50 milliliter. Gebruik ongeveer 15 milliliter verse TEX-buffer om de steriele petri-schaal te wassen en verzamel alle protoplasten die aan het oppervlak kleven. Centrifugeer het doorstroomvolume bij 100 ×g bij 10 °C gedurende 15 minuten met een swing-bucket centrifuge, waarbij de acceleratie is ingesteld op zes en de deceleratie op nul wanneer de centrifugatie is voltooid.Gebruik een steriele glazen pipette van negen inch, aangesloten op een peristaltische pomp, om ongeveer 25 tot 30 milliliter van de vloeistof onder de zwevende protoplastlaag te verwijderen. Deze vloeistof bevat residueel en gepelleteerd debris; zorg dat de zwevende protoplastlaag hierbij niet wordt verstoord, zodat er ongeveer 10 tot 50 milliliter overblijft. Voeg na het verwijderen van het gepelleteerde debris verse TEX-buffer toe tot een eindvolume van 40 milliliter. Herhaal het verwijderen van debris en het resuspenderen van de overgebleven zwevende protoplasten terwijl u de protoplasten voorzichtig resuspendeert.Nog twee keer om zoveel mogelijk cellulair debris te verwijderen. De centrifugatietijd wordt verkort naar 10 minuten bij de eerste herhaling en naar vijf minuten bij de laatste herhaling. Gebruik tot slot een steriele transferpipet van één milliliter om de zwevende protoplasten op te zuigen en over te brengen naar een nieuwe buis van 15 milliliter.Ga direct over tot het sorteren voorafgaand aan de sortering. Onderzoek de protoplasten kort via confocale laser scanning microscopie of CLSM, waarbij een laser van 488 nanometer voor excitatie wordt gebruikt om de integriteit van de protoplasten en de aanwezigheid van GFP-fluorescentie in de protoplastenpool te bevestigen. Een minimaal gehalte aan celdebris is noodzakelijk om verstopping van de sorteermondstuk te voorkomen; sorteer de geïsoleerde protoplasten in TEX-buffer via FACS.Gebruik een nozzle van 200 micrometer op een macro sort head bij event rates tussen 6.000 en 15.000 met een systeemdruk van ongeveer negen PSI volgens een aangepast protocol. Gebruik wild-type non-GFP PROTOPLASTEN om de autofluorescentiedrempels te bepalen voor het verzamelen van GFP-positieve protoplasten; sorteer de cellen met een argonlaser die werkt op 100 milliwatt op een 488 nanometer argonlijn. Om GFP-fluorescentie te identificeren, wordt na de verzameling van GFP-positieve protoplasten een 530/30 banddoorlaatfilter gebruikt. Onderzoek vervolgens de gesorteerde protoplasten onder de microscoop, zoals reeds gedaan vóór de start van de sortering, voor expressieprofilering.Extraheer totaal RNA uit de gesorteerde protoplasten. Vervolgens kan cDNA worden geprepareerd voor hybridisatie. Het cDNA wordt daarna ingezet voor hybridisatie op TH one OPSYS Ametri whole genome arrays.Hier zijn enkele representatieve resultaten van de sortering van protoplasten van de wildtype-controle. Protoplasten vertonen geen signalen in de GFP-positieve gate. Er worden echter GFP-positieve signalen geïdentificeerd voor protoplastmonsters die zijn geïsoleerd uit GAL 4G FP-lijnen; vóór de sortering vertonen protoplasten geïsoleerd uit wildtype-planten geen GFP-fluorescentie in CLSM-analyses.Terwijl een mengsel van protoplasten dat GFP-fluorescentie mist en vertoont wordt gedetecteerd in protoplastmonsters van GAL 4G FP-lijnen na feiten. CLSM-analyse wijst op de isolatie van GFP-positieve protoplasten uit een representatieve gal 4G FP-lijn; RNA is extraheerbaar uit geïsoleerde protoplasten en één milliliter levert een RNA-hoeveelheid op die voldoende is voor detectie via fluorospectrometrie. We hebben u zojuist laten zien hoe u bladprotoplasten uit atopy ANA kunt isoleren voor fluorescentie-geassisteerde cel sortering en celtype-specifieke genexpressie-analyse.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig om te gaan met de protoplasten en hun blootstelling aan licht te beperken. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

investigating-tissue-organ-specific-phytochrome-responses-using-facs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan ​​dat vergemakkelijkt de behandeling...

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de plant groei gedrag en vooral fenotypen op een reproduceerbare wijze. Variabele en op de dezelfde tijd stabiel lichtomstandigheden, tonen we hoe te verstrekken. Goede analyses, is afhankelijk van voldoende monster getallen en geldige statistische evaluaties.

Analyse van Arabidopsis thaliana groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Leer hoe je weefsel- en orgaanspecifieke fytochroomreacties onderzoekt in Arabidopsis thaliana met FACS-ondersteunde celtypspecifieke expressieprofilering. Deze methode identificeert genen betrokken bij lichtgevoelige groeiregulatie.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana

Meer video's verkennen