Name: Gebrekkige PMS2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Gebreken Tijdens Progressie naar Colon Cancer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 15 s
Description: Leer hoe DNA-herstelproteïne-expressie in colorectaal weefsel wordt geanalyseerd met immunokleuring en microscopie. Deze methode helpt onderzoekers vroege markers voor darmkankerprogressie identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering door de Zuid-Arizona Veterans Affairs Health Care System VA Merit Beoordeling subsidie ​​0142 en Arizona Biomedical Research subsidie ​​van de Commissie 0803.

Voorbereiden weefsels worden bekeken op de dia's <ol><li> Een colonoscoop kunnen worden doorgegeven in de dikke darm via het rectum. Een colonoscoop is een lange buis die verlichting en een video camera op het hoofd heeft, de mogelijkheid geven lucht in de dikke darm op te blazen als een lange ballon tot een betere visualisatie van de dikke darm toe te staan, en heeft een doorgang voor biopsie tang die kunnen verder reiken dan de video-camera knijpen een 3-5 millimeter ruimte van de binnenkant "huid" of mucosale laag van de dikke darm om ons een biopt. De biopsie tang kan ook gebruikt worden om mogelijk te verwijderen pre-kanker poliepen in de dikke darm. </li><li> We biopten van de normale dikke slijmvliezen weefsel van patiënten, met een informed consent. Deze patiënten ondergingen een screening coloscopie in een gastro-intestinale kliniek. Onze biopten werden geplaatst in potten van formaline. Na 4 uur werd de formaline vervangen door 70% alcohol. </li><li> Soortgelijke monsters van weefsel werden genomen uit gebieden van de dikke darm resecties, verwijderd tijdens de operatie, die een cm en 10 cm uit de buurt van dikke darm kanker of adenomen met geavanceerde neoplasie. Deze weefselmonsters werden ook geplaatst in formaline, en als het weefsel monsters werden groot, sommigen werden gehouden in formaline voor een langere periode voordat ze geplaatst in 70% alcohol. </li><li> Het weefsel monsters worden genomen om een ​​laboratorium voor histologie worden verwerkt en geplaatst in paraffine blokken. </li><li> Paraffine blokken worden gekoeld in de koelkast zodat ze gemakkelijker gesneden door een microtoom. </li><li> Weefselcoupes van 4 micron dikte worden gesneden uit het weefsel blokken, met behulp van een microtoom, en dreef op het water. </li><li> Voor het vergelijken van expressie van twee eiwitten, bijvoorbeeld ERCC1 en PMS2, kunnen alternatieve weefselcoupes worden opgehaald op twee glijbanen, tot er drie weefselcoupes op elk van de twee dia's. Zo kan de delen 1, 3 en 5 worden geplaatst op een dia label ERCC1 en de hoofdstukken 2, 4 en 6 kan worden geplaatst op een dia label PMS2. Met drie weefselcoupes immunostained voor een eiwit op een enkele dia kan u toestaan ​​om te zien of een ongewoon kleuringspatroon van een crypte is een artefact is of echt, want artefacten zou niet worden herhaald in meer dan een weefselsectie op een dia. Colon crypten zijn ongeveer 60 micrometer in diameter, zodat ongeveer 15 weefselcoupes kunnen worden verlaagd door middel van een crypte, en dezelfde crypte zou kunnen worden bekeken op meerdere weefselcoupes per slide. </li></ol> Immunokleuring weefselcoupes <ol><li> De dia's worden vervolgens door middel van de immunohistochemische etikettering procedure. Dit is een 8 uur procedure, en is vrij standaard. De onderdelen van de procedure die we gebruiken, die niet standaard zijn, zijn het gebruik van Sequenza containers voor vlekken, en het gebruik van een oplossing voor achtergrondkleuring genaamd "Sniper" te verminderen. De 'Sniper' oplossing is verkocht als een gepatenteerde formule door Biocare Medical, Concord CA. </li><li> Sommige van de stappen van onze procedures worden hier getoond. </li><li> Als een voorbeeld, voor PMS2 immunohistochemie, dia's worden eerst ontdaan door het plaatsen van in 3 veranderingen van xyleen (3 minuten elk), gevolgd door twee veranderingen in 100% ethanol (2 minuten elk), gevolgd door twee veranderingen in 95% ethanol (2 minuten elk), gevolgd door twee wijzigingen in gedestilleerd water (2 minuten). Deze procedures worden uitgevoerd onder een chemische kap met een negatieve luchtdruk, zodat de onderzoeker niet wordt blootgesteld aan de dampen. </li><li> Toen formaline werd aanvankelijk gebruikt om het weefsel te repareren, onderdelen van de eiwitten in het weefsel monster werd cross-linked. Nu moeten we de cross-links te breken, zodat een antilichaam kan het eiwit van belang te erkennen. De dia's worden geplaatst in een buffer oplossing die aan de kook gebracht in een magnetron. Dit wordt gevolgd door 10 minuten op de medium setting, gevolgd door afkoeling gedurende 20 minuten op ijs. Deze stap moet worden getest en aangepast voor verschillende magnetrons, tot goede resultaten worden bereikt. Merk op dat voor immunokleuring CcOI of Ku86 we een natriumcitraatbuffer gemaakt met 9ml citroenzuur + 41mL natriumcitraat + 450 ml H 2 O (een buffer met natrium-ionen) die een pH van ongeveer 6,0 had, voor ERCC1 hebben we gebruik gemaakt van een gemaakt citraatbuffer gebruikt met 2,1 g citroenzuur + 1 liter H 2 O + ~ 5 ml natriumhydroxide om de pH te brengen naar 6,1 (een buffer met een minimum aan toegevoegde natrium-ionen), en voor PMS2 gebruikten we een oplossing gemaakt met 5 ml Antigen ontmaskeren oplossing (door VECTOR) + 533mL H 2 O. Verschillende buffers zijn nodig om antilichamen interactie te verhogen met bepaalde proteïne epitopen. </li><li> De dia's worden vervolgens in 3% waterstofperoxide (verdund in methanol) gedurende 20 minuten, gevolgd door een in gedestilleerd water spoelen gedurende 3 minuten, en gewassen in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS genoemd) voor 5 minuten. </li><li> Dia's worden vervolgens geplaatst in platte smalle vlekken racks genaamd Sequenza (Shandon Sequenza Immunokleuring System van Thermo Scientific) en gespoeld met PBS. </li><li> De slides die immunostained voor ERCC1 of PMS2 worden dan blootgesteld aan 10 minnuten blootstelling aan een extra behandeling van drie druppels van een eigen oplossing, verkregen uit Biocare, genaamd 'Sniper', die optreedt te verminderen niet-specifieke kleuring van eiwitten achtergrond. </li><li> De dia's worden gespoeld met een buffer "TBST" dat is 1 ml Tween + 100 ml Tris 10x + 900 ml gedestilleerd water [waar 10x Tris is 24,2 gram Trizma + 80 gram NaCl + 1000 ml gedestilleerd en gedemineraliseerd water + geconcentreerd HCl (ongeveer 15 ml) om de oplossing tot pH 7,6] te brengen. </li><li> Dia's worden vervolgens gespoeld drie keer met buffer, en 100 microliter DAKO gebiotinyleerd secundair antilichaam bij 1:100 verdunning (in 2% boviene serumalbumine gemaakt in buffer TBST) wordt toegevoegd aan de dia's en geïncubeerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Op dit punt is Vectastain ABC (avidine Biotine Complex) (van Vector Laboratories) reagens bereid met behulp van 2,5 ml PBS, 1 druppel oplossing A, 1 druppel oplossing B, en de oplossing is toegestaan ​​om 30 minuten staan. </li><li> De dia's worden gespoeld drie keer met TBST buffer. </li><li> Dan 3 druppels Vectastain ABC reagens wordt toegevoegd en de dia's worden geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, gevolgd door spoelen 2 keer met TBST. </li><li> Dia's worden vervolgens ondergedompeld in DAB (diamino-benzamide) (2,9 ml DAB + 400 microliter PBS + 250 microliter waterstofperoxide) voor ongeveer 5 minuten. </li><li> Dia's worden vervolgens gespoeld twee maal met gedestilleerd, gedemineraliseerd water. </li><li> Tegenkleuring wordt gedaan met een verdunde oplossing van hematoxyline gedurende 10 seconden. Dia's worden grondig gespoeld met kraanwater en vervolgens met gedemineraliseerd water. </li><li> Dia's worden vervolgens gedehydrateerd 2 keer voor 2 minuten in 95% ethanol, twee keer voor 2 minuten in 100% ethanol en 2 keer voor 2 minuten in xyleen. </li><li> Een paar druppels Cytoseal XYL (Richard-Allan Scientific) worden vervolgens toegevoegd aan de dia's en een dekglaasje toegepast. </li><li> Immunohistochemische evaluatie van ERCC1, Ku86 en CcOI worden uitgevoerd met hetzelfde protocol als voor PMS2, maar het vervangen van de PMS2 antilichaam met antilichamen voor ERCC1, Ku86 en CcOI beschreven in de onderstaande tabel. </li></ol> Het evalueren van weefsel secties voor crypten deficiënt in de expressie van ERCC1, PMS2, Ku86 en CcOI <ol><li> We zullen eerst kijken naar weefselcoupes onder een Motic (DM-BA300) photomicroscope voor expressie van PMS2 en ERCC1 in crypten van het colon mucosa. </li><li> PMS2 en ERCC1 zijn beide DNA-herstel enzymen, en dus zijn ze gevestigd waar het DNA is, in de kernen van cellen van de crypten. Dit wordt aangegeven in figuur 1, waar de bruine dikke darm die kleuring voor ERCC1, komt in de kernen van cellen in een crypte. De normale crypte we eerst laten zien in de microscoop werd gekleurd ERCC1, en de bruine vlek toont de locatie van ERCC1. We wijzen op de aard van de cellen in de crypten, waar "beker cellen" hebben de vorm van een beetje zoals een wijnglas, met kernen in een klein gebied aan de voet van de cellen op de buitenste rand van de crypte en een ballonvaart uit sectie, gevuld met witte mucine korrels in het deel van de cel aan de binnenkant van de crypte. De andere twee soorten cellen zien er een beetje gelijk in onze gekleurde coupes, en ze zijn de enterocyten en enteroendocrine cellen en hun kernen zijn ook aan de buitenste rand van de crypte, aan de voet van de cellen. In biopten afgenomen bij patiënten die nog nooit een colon neoplasie, of in biopten ver van een site van dikke darm kanker, bijna alle van de kernen in alle crypten vertonen een normale hoog niveau van expressie van ERCC1 zoals hier te zien. </li><li> Te oriënteren onze waarnemingen, weefsel verkregen van biopten van patiënten zonder colon neoplasie worden waargenomen voor de niveaus van expressie van PMS2, ERCC1, CcOI of Ku86 in normale colon mucosa. We kunnen observeren alle crypten in een normaal weefsel sectie, met een 40x objectief, terwijl we langzaam gaan een hele weefsel sectie en wijzen op de crypten, de interstitiële cellen, lymfoïde eventuele knobbeltjes op de dia en de muscularis (indien aanwezig in het biopt). </li><li> We wijzen er ook op dat er slechts enkele cellen aan de basis van de crypte die de stamcellen. Deze stamcellen genereren van alle van de ongeveer 2000 cellen van de volledige crypte. Een stamcel met een mutatie of een epimutation kan nemen over het hele stamcel niche. Dan is de hele crypte kan hebben veranderd aankleuring voor een enzym van belang (crypt conversie) als we laten zien in deze nieuwe glijbaan waar we hele crypten deficiënt zijn voor CcOI naast crypten dat hoge expressie van CcOI hebben. </li><li> Dan laten we zien een dia van een patiënt met een darmkanker of een adenoom met geavanceerde neoplasie. Op deze dia, een aantal crypten een normale hoog niveau van expressie van ERCC1 en sommige hebben een lagere niveaus van expressie. Alle crypten in het weefsel sectie zijn gefotografeerd bij een lage resolutie met een 10x objectief, en de beelden zijn betegeld, zodat het hele weefsel sectie is te zien in een beeld. De crypten zijn dan genummerd. </li><li> De crypten met een hoge expressie van het enzym, typisch van de crypten in biopten veel from welke vorm van kanker, worden genoemd niveau "4" vlekken. Andere niveaus zijn "0" als er geen waarneembare uitdrukking, "1" als gewoon nauwelijks detecteerbaar expressie is duidelijk, "2" als er sprake is expressie aanwezig, maar op een veel lager niveau dan niveau 4, en "3" als uitdrukking aanwezig zijn op een lager niveau dan vier, maar vrij sterk. We dot elke dia op de lage resolutie afbeelding blauw voor 4, groen voor 3, geel voor 2, oranje voor een en rood voor 0. Hier laten we gaan door een sectie van een biopsie met behulp van een 40x objectief lens. We puntjes op de crypten op de lage resolutie afbeelding. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een dikke crypte met hoge expressie van ERCC1 in de kernen van de crypte cellen. Alle kleuren in dit beeld waren even verbeterd contrast en verzadiging, met behulp van Paint Shop Pro 5. Representatieve resultaten <ol><li> De alternatieve weefselcoupes op afzonderlijke dia's stellen ons in staat om te kijken naar hetzelfde colon crypten, met expressie van twee verschillende eiwitten aangetoond door immunohistochemie. Het beeld van een crypte gekleurd voor PMS2 en dezelfde crypte gekleurd voor ERCC1 wordt getoond op de aangrenzende microscopen met aangrenzende computer monitors. Dit laat ons toe om te bepalen of er gezamenlijk tekort voor twee eiwitten of dat de tekortkomingen in elk van de eiwitten, terwijl elke is frequent, onafhankelijk optreedt. We hebben drie weefsel per dia, zodat een duidelijk tekort in de expressie van een eiwit kan worden geverifieerd als zijnde gebrekkig op meer dan een sectie, en niet te wijten aan een artefact. In de weefsels rond colon kanker, waar sprake is van een defect veld die aanleiding geven tot de kanker, is er een hoge frequentie van crypten deficiënt zijn voor ERCC1 en PMS2. </li><li> We hebben ook gebruik gemaakt immunohistochemie om de frequentie van crypten deficiënt te vinden voor Ku86 en CcOI. Op deze dia, gaan we een hele weefselsectie immunostained voor Ku86, met behulp van een 40x objectief, en we kunnen zien dat er weinig crypten deficiënt zijn voor Ku86 in dit weefsel sectie. </li><li> Ook op deze dia, gaan we een hele weefselsectie immunostained voor CcOI, met behulp van een 40x objectief, en we kunnen zien dat slechts een matig aantal crypten deficiënt zijn voor CcOI. </li></ol>

<ol><li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium%3B+clinical+implications+of+multicentric+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li>
<li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li>
<li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li>
<li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li>
<li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li>
<li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+%28SC%29+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li>
<li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+reveals+a+niche%3A+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li>
<li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells%2C+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li>
<li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li>
<li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li>
<li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma%3A+methylation+of+the+E-cadherin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li>
<li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li>
<li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hydrophobic+bile+acids%2C+genomic+instability%2C+Darwinian+selection%2C+and+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li>
</ol>

<ol><li> Het is heel belangrijk om 3 weefselcoupes per slide. Bubbles kan zich voordoen wanneer de toepassing van de media die het antilichaam, zodat sommige crypten of delen van de crypten niet adequaat kan worden gekleurd, alleen maar omdat een zeepbel voorkomen dat het antilichaam tegen een reactie met het weefsel sectie. Crypten zijn ongeveer 60 micrometer in diameter, en weefsel secties 4 micron dik, dus er kunnen maar liefst 15 weefselcoupes worden via dezelfde crypte. Het is meestal mogelijk om dezelfde crypte, met behulp van de morfologie van de crypte als een gids, op meerdere weefselcoupes geplaatst op een dia. </li><li> In onze recente studies voor grote weefselmonsters, kan kleuring in een Sequenza geen goede antistof dekking om het weefsel. In deze gevallen kan men de voorkeur aan de hand kleuring van het weefsel, waar een daling van de media die het antilichaam bevatten met de hand geplaatst over elk weefselmonster te gebruiken. </li><li> Duidelijk de bruine vlekken met de expressie van de immunostained eiwit, en de blauwe vlekken zien nucleair DNA op het computerscherm te zien, de Motic photomicroscope software is als volgt aangepast: Gain 0, 0 Offset, Enhance 0, 255, Gamma 1.00, 0, Scherpte 1, Kleurcorrectie 7, R, G, B Gain 1.00, en de R, G, B Helderheid 0. De resolutie is ingesteld op 1024 x 768, en de witbalans is ingeschakeld. </li><li> Onze methode kan worden gebruikt met elke eiwitten denken belangrijk te zijn in de progressie naar darmkanker, om de frequentie van een tekort te beoordelen, of eventueel overexpressie, in het veld gebreken omliggende dikke darm kanker of adenomen met geavanceerde neoplasie. </li><li> Veld gebreken zijn een onderdeel van progressie naar kanker De term "veld cancerization" werd voor het eerst gebruikt door Slaughter et al.. In 1953 een tot een gebied of "veld" van het epitheel dat is geconditioneerd door de grotendeels onbekende processen (op het moment) om te predisponeren op de ontwikkeling van kanker te beschrijven. Het eerste gebruik was in de context van orale kanker. Sindsdien hebben de termen "veld cancerization" en "veld defect" op grotere schaal gebruikt om een pre-maligne weefsel waarin nieuwe vormen van kanker meer kans om zich te beschrijven, en het concept van het veld cancerization in de klinische oncologie heeft meer aandacht gekregen 2 . We onlangs beoordeeld het bewijs voor veld defecten in gastro-intestinale kanker 3. Inbegrepen in dit onderzoek zijn de resultaten van een tiental studies het bewijs van het veld defecten in de dikke darm. Veld gebreken in de colonmucosa waarschijnlijk ontstaan ​​door natuurlijke selectie van de mutant cellen of epigenetisch veranderde cellen behoren tot de stamcellen van een crypte zodanig dat een stamcel niche achter elkaar 4 overleeft. Genetische instabiliteit of een mutator fenotype, misschien te wijten aan vermindering van de DNA nucleotide excisie reparatie of DNA mismatch repair, zou dit proces versnellen (en een frequent defect in PMS2 werd eerder gemeld in de gebieden rond darmkanker 5). Indien in een normale populatie van stamcellen in het colon mucosa, een cel krijgt een selectief voordeel door middel van een mutatie of een epimutation, zal het de neiging om klonaal uit te breiden ten koste van de naburige stamcellen. In het colon mucosa, wordt de stamcel niche bezet door ≤ 5 cellen 6 die dan aanleiding geven tot alle (ongeveer 2.000) cellen van de crypte. Een overname van de stamcel niche met een mutant of epigenetisch veranderd celtype resulteert in "crypt bekering" 7. De verspreiding van gemuteerde klonen (omgerekend crypten) in het colon epitheel kan komen het vaakst door de crypte splijting 8. Een voorbeeld van een crypte kernsplijting is weergegeven in figuur 2. Op deze manier een patch van abnormale weefsel ontstaat. Binnen zo'n patch, kan een tweede dergelijke mutatie optreden zodat een bepaalde crypte een voordeel verwerft ten opzichte van andere crypten in de patch, en deze crypte zal klonaal de vorming van een tweede patch uit te breiden binnen de oorspronkelijke patch. Binnen deze nieuwe patch, kan het proces herhaald worden diverse meer tijd, misschien wel tientallen jaren, tot een kwaadaardige stamcellen ontstaat die klonaal breidt uit in een kanker. Als dit het algemene proces waarbij sporadische colon adenocarcinomen ontstaan, dan colon adenocarcinomen het algemeen dient te worden geassocieerd met, en worden voorafgegaan door, velden van abnormaliteit. Dus een patch van omgerekend crypten kan worden verwacht dat onvolkomenheden waarneembaar zijn in de omgeving van een adenoom met geavanceerde neoplasie, of rond een darmkanker hebben. Uit dit model van de pre-tumorprogressie, zou men verwachten dat genetische of epigenetische veranderingen met betrekking tot pre-tumorprogressie bij weefsel monsters genomen van de niet-neoplastische colonmucosa in de gebieden rond neoplastische laesies van de dikke darm die waarschijnlijk ontwikkelen tot kanker te vinden . Met name zou fouten bij DNA-herstel enzymen, of in de eiwitten die nodig zijn voor apoptose, een bijdrage leveren tot progressie door het verbeteren van genomische instabiliteit, en kan naar verwachting worden gevonden in een defecte veld. </li><li> Selectie voor tekortkoming in PMS2 wanneer de cellen d zijnverloren bij voor ERCC1 en onderworpen aan een DNA-schade-agent Nara et al.. Negen groeide 25 culturen van de Chinese hamster ovarium cellen 43-3B, allemaal met een mutatie het inactiveren van de DNA-reparatie-gen ERCC1, en ​​de culturen die behandeld worden met een DNA-schade agent, MNNG. Onder de cellen overleven van de DNA-schade behandeling, was een enkele cel geïsoleerd van elke cultuur en toegestaan ​​om een ​​kloon te vormen. Alle geïsoleerd van de klonen werden ongeveer een factor 10 beter bestand is tegen het doden van MNNG dan de ouderlijke stam. Van de geïsoleerde klonen, werden 22 bewezen gebreken vertoont in DNA mismatch repair (MMR). Vijf van deze 22 klonen werden getest door sequencing, en drie van de vijf waren deficiënt zijn voor PMS2. Deze selectie voor het defect in PMS2 was vermoedelijk vanwege PMS2 tekort veroorzaakt resistentie tegen apoptose, en daarmee het vermogen om de toegevoegde DNA-schade nog in de cellen toen ERCC1 afwezig was overleven. (Normaal gesproken, PMS2 zintuigen DNA-schade niveaus, en zorgt ervoor dat cellen om apoptose te ondergaan wanneer DNA-schade te groot is.) Dus, is een tekort aan PMS2 geselecteerd als ERCC1-deficiënte cellen worden onderworpen aan DNA-schade. Klonen defect in zowel ERCC1 en PMS2 bleken te hebben over een 500 tot 1000 keer groter mutatiesnelheid bij bestraling met UV dan ouderlijke cellen. </li><li> Galzuren veroorzaken oxidatieve stress, zijn DNA-beschadigende middelen en zijn belangrijk in de progressie naar darmkanker Deoxycholinezuur, een galzuur, verhoogt de oxidatieve stress door het genereren van reactieve zuurstof species (ROS) door meerdere processen, inclusief beschadiging van de mitochondria 10. Er is recent bewijs is dat ROS epigenetische veranderingen leiden tot 11, en ​​ten minste 15 studies hebben aangetoond dat de galzuren, op de verhoogde concentraties bij een hoog vet dieet, DNA-schade veroorzaken 12. Zoals beoordeeld door Bernstein et al.. 12, is er een positief verband tussen vet in de voeding de consumptie en de incidentie van darmkanker. Galzuren worden uitgescheiden in het darmkanaal in reactie op vet in de voeding, en galzuren fungeren als wasmiddelen om te helpen bij de vertering van vet. Zo is een hoog vet dieet geassocieerd met een verhoogd gal zuursecretie. Fecale galzuur concentraties zijn verhoogd in populaties met een hoge incidentie van darmkanker, en overmatige blootstelling aan galzuren wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor darmkanker 13. Galzuren kan een oorzaak zijn van het veld gebreken in de dikke darm worden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Een dikke crypte splijting in 3 crypten. Conclusie We vonden een hoge frequentie van crypten een tekort aan DNA-repair genen ERCC1 en PMS2 (PMS2 is ook nodig voor apoptose) in grote gebied gebreken omliggende dikke darm kanker. Tekorten aan ERCC1 en PMS2 (door epigenetische veranderingen of mutaties) kunnen vroege stappen in de genetische instabiliteit centraal progressie naar darmkanker.

<table><tbody><tr><td>PMS2 antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>556415</td><td></td></tr><tr><td>ERCC1 antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>MS-671-P1</td><td></td></tr><tr><td>Ku86 antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9034</td><td></td></tr><tr><td>CcO1 antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated secundair antilichaam</td><td>Dako</td><td>E0413</td><td></td></tr><tr><td>22% BSA</td><td>Informagen, Inc.</td><td>2327</td><td></td></tr><tr><td>Sniper</td><td>Biocare Medical</td><td>BS966</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>20605</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>VWR international</td><td>48212-196</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

gebrekkige pms2, ercc1, ku86, ccoi in field gebreken tijdens progressie naar colon cancer

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

In carcinogenese, is het &quot;veld defect&quot; klinisch erkend vanwege de hoge neiging van de overlevenden van bepaalde vormen van kanker aan andere maligniteiten van hetzelfde soort weefsel, vaak in een nabijgelegen locatie te ontwikkelen. Dergelijke gebreken gebied zijn aangegeven in darmkanker. De moleculaire afwijkingen die verantwoordelijk zijn voor een veld defect in de dikke darm moet aantoonbaar zijn bij hoge frequentie in het histologisch normaal weefsel rondom een ​​colon adenocarcinoom of rond een adenoom met geavanceerde neoplasie (goed op weg om een ​​dikke darm kanker), maar bij lage frequenties in het colon mucosa van patiënten zonder colon neoplasie. Met behulp van immunohistochemie, werden hele crypten binnen 10 cm aan elke kant van colon adenocarcinomen of geavanceerde colon tumoren blijken te zijn vaak verminderd of afwezig zijn in de expressie van twee DNA-reparatie-eiwitten, PMS2 en / of ERCC1. PMS2 is een dubbele rol eiwit, actief in de DNA mismatch repair als nodig is in apoptose van cellen met een overmaat DNA-schade. ERCC1 is actief in DNA nucleotide excisie reparatie. De verminderde of afwezige expressie van zowel ERCC1 en PMS2 zou leiden tot cellen met zowel een toegenomen vermogen om te overleven (apoptose weerstand) en een verhoogde mate van veranderlijkheid. De verminderde of afwezige expressie van zowel ERCC1 en PMS2 is waarschijnlijk een vroege stap in progressie naar darmkanker. DNA-herstel-gen Ku86 (actief in het DNA niet-homologe eind mee) en cytochroom c oxidase subeenheid I (die betrokken zijn bij apoptose) hadden elk gerapporteerd te worden verminderd in expressie in mucosale gebieden dicht bij dikke darm kanker. Echter, immunohistochemische evaluatie van hun niveaus van expressie toonde slechts weinig tot bescheiden frequenties van de crypten om een ​​tekort in hun uitdrukking in een veld defect omgeving darmkanker of de omliggende geavanceerde colon neoplasie. We tonen hier, onze manier van beoordeling van de crypten voor expressie van ERCC1, PMS2, Ku86 en CcOI. We laten zien dat de frequentie van de gehele crypten deficiënt zijn voor PMS2 en ERCC1 is vaak zo groot zijn als 70% tot 95% in 20 cm lange directe omgeving van een colon neoplasie, terwijl de frequentie van de crypten een tekort aan Ku86 heeft een mediane waarde van 2% en de frequentie van de crypten een tekort aan CcOI heeft een mediane waarde van 16% in deze gebieden. De hele dikke darm is 150 cm lang (ongeveer 5 meter) en heeft ongeveer 10 miljoen crypten in de mucosale laag. Het defect in PMS2 en ERCC1 rond een dikke darmkanker kan dus ook een miljoen crypten. Het is van een defect crypte dat darmkanker ontstaat.

Verminderd / afwezige uitdrukking van PMS2 en / of ERCC1 in hele crypten is een frequent geval binnen 10 cm aan elke kant van colon adenocarcinomen, waarschijnlijk de basis van een gezichtsveld met een hoge veranderlijkheid en de progressie van kanker. Deficiëntie in Ku86 of CcOI is veel minder frequent in deze veld gebreken.

Gebrekkige PMS2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Gebreken Tijdens Progressie naar Colon Cancer

Bij carcinogenese wordt het "velddefect" klinisch herkend vanwege de hoge neiging van overlevers van bepaalde kankers om andere ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

We rapporteren significante verbeteringen voor de reproduceerbare meting van somatische colonische stamcelmutaties na blootstelling van muizen aan potentieel DNA-beschadigende stoffen.

Kwantificering van Colonic Stem Cell Mutaties

Een protocol voor de oprichting van een genetisch gemanipuleerde muismodel van colorectale kanker door middel van segmentale adeno-cre infectie en zijn bewaking via hoge resolutie colonoscopie wordt gepresenteerd.

Een genetisch ontwikkeld muis model van sporadische colorectale kanker

De gepresenteerde diagnostische FL-DNA kit is een tijdbesparende en gebruiksvriendelijke methode om de betrouwbare waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van colorectale kankerlaesies te bepalen.

Evaluatie van colorectale kanker risico en prevalentie door ontlasting DNA Integriteit Detectie

Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.

Een driedimensionaal model van sferoïden om stamcellen van darmkanker te bestuderen

Uit de studie bleek dat mannelijk geslacht, slechte tumorgraad en gevorderd stadium van tumorkliermetastase geassocieerd waren met slechtere kankerspecifieke overleving (CSS) bij patiënten met meerdere primaire colorectale kanker (MPCC) na een operatie. We ontwikkelden een nomogram om de CSS van MPCC-patiënten te voorspellen en bij te dragen aan de besluitvorming over klinische behandelingen.

Nomogram met concurrerend risico voor het voorspellen van kankerspecifieke overleving bij patiënten met meerdere primaire colorectale kanker na een operatie

Doel van de presentatie is om aan te tonen een zeer reproduceerbare methode om matrix geassocieerd stamcelimplantaten genereren in kraakbeen defecten, die kunnen worden gevisualiseerd met MRI. Stamcellen zijn gelabeld met de FDA-goedgekeurde Ferumoxides, vermengd met agarose, geïmplanteerd in letsels aan het kraakbeen en afgebeeld met een 7T MR-scanner.

Implantatie van Ferumoxides Gelabelde humane mesenchymale stamcellen in kraakbeenletsels

Dit protocol stelt onderzoekers in staat gericht op beweging en sport wetenschappen het bepalen van de relatieve bijdrage van de drie verschillende energiesystemen aan het totale energieverbruik tijdens een grote verscheidenheid aan oefeningen.

Het bepalen van de bijdrage van de Energy Systems tijdens de training

Weefsel-specifieke analyse van een haarfollikel regeneratie model met behulp van lentivirus tot winst-of verlies-van-functie bemiddelen.

Snelle Genetische analyse van epitheliale-mesenchymale signalering tijdens haar regeneratie

Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel...

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Leer hoe DNA-herstelproteïne-expressie in colorectaal weefsel wordt geanalyseerd met immunokleuring en microscopie. Deze methode helpt onderzoekers vroege markers voor darmkankerprogressie identificeren.

Gebrekkige PMS2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Gebreken Tijdens Progressie naar Colon Cancer

Meer video's verkennen