Name: De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Leer dissectiemethoden voor Drosophila-hersenen en -retina's voor live imaging en immunohistochemie. Dit protocol toont technieken om weefselviabiliteit te behouden tijdens neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Welch Foundation (I-1657) en het NIH (RO1EY18884). PRH is een Eugene McDermott Scholar in biomedisch onderzoek.

1. Introductie In deze video, zullen we laten zien hoe je Drosophila hersenen en retinae voor te bereiden op live-beeldvorming en immunohistochemie met een focus op fotoreceptorcellen. Eerst zullen we zien hoe voor te bereiden op de hersenen dissecties. Vervolgens zullen we zien twee fundamentele dissecties vaak gebruikt voor immunohistochemie dat de basis voor de live voorbereidingen te vormen. Deze twee preparaten zijn de volwassen hersenen en ogen dissecties. Vervolgens zullen we demonstreren de dissecties gebruikt voor live beeldvorming van de volwassenen en het ontwikkelen van de hersenen met de nadruk op hun gebruik voor live beeldvorming van fotoreceptoren. Tot slot beschrijven we hoe we foto levend weefsel en tonen enkele voorbeelden van live-imaging met behulp van resonante confocale microscopie. 2. Dissection voorbereiding <ol><li> Voor een goede dissecties, moet je scherpe tang. Gebruik van een aanzetstaal blok of zeer fijn schuurpapier (&gt; 1500), voorzichtig langs de tang heen en weer op elke kant totdat de eindjes aan elkaar op een fijne punt. We maken gebruik van een standaard slijpsteen. We zullen niet voor de verscherping techniek hier, maar er rekening mee dat scherp forceps essentieel zijn voor live dissecties. We slijpen tang voor elke dissectie. </li><li> Voor de volwassen hersenen dissecties, plaats de vliegen op een CO 2 pad om ze te verdoven en te sorteren op de gewenste genotype. Voor pupal dissecties, eenvoudig te bereiken in de flacon en voorzichtig een pop te verwijderen met uw tang, en let om te voorkomen dat het breken van de popstadium geval. </li><li> Bevochtig een Kimwipe met water. U gebruikt deze tijdens de dissectie om vuil te verwijderen van uw tang. Plaats een dissectie schotel op het toneel van een stereoscoop en vul deze met HL3 oplossing 1. Alle dissecties zal worden uitgevoerd in HL3 om ervoor te zorgen dat het weefsel blijft levend en gezond tijdens de dissectie procedure. Ook maken we gebruik van een dissectie schotel die een bodem bedekking van Sylgard om verlostang te beschermen tijdens de dissectie heeft. </li><li> Nu bereiden de vaststelling oplossing als u van plan bent immunohistochemie uit te voeren. Plaats 180μL van HL3 in een 500μL microcentrifugebuis. Voeg 20μL van 37% formaldehyde aan een 3,7% formaldehyde-oplossing te verkrijgen. </li><li> Tot slot, de juiste houding van de handen is belangrijk voor een goede dissecties. Met een goede positie van de hand, zal je pincet gelijkmatig zijn en in staat van gecontroleerde, subtiele bewegingen. Plaats eerst de tang aan de zijkant van je duim. Breng dan de wijsvinger recht naar beneden, zodat het topje van de vinger rust op de top. Nu rest de zijkant van de tang aan de zijkant van je middelvinger en naar de dissectie schotel. Maak lichamelijk contact met het gerecht door uw duim en middelvinger. Tijdens het rusten uw duim en middelvinger op de schotel, plant je pols op de microscoop podium. Op deze manier heb je drie punten stevig op oppervlakken tijdens de dissectie en het is nu mogelijk om zeer subtiele manipulaties van de tang. Deze techniek kan een beetje ongemakkelijk te voelen op het eerste, maar met de praktijk, zult u binnenkort een meester van de hersenen dissecties. </li></ol> 3. Volwassen hersenen <ol><li> Op de CO 2-pad, oriënteren een volwassen vlieg buikzijde met het hoofd uit de buurt van je hand. Pak de borstkas net onder de kop. Als dit goed wordt gedaan, zal de benen en proboscis uit te breiden. Tijdens het bekijken onder een stereoscoop, pak de verlengde snuit met de tang aan het hoofd te verwijderen. Gooi het lichaam en onder water het hoofd. Heroriënteren op de verzonken kop. De hele dissectie zal worden uitgevoerd onder oplossing. Het is zeer belangrijk om op de kop te houden met een tang te allen tijde. Anders zal het hoofd zweven en is moeilijk te halen. Als het hoofd beweegt niet scherp tijdens de dissectie, gewoon terug naar het in het brandvlak, zonder het aanpassen van de microscoop. Deze schijnbaar eenvoudige taak kan moeilijk zijn op het eerste, maar waarbij je je hoofd in focus zal makkelijker in de tijd. </li><li> Begin de dissectie door eerst te scheuren het bindweefsel tussen de proboscis en het oog. Scheur door het oog terwijl u stevig met ten minste een pincet te allen tijde. Zeker te zijn dat de teen van de tang alleen is net onder het netvlies of de nagelriem, om te voorkomen dat schade aan de hersenen eronder. Afwisselend links en rechts, gebruik je tang te scheuren weg het netvlies, werken aan de achterkant van het hoofd. Scheuren weg het netvlies zal de kans dat de lamina blijft verbonden aan de optische lob in deze dissectie. Ga verder rond de achterkant van het hoofd, scheuren cuticula langs de weg. Scheur door het andere oog en beginnen wegrijden cuticula. Zolang je grijpen nagelriem, u weet dat u niet het pletten van de hersenen! Met dit in gedachten, nog steeds cuticula en het netvlies weg te trekken tot aan de hersenen is onthuld. </li><li> Zodra de hersenen zichtbaar is, kunt u beginnen met het verwijderen luchtpijp aan de hersenen (Fig. 1A). Verder te trekken in luchtpijp en cuticula totdat de hersenen is geïsoleerd. Op dit punt moet je concentreren op de bodem van de schotel voor thij de resterende stappen. Verwijder de resterende luchtpijp, omdat je hersenen anders kan drijven tijdens de nacht antilichaam wasbeurten. Voor de beeldvorming van fotoreceptor terminals, is het wenselijk om de lamina behouden, maar je moet het netvlies, die de cellichamen en sterk autofluorescente pigment bevat te verwijderen. Om dit te doen, trek aan de bossige en gepigmenteerde cellulaire blijft zonder beschadiging van de lamina. Dit is een fijner vaardigheid en vergt oefening. </li><li> De volwassen hersenen levend gehouden kan worden voor de uren of zelfs dagen onder omstandigheden die we zullen bespreken in hoofdstuk 6. Voor immunohistochemie, het volwassen brein is nu klaar om te worden vastgesteld in formaldehyde. 2 Gebruik een P20 pipetteman ingesteld om 5μL de volwassen hersenen te verplaatsen naar de vaststelling oplossing die u al hebt voorbereid. Ga verder ontleden volwassen hersenen gedurende 20 minuten, dat moet 40 tot 10 hersenen opleveren. Laat de hersenen in de oplossing voor een extra 40 minuten, maar dit duur kan variëren voor een optimaal primair antilichaam kleuring. Verwijder de formaldehyde-oplossing en spoel de hersenen drie keer voor vijf minuten elk in 400μL van een oplossing die PBS en 0,4% TritonX-100, hierna te noemen PBS-Triton. Na het volledig wassen van de fix oplossing, kunt u toevoegen primair antilichaam oplossing. </li></ol> 4. Volwassen ogen <ol><li> Begin deze dissectie zoals beschreven voor de volwassen hersenen. Na het onderdompelen van het hoofd en de heroriëntering van de microscoop, beginnen met het scheuren van het bindweefsel tussen de proboscis en het oog. Boven de snuit, scheid de cuticula van het oog. Nu, los van de cuticula van de onderkant van het oog, werken aan de achterkant van het hoofd. Met een pincet, pak het midden van de achterkant van het hoofd. Met de andere, pak het oog en trekken. Laat het oog om zich te vestigen op de bodem van de schaal (Fig. 1B). De lamina zal waarschijnlijk nog worden bevestigd aan het oog en kan gebruikt worden voor live beeldvorming van de terminals van volledig intact fotoreceptorcellen op dit moment. Om door te gaan met live in beeld brengen van fotoreceptorcel lichamen, gaat u naar sectie 4.5. De volgende drie hoofdstukken uit te leggen vaste oog immunohistochemie. </li><li> Voor immunohistochemie, verplaats het oog op de vaststelling van oplossing met behulp van een P20 pipetteman ingesteld op 5μL. Ga verder ontleden volwassen ogen voor een totaal van 10 minuten. Laat de ogen in oplossing voor een extra 30 minuten. Verwijder de fix-oplossing en het gedrag wast, zoals beschreven in het volwassen brein dissectie. </li><li> Als u uiteindelijk wilt het imago van de ommatidial structuur van het oog van de lamina moet nu verwijderd worden. Zet de vaste ogen om je ontleden schotel en verwijder de luchtpijp of vet cellen die nog kunnen worden verbonden. Vervolgens terwijl de buitenkant van het oog met een tang, verwijder de lamina met de andere. Het moet uit te komen in een stuk, waardoor de cellbodies onder (Fig. 1B). Wees voorzichtig om de lamina alleen pakken! Anders loop je het risico verwijderen van de fotoreceptoren van het netvlies. </li><li> Met behulp van een P20 pipetteman, verplaatst u de ogen om 400uL PBS-Triton in een 500uL buis. Voorzichtig ze &#39;s nachts rots bij 4 graden ten opzichte van de autofluorescente rode pigment van de fotoreceptoren te verwijderen. De volgende dag, kunt u gooi de wasoplossing en voeg primair antilichaam oplossing. </li><li> Voor de live-imaging van volwassen ogen gebruiken we alleen pharate volwassen vliegen, dat wil zeggen laat stadium poppen kort voor Eclosion. In dit stadium, de fotoreceptorcel instanties die losstaan ​​van terminals in de lamina tijdens de dissectie. </li><li> Pharate volwassen poppen hebben goed gedefinieerde vleugels, ogen, en cuticula zichtbaar door de popstadium geval. Selecteer een pop en verwijder het voorste deel van het popstadium zaak naar het hoofd gebied bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het dunne binnenste membraan dat bovendien omsluit de zich ontwikkelende vliegen. Pak de onderkant van het hoofd met je pincet en trek. Gooi de rest van de pop terwijl de kop onder water. </li><li> Ga te werk zoals aangetoond in het oog dissectie voor immunohistochemie. Op de pharate volwassen stadium, echter, zal de fotoreceptorcel lichaam gemakkelijker los te maken van de lamina, waardoor u het imago van de cellichamen gelegen in het netvlies. Ook de lamina blijft aan de optische kwab, zodat u het imago van de distale lamina. Als u het imago van de proximale lamina, waar de fotoreceptor terminal cartridges kunnen worden gezien, voer dan de ogen dissectie op een volwassen vlieg waar de lamina is meer sterk gehecht aan het oog. </li></ol> 5. Het ontwikkelen van eye disc-brain complexen <ol><li> De zich ontwikkelende oog schijf op 20% popstadium ontwikkeling (P +20%) is uitgegroeid tot een favoriet voor live-imaging in ons lab, omdat deze enkele laag van relatief grote ontwikkelingslanden cellen is makkelijk waarneembaar met behulp van confocale microscopie. 3 </li><li> Het selecteren van een 20% pop, kijk voor de malpighian tubuli, een groene vlek verschijnt onder de pupal geval is, en vermijden poppen die een &#39;donkere lichaam &quot;4 hebben. Na het selecteren van een P +20% pop, onderdompelen in HL3 in uw ontleden schotel en verwijder voorzichtig een voorste deel van het popstadium zak, en letniet aan de dunne binnenste membraan dringen. Pak de binnenste membraan met je pincet en uit elkaar te trekken. </li><li> Zorgvuldig zoeken in de vrijgekomen inhoud aan de zich ontwikkelende hersenen en ogen schijven die zijn vrij prominent (Fig. 1C) te vinden. Het oog disc-brein-complex is gemakkelijk uit elkaar in deze fase van de metamorfose. Isoleer de hersenen op de bodem van de schotel ontleden. Haal voorzichtig de centrale hersenen van de optische lob. De optische lob / eye disk zal worden gebruikt in live beeldvorming. </li></ol> 6. Live-Imaging: Bij de microscoop <ol><li> Wilt u de afbeelding voor een een korte tijd in slechts een of twee oplossingen, kunt u het beeld van uw weefsel op een glasplaatje. In dit geval, bereiden de glijbaan door eerst het bekleden van het oppervlak met Sylgard met behulp van instructies van de fabrikant. Plaats 20μL HL3 in het midden van de dia. Vervoer uw ontleed weefsel in 20 extra ui van HL3 aan de dia. Het weefsel moet NOOIT worden blootgesteld aan lucht. Daarnaast moet elke stress of spanning uit pipet behandeling of oplossing oppervlaktespanning worden vermeden. </li><li> Voor live imaging, moet het weefsel stevig worden vastgezet met een minimale behandeling en contact. We stevig de hersenen met behulp van de water-polymerisatie van chirurgische lijm GluShield toegepast door middel van een micro-elektrode positie, een techniek die routinematig gebruikt voor de embryonale voorbereidingen voor elektrofysiologie 5. Verkrijgen van een glaselektrode zoals die getrokken voor elektrofysiologische opnames. Breek de tip en vul het einde met GluShield met behulp van negatieve luchtdruk die door de mond. Breek alleen genoeg van de elektrode die lijm kan komen. Gebruik nu de positieve druk om een ​​kleine hoeveelheid lijm van toepassing op de Sylgard onder een daling van HL3. Nu, snel in het weefsel op de lijm, het handhaven van de gewenste richting voor live imaging. Een water-immersie lens kan nu gebruikt worden voor de beeldvorming. Wilt u een membraan permeabel kleurstof toe te voegen, kunt u deze toevoegen aan het bad, terwijl beeldvorming. </li><li> We maken gebruik van een Resonant scanning confocale microscoop die snelle beeldvorming maakt met een verminderde fotobleken. 6 Voor beeldvorming over lange perioden van tijd of te wisselen oplossingen volledig of meerdere keren, gebruiken we een perfusie kamer (Harvard IC30 confocale imaging kamer) die wordt aangesloten op een peristaltische pomp dat perfuses langzaam kweekoplossing over het levend weefsel (Fig. 2A). Beweging van een constante uitwisseling vloeistof en een minimum aan GluShield contact verminderen van de afvlakking van het weefsel dat werd gemeten over een langere periode 7. Merk op dat voor de beeldvorming van ontwikkelings-perioden, de ogen disc-hersenen complex moet blijven intact en dient minimaal contact met de lijm te hebben. </li><li> Gebruik een dekglas bedekt met een druppel Sylgard dat is geschoren te maken te dun en plat. Verdeel 20μL HL3 op het midden van het dekglaasje en lijm het levend weefsel van de Sylgard. Genereer een pakking die het mogelijk maakt bellen om door de kamer gaan zonder het blootstellen van het levend weefsel in de lucht (Fig. 2B). De pakking moet dik genoeg zijn om te voorkomen dat het neerslaan van de weefsels, maar dun genoeg om het weefsel dicht bij de confocale microscoop lens te brengen; we gebruiken 250μm in onze setup. Monteer de perfusie kamer, let daarbij goed op het weefsel volledig onder water te allen tijde te houden. In eerste instantie beginnen perfusie met een snelheid dicht bij 100μL per minuut met behulp van een peristaltische pomp. Deze snelheid is vrij snel, afhankelijk van de pakking dikte die de kamer hoogte definieert. Voor de beeldvorming op de schaal van uren, kan het nodig zijn 20-hydroxyecdyson en antibiotica, maar niet antifungale toe te voegen, en perfusie presteren op veel lagere snelheden rond 10μl per minuut. Ten slotte hebben we bubble zuurstof in het kweekmedium dat de perfusie kamer levert. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Aan het einde van onze video-protocol tonen we een voorbeeld voor live imaging in de ontwikkeling van fotoreceptorcellen met behulp van de voorbereiding gepresenteerd in hoofdstuk 5. Deze voorbereiding maakt gebruik van Drosophila transgenese tot cel-specifiek express fluorescerende verslaggevers. In het voorbeeld zijn twee TL-reporters uitgedrukt onder controle van de fotoreceptor-specifieke GMR-Gal4 driver 8: het membraan-gelabeld myrRFP en de endosomale marker 2xFYVE-GFP 9. Twee-kanaals 3D-datasets met een selectiekader van 70x70x17.5μm en een voxel grootte van 137x137x700nm (512x512x26) werden verkregen elke 1 minuut. De film toont een geselecteerde vlak na verloop van tijd in deze 4D dataset dat de dynamiek van intracellulaire endosomale mensenhandel en blaasje fusie gebeurtenissen onthult. Representatieve beelden voor vaste weefsel voorbereidingen van het oog en de lamina worden getoond in Fig. 3.

<ol><li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+lobe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li>
<li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li>
<li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li>
<li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li>
<li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+subtype+specification%3A+from+flies+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li>
<li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaoptin%2C+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis%2C+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li>
<li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system%3A+optic+neuropile+expression+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li>
<li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li>
<li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li>
</ol>

Fluorescerende probes gebruikt voor beeldvorming Hier beschrijven we de sterke punten en beperkingen van het Drosophila visuele systeem voorbereiding voor een selectie van fluorescerende probes uit drie klassen: (1) Probes die worden toegevoegd aan een levend weefsel voorbereiding van exogeen, (2) fluorescerende eiwitten die genetisch gecodeerd zijn voor zowel live als vaste beeldvorming, (3) fluorescente kleurstoffen die worden toegevoegd aan vaste weefsel voor immunohistochemie. 1. Exogene probes: Lysotracker Green NS-26 of Red NS-99 (Invitrogen, Inc) Deze zijn in de handel verkrijgbaar fluorescente membraan-doorlaatbare stoffen die zich ophopen in sterk aangezuurd compartimenten in de cel, het meest opvallend lysosomen, late endosomen, en autofagosomen. Lysotracker bij nanomolaire concentraties (we gebruiken meestal 50 nM) dringt in de L3-en P +20% eye-schijf volledig in minder dan een minuut. Sinds Lysotracker accumuleert continu en oefent een alkalizing effect, we beeld in minder dan 5 minuten. In tegenstelling tot het oog schijven, is Lysotracker niet doordringen tot de hersenen, zonder verstoring van het weefsel. Echter, een zorgvuldige scheuren van de buitenste membraan laat penetratie van een enkele cel diameters in de optische lob. Lysosensor NS-189 (Invitrogen, Inc) In tegenstelling tot Lysotracker, Lysosensor niet ophopen in aangezuurd compartimenten, maar vertoont verhoogde fluorescentie bij zure pH. Lysosensor heeft penetratie kenmerken die erg lijken op Lysotracker. We maken gebruik van Lysosensor bij een concentratie van 1 uM. 2. Genetisch gecodeerd probes: Voor veel live-imaging experimenten, drukken we genen gelabeld met verschillende fluorescente moleculen zoals GFP, TagRFP 10 of de pH-gevoelige pHluorin 11 onder controle van het binaire Gal4/UAS expressiesysteem 12. GAL4-lijnen die te uiten in het ontwikkelen van fotoreceptoren onder andere GMR-Gal4 (alle fotoreceptoren) 8 en mDelta0.5-Gal4 (de ontwikkeling van R4 en R7) 13. Een aantal subtype-specifieke Gal4-driver lijnen bestaan ​​die maken gebruik van verschillende rhodopsine promotors 14. Vooral nuttig fluorescerende probes in live imaging zijn photoconvertible eiwitten. We hebben met succes gebruikt Dendra2, een monomere groen-to-rood photoconvertable eiwit 15. Merk op dat Dendra2 is ontworpen om te worden photoconvertible met behulp van een 488nm Argon laser lijn. Maar we zijn niet in staat om de conversie te bereiken met behulp van zichtbaar blauw licht met behulp van onze set-up in beide conventionele of resonant confocale scanning modus. In tegenstelling, conversie met 405 nm UV-laser is efficiënt. 3. Immunohistochemie: Voor de vaste volwassen oog, we vaak kiezen voor rhodamine phalloidin (Invitrogen, Inc), of anti-Chaoptin (een fotoreceptor-specifiek antilichaam 16) tot rhabdomeric structuur (figuur 1A) te visualiseren. Een goede manier om lamina cartridge structuur te analyseren is het combineren van anti-chaoptin 16, de gliale marker anti-ebbenhout 17, en anti-sec6 18 (figuur 1B). Zoals getoond in Fig. 3, deze combinatie van antilichamen onderscheidt de grote presynaptische (chaoptin) en postsynaptische (sec6) processen evenals epitheel glia (ebbenhout) in de lamina 19. Montage van de Perfusie Kamer Voor live imaging, gebruiken we een perfusie kamer die langzame uitwisseling van oplossingen kan zonder verstoring van het weefsel voorbereiding. Een demonstratie van perfusie kamer assemblage is opgenomen in de video-en schematisch weergegeven in figuur 2. Vergadering van de perfusie kamer wordt geïllustreerd in Fig. 2A. Begin met het leggen van de pakking weer het monster eerst en ga dan verder met de montage zoals afgebeeld. Het doel van de pakking is het creëren van een ruimte tussen de onderkant van de kamer en het deksel, een ruimte waarbinnen het weefsel is verzegeld en waardoor de oplossing zal vloeien. De ruimte binnen in de pakking moet de inlaat (oplossing komt hier), het weefsel prep, en de uitlaat waardoor de oplossing verlaat de kamer. Twee kenmerken van de pakking zijn van cruciaal belang: Ten eerste, de pakking moet nog dik genoeg zijn voor de hersenen dun genoeg om beeldvorming mogelijk is met een hoge-resolutie-lens. De ideale pakking dikte is afhankelijk van set-up-specifieke parameters. Ten tweede, een inkeping in de pakking zorgt voor een compartiment die het mogelijk maakt een zeepbel te passeren zonder contact met het monster (afb. 2B). Beeldvorming bij de microscoop We maken gebruik van een 63x (diafragma 1.3) glycerine onderdompeling lens voor de perfusie kamer of een 63x onderdompeling in water lens direct in het kweekmedium op een dia. Glycerine lenzen bieden meer werkafstand dan olie lenzen. We maken gebruik van een resonerende scanning confocale microscoop die scant op veel hogere snelheden dan een conventionele scanner (8000 Hz ten opzichte van 1400 Hz, respectievelijk). Resonant scanning maakt drie-dimensionale opnames loop van de tijd bij hogeER frame rates. Bovendien sneller scannen snelheden aanzienlijk verminderen laser fototoxiciteit 6 dat is een grote zorg voor herhaalde scans van levend weefsel. Een balans van laser intensiteit en PMT voltage (winst) moeten worden bereikt om het signaal te maximaliseren terwijl het minimaliseren van geluid en fotobleking. Een belangrijke verdere overweging is dat de hoeveelheid laser impact op een bepaalde regio wordt bepaald door de resolutie en zoom. Bijvoorbeeld, is een regio van keuze gescand met dezelfde resolutie op 256x256, zoom 2x zo op 512x512, zoom 1x, maar de maximaal mogelijke live-imaging snelheid is vier keer sneller op 256x256, zoom 2x. Voor het opnemen van de activiteit van snel bewegende intracellulaire compartimenten, hebben we met succes opgenomen met de volgende instellingen: 5 frames per z-stack met een snelheid van een z-stack per 10 seconden met een scansnelheid van 8000 Hz en 2x lijn gemiddeld. Voor lange beeldvorming sessies op de schaal van uren, we vaak vermindering van de frame rate tot een per enkele minuten en kies voor grotere gebieden als de voorbereiding is meer kans op verschuiven. Drosophila Visual System Anatomy Figuur 3 toont de anatomie van de Drosophila volwassen oog (Fig. 3A), de volwassen hersenen (fig. 3B), en de 20% -25% popstadium oog schijf / hersenen complex (fig. 3C). Figuur 3A illustreert de volwassen ogen zowel met als zonder de lamina en de bijgevoegde vetcellen. Tijdens de volwassen oog dissectie, de lamina, die in het midden van het oog genesteld in een kom gevormd door de fotoreceptorcel organen (links), moet worden verwijderd zonder verstoring van de cellichamen onder (rechts). Voor de volwassen hersenen dissectie, moet men in staat zijn om de fotoreceptorcel lichamen, de lamina, de optische kwab, de centrale hersenen en luchtpijp (fig. 3B) te onderscheiden. De fotoreceptoren en de luchtpijp moet worden verwijderd voor deze dissectie, terwijl de lamina aan de optische lob. Om te helpen bij de identificatie van de 20-25% popstadium oog schijf / hersenen complex, is een live beeld weergegeven in figuur 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. (A) volwassen hersenen. (B) volwassen oog. (C) 20% -25% popstadium eye-disc/brain complex. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. (A) Perfusie kamer montage en (B) pakking positionering ten opzichte van het monster. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. (A) Adult rhabdomere kleuring met behulp van anti-chaoptin. (B) Adult lamina kleuring met behulp van anti-chaoptin (groen, fotoreceptoren), anti-ebony (rood, glia) en sec6 (blauw, interneuronen).

Special Equipment: <ol><li> Dissection Scope: Leica Mz12.5 met digitale camera </li><li> Leica TCS SP5 Confocale Tandem-Scanner Microscoop voor conventionele en resonante scannen leven imaging microscopy, waaronder blauw (488nm), groen (561nm), oranje (594nm) en ver-rood (633nm), lasers en speciale 63x, 1,4 glycerine en een 63x, 1,3 onderdompeling in water lenzen. </li><li> Harvard Instrumenten Confocale Imaging Kamer RC-30 en de peristaltische pomp model 720 </li><li> Sutter Pipetteer trekker P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Visage Imaging </li></ol>

de voorbereiding van de ontwikkeling en adult drosophila hersenen en retinae voor live imaging

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Hersenen en het visuele systeem worden veel gebruikt model systemen om neuronale ontwikkeling, functie en degeneratie te bestuderen. Hier laten we drie bereidingen van de hersenen en het visuele systeem, dat het bereik van de zich ontwikkelende oog disc-hersen-complex in de ontwikkelingslanden poppen aan individuele ogen en de hersenen dissectie van volwassen vliegen te dekken. Alle protocollen zijn geoptimaliseerd voor de live-cultuur van de voorbereidingen. Echter, presenteren we ook de voorwaarden voor vaste weefsel immunohistochemie waar van toepassing. Ten slotte tonen we leven imaging voorwaarden voor het gebruik van deze voorbereidingen conventionele en resonante 4D confocale leven beeldvorming in een perfusie kamer. Samen vormen deze protocollen bieden een basis voor het live-beeld op verschillende tijdschalen variërend van functionele intracellulaire assays op de schaal van minuten tot ontwikkelings-of degeneratieve processen op de schaal van vele uren.

Dit protocol beschrijft drie<em&gt; Drosophila</em&gt; Voorbereiding: 1) volwassen hersenen dissectie, 2) volwassen netvlies dissectie en 3) het ontwikkelen van eye-schijf-hersen-complexen dissectie. De nadruk wordt gelegd op speciale voorbereiding technieken en voorwaarden voor de live-imaging, maar alle voorbereidingen kunnen worden gebruikt voor vaste weefsel immunohistochemie.

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Het brein en het visuele systeem van Drosophila zijn veelgebruikte modelsystemen om neuronale ontwikkeling, functie en degeneratie te bestuderen. Hier tonen wij drie ...

Hallo allemaal, in deze video demonstreer ik hoe u hersenen en retina prepareert voor live imaging en immunohistochemie, met een focus op fotoreceptorcellen. Eerst laat ik zien hoe u zich voorbereidt op hersendissecties. Daarna demonstreer ik drie verschillende dissecties: de volwassen hersenen, de volwassen retina en het in ontwikkeling zijnde oog.Voor elk van deze gevallen kan het weefsel worden gefixeerd voor immunohistochemie of levend worden afgebeeld. Ten slotte zal ik beschrijven hoe we levend weefsel afbeelden, en zal ik enkele voorbeelden laten zien van live-imaging met behulp van resonantiescan confocale microscopie. Laten we beginnen.Voor de secties van de gonaden zijn scherpe pincetten nodig. Gebruik een slijpblok of zeer fijn schuurpapier en beweeg de pincetten voorzichtig heen en weer aan elke zijde totdat de uiteinden samenkomen. Voor een zeer fijne punt gebruiken we een standaard slijpsteen.Ik zal hier niet ingaan op de verscherpingstechniek, maar ik wil wel benadrukken dat scherpe pincetten essentieel zijn voor dissecties aan levende organismen. Wij slijpen elke dag de pincetten voor dissecties van volwassen hersenen. Plaats de vliegen op een CO2-pad om ze te anesthetiseren en sorteer het gewenste genotype.Voor dissecties van de pupil pakt u eenvoudig met een pincet een pupil uit het potje, waarbij u er nauwkeurig op let dat de pupilhuls niet beschadigt. Maak een propje van een Kimwipe en bevochtig deze met water. Deze gebruikt u tijdens de dissectie om resten van uw pincet te verwijderen.Plaats een dissectieschaal op de tafel van een stereomicroscoop en vul deze met HL 3-oplossing. Alle dissecties worden in HL 3 uitgevoerd om te garanderen dat het weefsel levend en gezond blijft tijdens de dissectieprocedure. Daarnaast gebruik ik bij voorkeur een dissectieschaal met een bodembedekking van Sylgard om mijn pincetten tijdens de dissectie te beschermen.Bereid nu een fixeersolution voor. Als u van plan bent om immunohistochemie uit te voeren, brengt u 180 µL HL 3 aan in een microcentrifugebuisje van 500 µL.Voeg 20 µL 37% formaldehyde toe om een 3,7% formaldehyde-oplossing te verkrijgen. Ten slotte is een juiste handpositie essentieel voor succesvolle dissecties; met een goede handpositie blijven uw pincetten stabiel en zijn ze in staat tot gecontroleerde, subtiele bewegingen.Plaats eerst de pincet tegen de zijkant van uw duim en breng vervolgens de wijsvinger recht naar beneden zodat de vingertop bovenop rust. Plaats nu de zijkant van de pincet tegen de zijkant van uw middelvinger en beweeg naar de dissectieschaal. Maak fysiek contact met de schaal met uw duim en middelvinger, terwijl u uw duim en middelvinger op de schaal laat rusten.Plaats uw pols op de microscooptafel. Op deze manier heeft u drie steunpunten stevig op het oppervlak tijdens de dissectie, waardoor het mogelijk is om zeer subtiele manipulaties met de pincet uit te voeren.Op het CO2-kussen. Plaats een volwassen vlieg met de ventrale zijde naar boven en de kop van uw hand afgewendt. Pak het thoraxgedeelte net onder de kop vast.Wanneer dit correct is uitgevoerd, zullen de poten en de proboscis uitsteken terwijl u via een stereomicroscoop kijkt; pak de uitgestrekte proboscis met de pincet vast om de kop te verwijderen, gooi het lichaam weg en dompel de kop onder. Stel de focus opnieuw in op de ondergedompelde kop. De gehele dissectie zal in de oplossing worden uitgevoerd.Het is zeer belangrijk om de kop te allen tijde met de pincet vast te houden. Anders zal de kop gaan drijven. En onthoud dat een drijvende kop altijd moeilijk terug te halen is.Als de kop tijdens de dissectie uit focus raakt, beweeg deze dan simpelweg terug naar het brandvlak zonder de microscoop aan te passen. Deze ogenschijnlijk eenvoudige taak kan in het begin moeilijk zijn, maar het in focus houden van de kop zal na verloop van tijd gemakkelijker worden. Begin de dissectie door eerst het bindweefsel tussen de proboscis en het oog openscheuren.Scheur door het oog terwijl u te allen tijde stevig vasthoudt met ten minste één pincet. Zorg ervoor dat de punt van het pincet slechts net onder het netvlies of de cuticula bevindt. Wissel af tussen links en rechts om beschadiging van het onderliggende brein te voorkomen.Gebruik de pincet om de retina weg te scheuren, waarbij u richting de achterkant van de kop werkt. Het wegscheuren van de retina vergroot de kans dat de lamina aan de optic lobe bevestigd blijft. Ga tijdens deze dissectie verder rondom de achterkant van de kop, scheur onderweg de cuticula weg, scheur door het andere oog en begin de cuticula weg te trekken.Zolang u de kutikula vastpakt, weet u dat u het brein niet verbrijzelt. Met dit in gedachten trekt u de kutikula en het retina verder weg tot het brein zichtbaar is. Zodra het brein zichtbaar is, kunt u beginnen met het verwijderen van de aan het brein gehechte trachea; blijf deze, samen met de kutikula, wegtrekken tot het brein is geïsoleerd.Op dit punt moet u zich opnieuw richten op de bodem van uw schaaltje voor de resterende stappen voor de beeldvorming van fotoreceptorterminals. Het is wenselijk om de lamina te behouden, maar u moet het netvlies verwijderen, dat de cellichamen en sterk autofluorescerend pigment bevat. Trek hiervoor voorzichtig aan de overblijfselen van het bossige cellichaam zonder de lamina te beschadigen.Dit is een subtielere vaardigheid waarvoor oefening nodig is. Verwijder de resterende trachea. Omdat de hersenen anders kunnen gaan drijven tijdens de overnachtse antibody-wasstappen, kan het volwassen brein gedurende uren of zelfs een hele nacht in leven worden gehouden onder condities die ik in sectie zeven zal bespreken. Voor immunohistochemie is het volwassen brein nu klaar om gefixeerd te worden met formaldehyde.Gebruik een P 20 pipet ingesteld op vijf µL om de volwassen hersenen over te brengen naar de reeds bereide fixeeroplossing. Ga gedurende 20 minuten door met het dissekeren van volwassen hersenen, wat vier tot 10 hersenen zou moeten opleveren. Laat de hersenen nog 40 minuten fixeren.Deze duur kan echter variëren. Voor een optimale kleuring met het primaire antilichaam verwijdert u de formaldehyde-oplossing en wast u de hersenen drie keer gedurende vijf minuten met telkens 400 µL van een oplossing bestaande uit PBS en 0,4% TRITTON X 100, hierna aangeduid als PBS Triton. Nadat de fixeeroplossing volledig is weggewassen, kunt u de oplossing met het primaire antilichaam toevoegen.Begin deze dissectie zoals beschreven voor het volwassen brein. Nadat de kop is ondergedompeld en de microscoop opnieuw is gefocust, begint u met het openscheuren van het bindweefsel tussen de proboscis en het oog, boven de proboscis. Scheid de cuticula van het oog. Scheid nu met één pincet de cuticula van de onderzijde van het oog, terwijl u richting de achterzijde van de kop werkt.Pak voor deze dissectie het midden van de achterkant van de kop vast. Het is geen probleem als het brein met de andere pincet wordt verbrijzeld. Pak het oog vast en trek het open.Laat het oog naar de bodem van de schaal zakken. De lamina is waarschijnlijk nog gehecht aan het oog en kan worden gebruikt voor live imaging van de fotoreceptorterminals van volledig intacte fotoreceptorcellen. De volgende drie secties leggen uit hoe het oog moet worden voorbereid voor immunohistochemie.Voor immunohistochemie wordt het oog overgebracht naar de fixeeroplossing. Gebruik een P20 pipet ingesteld op 5 µL en ga door met het dissekeren van de volwassen ogen gedurende in totaal 10 minuten. Laat de ogen vervolgens nog 30 minuten fixeren.Verwijder de fixatieoplossing en voer de wasstappen uit zoals beschreven bij de dissectie van de volwassen hersenen. Als u uiteindelijk de materiële structuur van het oog wilt afbeelden, dan moet deze worden verwijderd. Plaats de gefixeerde ogen nu terug in uw dissectieschaal en verwijder eventuele luchtpijpjes of vetcellen die mogelijk nog vastzitten.Houd vervolgens de buitenkant van het oog vast met één pincet en verwijder de lamina met het andere pincet. Deze zou in één stuk moeten loskomen, waardoor de onderliggende cellichamen worden blootgesteld. Let erop dat u alleen de lamina vastpakt; anders riskeert u dat de cellichamen van het netvlies loslaten.Verplaats de ogen met een P 20 pipet naar 400 µL PBS Triton in een buisje van 500 µL. Schud ze voorzichtig overnacht bij vier graden om het autofluorescerende rode pigment uit de fotoreceptoren te verwijderen. Gooi de volgende dag de wasoplossing weg en voeg het primaire antilichaam toe voor live imaging van volwassen ogen zonder de lamina.We gebruiken uitsluitend volwassen vliegen van de soort ferret, die zich in een laat pupariumstadium bevinden, kort voor het uitkomen. In dit stadium scheiden de cellichamen van de fotoreceptoren zich tijdens de dissectie van ferret van de terminals in de lamina. Volwassen puparia hebben goed gedefinieerde vleugels, ogen en een cuticula die zichtbaar is door de pupenhuls.Selecteer een pop en dompel deze onder in HL three. Verwijder het voorste gedeelte van de poppenhuls om de kopregio bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het dunne binnenmembraan dat de vlieg in ontwikkeling verder omhult.Pak de basis van de kop vast met de pincet en trek deze los. Gooi de rest van de pop weg terwijl de kop ondergedompeld blijft. Ga verder zoals beschreven in de oogdissectie voor immunohistochemie in het volwassen stadium van de rat.De cellichamen van de fotoreceptoren zullen echter gemakkelijker losraken van de lamina, waardoor u de cellichamen in de retina kunt afbeelden. Bovendien blijft de lamina verbonden met de optische lob, wat het mogelijk maakt om de distale lamina af te beelden. Indien u de proximale lamina wilt afbeelden, waar de terminale cartridges van de fotoreceptoren zichtbaar zijn, voer de dissectie van het oog dan uit bij een volwassen vlieg, waarbij de lamina sterker aan het oog is gehecht.De ontwikkelende oogschijf bij 20% pupilontwikkeling is een favoriet geworden voor live imaging in ons laboratorium. Dit komt omdat deze enkele laag van relatief grote ontwikkelende cellen gemakkelijk waarneembaar is met behulp van confocale microscopie. Om een pupa van 20% te selecteren, let dan op de Ian-tubuli, een groen vlekje dat onder de pupilcase verschijnt, en vermijd pupae met een donker lichaam, aangezien dit pas na 20% pupilontwikkeling wordt gevormd.Nadat een pop is geselecteerd, dompel je deze in HL drie in je dissectieschaal en verwijder je voorzichtig een anterieur deel van de popzak. Pas op dat je het dunne binnenmembraan niet doorboort. Pak het binnenmembraan met je pincet vast en trek het open.Houd de vrijgekomen inhoud zorgvuldig in de gaten om de ontwikkelende hersenen en oogschijven te vinden, die zeer prominent aanwezig zijn. Isoleer de hersenen onderin de dissectieschaal. Scheid de centrale hersenen voorzichtig van de optische lob.Het optic lobe I-schijfcomplex zal worden gebruikt voor live imaging. Als u het weefsel gedurende een korte periode in slechts één of twee oplossingen wilt afbeelden, kunt u het weefsel op een glazen objectglas plaatsen. Bereid het objectglas in dat geval voor door het oppervlak eerst te coaten met Sylgard volgens de instructies van de fabrikant.Plaats 20 µL HL drie in het midden van hetpreparaat. Transporteer het gedissecteerde weefsel in nog eens 20 µL HL drie naar hetpreparaat. Het weefsel mag nooit aan de lucht worden blootgesteld.Daarnaast moet elke stress of spanning door het hanteren van de pipet worden vermeden. Voor live imaging moet het weefsel stevig worden vastgezet. Gebruik een glaselektrode zoals die worden getrokken voor elektrofysiologische registraties.Breek de punt af en vul het uiteinde met lijm door negatieve luchtdruk met de mond te creëren; breek slechts genoeg van de elektrode af zodat de lijm kan binnendringen. Gebruik nu positieve druk om een kleine hoeveelheid lijm op de sill guard aan te brengen onder een druppel HL three. Plaats vervolgens snel het weefsel op de lijm, waarbij de gewenste oriëntatie voor live-imaging behouden blijft.Een waterimmersielens kan nu worden gebruikt voor beeldvorming. Als u een membraanpermeabele kleurstof wilt toevoegen, kunt u deze aan het bad toevoegen. Voor beeldvorming over langere perioden, of om oplossingen volledig of meerdere keren te wisselen, maken we gebruik van een perfusiekamer die is verbonden met een peristaltische pomp die langzaam cultuuroplossing over het levende weefsel perfuseert.Gebruik een dekglas gecoat met een druppel Sylgard die is afgeschraapt om deze dun en vlak te maken. Breng 20 µL HL three aan in het midden van het dekglas. Schuif het levende weefsel over de Sylgard en plak het vast.Maak een pakking waarmee bellen door de kamer kunnen passeren zonder dat het levende weefsel aan lucht wordt blootgesteld. De pakking moet dik genoeg zijn om te voorkomen dat het weefsel wordt geplet, maar dun genoeg om het weefsel dicht bij de lens van de confocale microscoop te brengen. Stel de perfusiekamer samen en zorg erbij voor dat het weefsel te allen tijde volledig ondergedompeld blijft.Oplossingsuitwisselingen kunnen worden uitgevoerd met snelheden tot 100 µL per minuut. Voor beeldvorming over een periode van uren is het mogelijk dat u 20 hydroxy Dyson en antibiotica moet toevoegen, maar geen antimycotica, en dat u perfusie uitvoert op veel lagere snelheden van rond de 10 µL per minuut. Daarnaast borrelen we zuurstof in het cultuurmedium dat de peristaltische pomp voedt.U beschikt nu over alle vaardigheden die nodig zijn voor een succesvolle dissectie van het drosophila-brein en het netvlies. Daarnaast kunt u levende, ontwikkelende oogschijven of volwassen fotoreceptoren afbeelden. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een protocol om de migratie van gliacellen te onderzoeken in de zich ontwikkelende Drosophila oog met behulp van levende microscopische analyse gecombineerd met GFP gelabelde gliacellen.

Live-Imaging van gliale cel migratie in de Drosophila Eye verbeelding Disc

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

Deze video beschrijft een methode om intacte hersenen van volwassen vliegen onder een brugschuif te monteren en toont het protocol dat wordt uitgevoerd op immunostained hersenen voor fluorescerende microscopie.

Volwassen Drosophila-hersenen monteren: een methode om dia's voor confocale beeldvorming voor te bereiden

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates a live-imaging technique to study eye patterning in a Drosophila melanogaster pupa. Green fluorescent protein (GFP)-tagged markers enable visualization of cellular organization and differentiation during the formation of the developing eye structure.

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft drie stappen om larvale en volwassen Drosophila optische kwabben voor te bereiden op beeldvorming: 1) hersendissecties, 2) immunohistochemie en 3) montage. De nadruk wordt gelegd op stap 3, omdat er verschillende montagerichtingen nodig zijn om specifieke optische lobstructuren te visualiseren.

Dissectie, immunohistochemie en montage van larvale en volwassen Drosophila-hersenen voor visualisatie van optische kwabben

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

We presenteren een methode die specifiek is afgestemd op het beeld van de hele hersenen van volwassen Drosophila tijdens gedrag en als reactie op stimuli. Het hoofd is gepositioneerd om optische toegang tot de hele hersenen mogelijk te maken, terwijl de vlieg zijn benen en de antennes kan bewegen, de punt van de proboscis en de ogen zintuiglijke stimuli kunnen ontvangen.

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

Leer dissectiemethoden voor Drosophila-hersenen en -retina's voor live imaging en immunohistochemie. Dit protocol toont technieken om weefselviabiliteit te behouden tijdens neurobiologisch onderzoek.

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Meer video's verkennen