Experimentele Metastase Assay
24 augustus 2010
Dit artikel beschrijft de procedures van een experimentele metastase test die wordt gebruikt om de metastatisch potentieel van kanker bij de mens cellijnen te bepalen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de metastatische capaciteiten van menselijke kankercellen te testen door middel van injecties in de staartader. Bij immunodeficiënte muizen worden de cellen voorbereid voor injectie. De cellen worden vervolgens geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen, die na één tot twee maanden longmetastasen zullen genereren.
De muizen worden gedissected en longmetastasen worden gekwantificeerd en gekweekt. Resultaten van dit type assay geven de mate van metastase van een bepaald type kankercel aan. Hallo, ik ben Sonali Mohanty van Dr.LE's Lab in de afdeling Biomedische Genetica aan de Universiteit van Rochester.
Vandaag zullen we u een procedure laten zien om een experimentele metastase-assay uit te voeren. We gebruiken deze procedure in ons lab om kankermetastase te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Begin met cellen die zijn gekweekt tot ongeveer 70% Co fluence aspirate media van de plaat en was voorzichtig eenmaal met één XPBS. Voeg vervolgens twee milliliters 0,05% Trypsin inversing toe. Wieg voorzichtig de plaat om celdetachment te vergemakkelijken.
Bekijk de cellen onder een microscoop terwijl ze loslaten. Voeg een voldoende volume media toe dat FBS bevat om de tripsin-activiteit te stoppen. Breng vervolgens over naar een 50 milliliter buis.
Tel de cellen met behulp van een hemo cytometer. Zodra de concentratie is bepaald, centrifugeer ongeveer 200 keer de zwaartekracht gedurende drie minuten zonder de cellenpellet te verstoren. Verwijder voorzichtig het medium Resus en suspendeer een geschikt volume Hank's balansbufferoplossing of HBSS om een eindconcentratie van ongeveer vijf keer 10 tot de zes cellen per milliliter te bereiken.
Filter vervolgens door een Falcon's 70 micrometer celstrainer. Om grote celaggregaten uit te sluiten, plaats de punt van de pipette direct op de filter, geplaatst over een vijf milliliter kweekbuis. Spuit snel de suspensie door de filter in de buis.
Tel de cellen opnieuw met behulp van trian blauw om de levensvatbaarheid te bepalen. De levensvatbaarheid moet groter zijn dan 90% vóór injectie. Verdun vervolgens tot een eindconcentratie van 2,5 keer 10 tot de zes cellen per milliliter.
Blijf op ijs. Pak voorzichtig de staart van een immunodeficiënte muis en trek deze met zijn rug tegen de spleet en zijn staart steekt uit de kleine opening aan de achterkant. Schuif de ring langzaam naar binnen langs de spleet.
Zodra de ring de mond van de muis vangt, vergrendel deze op zijn plaats. De muis mag niet vrij kunnen bewegen, maar moet een normale ademhalingssnelheid hebben. Zoek de belangrijkste staartaderen.
Er zijn vier belangrijke bloedvaten aanwezig in de staart van een muis. De slagaders bevinden zich aan de dorsale en ventrale kanten van de staart. De aderen bevinden zich aan de laterale kanten.
Zuig minimaal 200 microliter van de voorbereide cellen in een enkele milliliter spuit. Bevestig een 30 gauge halve naald en duw eventuele luchtbellen eruit. Het eindvolume in de spuit moet 200 microliter zijn.
Bereid u voor om in het distale uiteinde van de staart te injecteren. Dus als de eerste poging mislukt, kan een meer proximale regio van de staart worden gebruikt voor een tweede poging. Na het afvegen van de injectieplaats met 70% ethanol, trek de staart recht.
Houd de punt vast met de duim en ondersteun het injectiepunt met de wijsvinger. Steek de naald in de ader en injecteer de cellen. Zorg ervoor dat de naald en spuit tijdens het injecteren parallel aan de ader zijn.
Anders zal de naald door de vaatwand prikken en cellen worden geïnjecteerd in de aangrenzende staartweefsels. Trek de naald terug als de procedure succesvol is verlopen. Bloed zou van de injectieplaats moeten perfuseren.
Druk een schone katoenen bal om flossing te vergemakkelijken en palpeer de staart omhoog om eventuele resterende monsters in circulatie te duwen. Laat de muis los uit de houder en plaats hem terug in de kooi. Noteer het aantal injectiepogingen en het aantal geïnjecteerde cellen in een laboratoriumnotitieboekje.
Bepaal de levensvatbaarheid van cellen na injectie. Zoals eerder biedt deze stap geruststelling dat cellen tijdens het injectieproces in leven blijven. Aan het einde van een injectie-experiment zal de levensvatbaarheid van cellen afnemen, maar zou boven de 80% moeten blijven. Als optionele stap, centrifugeer de overgebleven cellen en spoel de pellets eenmaal met PBS.
Bevroor de pellets vervolgens op min 80 graden Celsius voor toekomstige analyses zoals western blotting. Om genexpressie op knockdowns te bevestigen. Na één tot twee maanden, dissecteert u de muizen om de locaties van metastasen te bepalen. Begin door de geëuthaniseerde muis op een dissectie station te plaatsen.
Spray de muis royaal met ethanol. Snijd de ribbenkast open om de longen en het hart bloot te leggen. Vervolgens snij ze zorgvuldig uit en plaats ze in PBS.
De long is de primaire plaats voor metastase omdat het het eerste capillaire bed bevat dat cellen tegenkomen. Nadat ze de circulatie zijn binnengekomen, verwijdert u het hart en spoelt u de longen in PBS en observeer vervolgens elke lob van de long onder een dissectiemicroscoop. Tel het aantal detecteerbare metastasen aan beide kanten van de long, en vervolgens het aantal longmetastasen op alle vier de lobben samen om het totale aantal longmetastasen te bepalen.
Vervolgens isoleer individuele longmetastasen door excisie met behulp van schaar. Breng elke metastase over naar een 70 micrometer celstrainer en vermaal deze met het uiteinde van een steriele naaldkappen. Spoel de celstrainer af met enkele milliliters medium en verzamel de cellen die door de filter gaan.
In een kweekschaal bevat elke schaal de cellen van één metastase. Incubeer de cellen gedurende ten minste vier dagen bij 37 graden Celsius zonder verstoring. Aanvankelijk zullen zowel kankercellen als fibroblastcellen op de platen groeien, maar geleidelijk zullen de fibroblastcellen afsterven en worden vervangen door kankercellen.
Als de kankercellen genen dragen die resistent zijn tegen geneesmiddelen, selecteer de cellen met de bijbehorende antibiotica. Na d
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een experimentele metastase-assay die wordt gebruikt om het metastatisch potentieel van menselijke kankercellijnen te evalueren via staartaderinjecties in immuundeficiënte muizen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Oncologie
- Metastasenonderzoek
- Experimentele biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van kankermetastase is cruciaal voor de ontwikkeling van effectieve behandelingen.
- Experimentele assays helpen bij het kwantificeren van het metastatisch potentieel van kankercellen.
- Immundeficiënte muizen vormen een geschikt model voor het bestuderen van het gedrag van menselijke kankercellen.
- Injecties in de staartvene zijn een veelgebruikte methode voor het beoordelen van longmetastasen.
Doel van de studie
- Om de metastatische vermogens van menselijke kankercellen te testen.
- Om longmetastasen die zijn gegenereerd uit geïnjecteerde cellen te kwantificeren en te kweken.
- Om inzicht te verschaffen in het metastatische potentieel van verschillende kankercellijnen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van menselijke kankercellen voor injectie.
- Injectie van cellen in de staartader van immunodeficiënte muizen.
- Monitoring van de ontwikkeling van longmetastasen over een periode van één tot twee maanden.
- Dissectie van muizen om longmetastasen te kwantificeren en te cultiveren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van longmetastasen vanuit geïnjecteerde kankercellen.
- Kwantificering van de metastasen levert gegevens over het metastatisch potentieel.
- Gecultiveerde metastasen kunnen worden gebruikt voor verdere analyse.
- De resultaten wijzen op variabiliteit in de metastatische vermogens tussen verschillende kankercellijnen.
Conclusies
- De experimentele metastase-assay is effectief voor het evalueren van het gedrag van kankercellen.
- De verkregen inzichten kunnen therapeutische strategieën tegen metastatische kanker informeren.
- Verdere studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om de onderliggende mechanismen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De experimentele metastase-assay biedt een kwantitatief in vivo-model om het metastatisch potentieel van menselijke kankercellijnen te beoordelen, wat bijdraagt aan targetvalidatie en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van oncologische geneesmiddelen. Door de isolatie en propagatie van sterk metastatische derivaten mogelijk te maken, faciliteert de assay de identificatie van genen en pathways die de metastatische progressie reguleren, wat ten behoeve komt van de lead-identificatie en preklinische prioritering. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen in de daaropvolgende therapeutische ontwikkeling door in vitro-bevindingen te koppelen aan functionele metastatische uitkomsten in een ziekte-relevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door de metastaserende capaciteit van kankercellen te kwantificeren na genetische of farmacologische perturbatie.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare in vivo readout voor functionele validatie van targets in metastase-relevante pathways.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door moleculaire veranderingen te koppelen aan metastatische fenotypes in immuungecompromitteerde muizen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve tellingen van metastasen die dienen als afhankelijke variabelen voor het screenen van modulatoren van metastatische verspreiding.
- Operationele waarde: Standaardiseert de celvoorbereiding, injectie en weefselwinning om de reproduceerbaarheid tussen experimenten te waarborgen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de afleiding van metastatische cellijnen mogelijk met verbeterde invasieve eigenschappen voor gebruik in secundaire screening en target-deconvolutie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van een ziekterellevant systeem waarin de vorming van longmetastasen de klinische patronen van hematogene verspreiding weerspiegelt.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale studies door re-injectie van gecultiveerde metastasen mogelijk te maken om de stabiliteit van het metastatisch fenotype te beoordelen.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de ontdekking van biomarkers door moleculaire profilering van geïsoleerde metastasen in vergelijking met parentale lijnen mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay fungeert als een instrument in de ontdekkingsfase dat de brug slaat tussen het testen van doelwithypotheses en fenotypische validatie, wat beslissingen over de voortgang van verbindingen en mechanistische follow-up in oncologische pijplijnen ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesegestuurd onderzoek naar regulatoren van metastase via kwantitatieve assays voor longkolonisatie.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantificeerbare resultaten (aantal metastasen per long), waardoor vergelijkingen tussen genetische of chemische condities mogelijk worden.
- Analytics: Genereert op tellingen gebaseerde data die geschikt zijn voor statistische analyse om significante verschillen in metastatisch potentieel vast te stellen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege ontdekkingen met preklinische validatie door een model te bieden dat orgaanspecifiek metastatisch tropisme weerspiegelt.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van de metastatische capaciteit over meerdere kankertypes en therapeutische modaliteiten.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door causale verbanden aan te tonen tussen genmodulatie en de onderdrukking of versterking van metastase.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde drempelwaarden voor cellevensvatbaarheid (>90% vóór injectie, >80% na injectie) en gestandaardiseerde injectievolumes.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door functionele metastasedata te leveren die complementair zijn aan in vitro assays voor invasie en proliferatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van hun aangetoonde effect op de metastatische last in vivo.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de omgang met dieren, intraveneuze injectietechnieken en aseptische weefseldissectie.
- Afhankelijk van toegang tot immunodeficiënte muismodellen en faciliteiten voor langdurige huisvesting van dieren (één tot twee maanden).
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor celpreparatie, levensvatbaarheidsbeoordeling en kwantificering van metastasen om variabiliteit te minimaliseren.
- Omvat technische overwegingen voor de isolatie van metastasen, inclusief enzymatische of mechanische dissociatie en filtratie om enkelcelculturen te verkrijgen.
- Beperkt tot het modelleren van vroege disseminatie en longkolonisatie; legt latere stadia van metastasering niet vast, zoals extravasatie of groei in verre organen buiten de longen.
