Name: Experimentele Metastase Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Leer een experimentele metastase-assay om de metastatische potentie van humane kankercellijnen te evalueren via staartaderinjecties in immuundeficiënte muizen. Deze methode kwantificeert longmetastasen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol werd getest en geoptimaliseerd in eerste instantie in het laboratorium van Dr Richard Hynes (MIT). De financiering wordt verstrekt door de NYSTEM IDEA Award (voor LX) en Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (voor LX).

1. Monstervoorbereiding <ol><li> Grow cellen ~ 70% confluent in hun specifieke media met groeifactoren of FBS (bijvoorbeeld DMEM met 10% FBS voor de MC-1-cellen). Aspireren media van plaat-en voorzichtig een paar keer wassen met 1 x PBS (8 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 1,15 g / L van Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 0,2 g / L van KH 2 PO 4, pH 7,3). </li><li> Aspireren PBS en voeg 2 ml van 0,05% trypsine in Versene (0,014 g / L van fenol rood en 0,2 g / L EDTA-Na in 1 x PBS, pH 7,2). Schud plaat cel onthechting te vergemakkelijken van de plaat. Let op de cellen onder een microscoop. Het duurt meestal 2-5 minuten voor de cellen los te maken. </li><li> Voeg een ruime hoeveelheid media met FBS (of soja-trypsine-remmer) aan de trypsine-activiteit doven en cellen te verzamelen in een 50 ml falcon buis. Tellen cellen met behulp van een hemacytometer. Load 10μL van de celsuspensie op een schone hemacytometer. Het aantal cellen per ml is gelijk aan het gemiddelde # van cellen in elk van de vijf pleinen, vermenigvuldigd met 10 4. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1000 RPM (of ~ 200 xg) in een benchtop centrifuge gedurende 3 minuten. </li><li> Verwijder voorzichtig de media zonder de cel pellet. Resuspendeer cellen in een geschikt volume van Hanks Balanced Buffer Solution (HBSS), tot een uiteindelijke concentratie van ~ 5 x 10 6 cellen / ml te bereiken. </li><li> Filter cellen via een Falcon 70 um cel zeef om grote cel aggregaten uit te sluiten. Plaats de punt van de pipet direct op het filter over een gelabelde 5 ml Falcon buis cultuur. Snel uitwerpen van de schorsing door de filter in de cultuur buis. </li><li> Opnieuw tellen cellen met behulp van een hemacytometer en verdun ze tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 x 10 6 / ml. Houden cellen op ijs. </li><li> Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen. Meng een aantal cellen met trypan blauw en meet het percentage van dode (blauwe) cellen over de totale cellen met behulp van een hemacytometer. De levensvatbaarheid van de cellen moet ≥ 90% voorafgaand aan de injectie. </li></ol> 2. Intraveneuze injectie <ol><li> Veranderen handschoenen. Voorzichtig pak je de staart van een immunodeficiëntie muis (naakt, NOD-SCID, of NSG, Jackson's Laboratory) en trek hem in de muis restrainer, met zijn rug tegen de gleuf en de staart uit de kleine opening in de achterkant van de restrainer . </li><li> Langzaam schuift de ring naar binnen langs de gleuf en vergrendel deze op zijn plaats zodra de ring vangt de monding van de muis. De muis mag niet vrij kunnen bewegen, maar moet normaal van de ademhaling te hebben. </li><li> Zoek de grote staart aderen. Vier grote bloedvaten aanwezig zijn in een muis staart. Bloedvaten op de dorsale en ventrale zijden van de staart zijn slagaders. Aders zijn op de zijkanten van de staart. </li><li> Teken meer dan 200 pi van de bereide cellen in een 1 ml spuit. Bevestig de 30 G1 / 2 inch naald en duw eventuele luchtbellen weg die kunnen bestaan. Het uiteindelijke volume van cellen in de spuit moet 200 pi (dat wil zeggen, 5 x 10 5 cellen in totaal) zijn. </li><li> Injecteer cellen in de staart ader. <ol class="lalpha"><li> Start vanaf het distale uiteinde van de staart, dus als de eerste proef mislukt, een meer proximaal gebied van de staart kon worden gebruikt voor een tweede poging. </li><li> Veeg de staart met 70% ethanol. Trek de staart. Houd het uiteinde van de staart met duim en ondersteuning van het punt voor injectie met de wijsvinger. </li><li> Steek de naald om de ader te injecteren en de cellen. Zorg ervoor dat de naald en spuit zijn parallel aan de ader tijdens de injectie, anders kan de naald steken door middel van de vaatwand en injecteer de cellen in het aangrenzende staart weefsels. </li><li> Trek de naald na de injectie. Bloed moet overvloedig uit de injectieplaats, indien de injectie ging met succes. Druk op een schoon stuk papier handdoek of een wattenstaafje op de injectieplaats te faciliteren stolling, en palperen de staart omhoog om eventueel resterende monster duw in de ader in omloop gebracht. </li><li> Laat de muis van de weerhouder en terug in de kooi. Noteer de injectie proces (bijvoorbeeld, hoeveel proeven nodig was om de cellen te injecteren en hoeveel cellen werden geïnjecteerd) in een lab notebook. </li><li> Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen na injectie, zoals beschreven in de sectie van monstervoorbereiding, Stap 9. Deze stap biedt geruststelling dat de cellen in leven te blijven gedurende de injectie proces. Aan het einde van een injectie experiment, zal de levensvatbaarheid van de cellen verval, maar moet hoger zijn dan 80%. </li><li> (Optioneel) Spin beneden de overgebleven cellen en een keer spoel de korrels met PBS. Bevriezing van de pellets bij -80 oC voor toekomstige analyses (bijvoorbeeld, western blots van genexpressie of knockdowns te bevestigen). </li></ol></li><li> Meestal na een of twee maanden zal de muizen worden ontleed en de locaties van de uitzaaiingen zijn schromelijk bepaald. Lung is de primaire site voor metastase, want het bevat de eerste capillaire bed, dat de cellen tegenkomen nadat zeVoer de circulatie. </li><li> Na het spoelen met PBS, elk kwab van de long (of andere weefsels die metastasen) is waargenomen onder een dissectiemicroscoop (figuur 1). Het aantal detecteerbare uitzaaiingen aan beide zijden van de longen is geteld en de aantallen van longmetastasen op alle vier kwabben worden bij elkaar opgeteld als het totale aantal longmetastasen. 1 longmetastasen gemakkelijker gedetecteerd als de longen worden gefixeerd in formaline 's nachts , omdat de uitzaaiingen zal apppear als wittige plekken in tegenstelling tot de naast elkaar gelegen donkere bruine longweefsel. </li></ol> 3. Kweken Cellen van longmetastasen <ol><li> Longmetastasen zijn geïsoleerd van geïnjecteerde muizen. Elk moet afzonderlijk worden gekweekt. </li><li> Elke metastase wordt gehakt door het einde van een naald (steriele) op een 70 um cel zeef. </li><li> Spoel de cel zeef met een aantal ml van middelgrote en verzamelde cellen die door het filter passeren in een cultuur schotel. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende ten minste vier dagen zonder verstoring. </li><li> Afwassen bloed of weefsel vuil op de schotel met PBS. </li><li> Voeg vers medium. In het begin, zowel kankercellen en fibroblast cellen groeien op de platen, maar geleidelijk, de fibroblast cellen zullen sterven uit en worden vervangen door kankercellen. Als de kankercellen te voeren elke drug resistente genen, selecteert u de cellen met bijbehorende antibiotica. </li><li> De zuiverheid van de afgeleide cellen wordt beoordeeld door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen humaan-specifieke eiwitten. We maken gebruik van een anti-humaan antilichaam vimentine (NCL-VIM-V9, Novocastra). De cellen hebben we afgeleid bevatten meestal meer dan 99% van de menselijke cellen, zelfs in de afwezigheid van de drug selectie. De nieuw verkregen cellen kunnen weer worden geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen om hun gemetastaseerde vaardigheden te testen, zoals hierboven beschreven. </li></ol> 4. Representatieve resultaten <ol><li> Aan het eind van deze test, een zeer uitgezaaide kanker cellijn geeft meestal aanleiding tot veel longmetastasen (figuur 1), 1 terwijl heel weinig longmetastasen zal komen van een slecht uitgezaaide darmkanker cellijn. </li><li> Afgeleid van de cellen met behulp van deze methode meestal aanleiding geven tot meer uitzaaiingen dan de ouderlijke lijn, wanneer ze opnieuw getest met deze test. 1-3 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Representatieve beelden van de muis longen na staartader injecties van kankercellen. 5 x 10 5 van de uitgezaaide melanoom menselijke cellijn, SM-cellen, vier werden geïnjecteerd in de staartader van immunodeficiënte muizen. Twee maanden later werden de longen geïsoleerd en uitzaaiingen werden gevonden verspreid onder de normale longweefsel.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

Metastase is de belangrijkste oorzaak van overlijden bij patiënten met kanker. Het gaat om vier belangrijke stappen: losmaken van kankercellen uit hun primaire loci, in het verkeer brengen (intravasation), hun exit uit de circulatie (extravasatie), en overleving en de groei in een verre orgaan. Metastasen in de mens wordt beschouwd als een langzaam proces en vaak gemanifesteerd na jaren van latentie. Het bestuderen van de progressie in een tijdig, was de bovenstaande relatief snel experimentele test opgericht in immunod...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Fenolrood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 2,5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon-buis</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70&amp;mu;m celzeef</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Falcon-kweekbuis</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;frac12; gauge naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Muishouder</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop-centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

experimentele metastase assay

Experimental Metastasis Assay

Metastase is de belangrijkste oorzaak van overlijden bij patiënten met kanker. Om te begrijpen van het mechanisme van metastase, was een experimenteel metastase assay bepaald aan de hand immunodeficiënte muizen. Dit artikel schetst de procedures die in deze test, inclusief monstervoorbereiding, intraveneuze injectie, en het kweken cellen van longmetastasen. In het kort werden een vooraf bepaald aantal van menselijke kankercellen voorbereid<em&gt; In vitro</em&gt; En direct ingespoten in de circulatie van immunodeficiënte muizen door middel van hun staart aderen. Een klein aantal cellen overleven de turbulentie in de circulatie en te groeien als uitzaaiingen in de interne organen, zoals de long. De geïnjecteerde muizen zijn ontleed na een bepaalde periode. Het weefsel verspreiding van metastasen is bepaald volgens een dissectie microscoop. Het aantal metastasen in een specifiek weefsel is geteld en het rechtstreeks correleert met de metastatische vermogen van de geïnjecteerde kankercellen. De ontstane metastasen worden geïsoleerd en gekweekt<em&gt; In vitro</em&gt; Als cellijnen, die vaak versterkt gemetastaseerde mogelijkheden dan de ouderlijke lijn wanneer weer geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen. Deze zeer gemetastaseerde derivaten worden nuttige instrumenten voor het identificeren van genen of moleculaire pathways die metastatische progressie reguleren.

Dit artikel beschrijft de procedures van een experimentele metastase test die wordt gebruikt om de metastatisch potentieel van kanker bij de mens cellijnen te bepalen.

Experimentele Metastase Assay

Metastase is de belangrijkste doodsoorzaak bij kankerpatiënten. Om het mechanisme van metastase te begrijpen, is een experimentele metastase-assay opgezet ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de metastatische eigenschappen van menselijke kankercellen te testen via injecties in de staartvin. De cellen worden voorbereid voor injectie in immuundeficiënte muizen. Vervolgens worden de cellen in de immuundeficiënte muizen geïnjecteerd, wat na één tot twee maanden zal leiden tot longmetastasen.De muizen worden gedissecteerd en de longmetastasen worden gekwantificeerd en gekweekt. De resultaten van dit type assay geven de mate van metastasering aan van een specifiek type kankercel. Hallo, ik ben Sonali Mohanty van het laboratorium van Dr. LE in de afdeling Biomedische Genetica aan de University of Rochester.Vandaag laten we u een procedure zien om een experimentele metastase-assay uit te voeren. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om kankermetastasering te bestuderen. Laten we beginnen.Begin met cellen die zijn gegroeid tot ongeveer 70% confluentie; aspireer het medium uit de plaat en was deze voorzichtig één keer met 1X PBS. Voeg vervolgens twee milliliter 0,05% trypsine toe. Schud de plaat voorzichtig om de loslating van de cellen te vergemakkelijken.Observeer de cellen onder een microscoop terwijl ze loslaten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een experimentele long metastase en CTL immunotherapie muis-model voor de analyse van...

Experimentele metastase en CTL adoptieve overdracht Immunotherapie Muis Model

Met behulp van kwantitatieve PCR, we zien hoe de gevestigde chick CAM-model kan worden gebruikt om kwantitatief analyseren van de uitzaaiing van menselijke tumorcellen naar verre organen.

Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model

This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

Dit orthotopisch model van menselijke prostaatkanker maakt kwantificering van tumorgrootte circulerende tumorcellen en de vorming van verschillende metastase naar de longen. Omdat de cellen van het belangrijkste orgaan moet ontsnappen, in de bloedsomloop, en implantaat in een tweede locatie, dit model effectief recapituleert het scenario bij de mens.

Een orthotope muizenmodel van menselijke prostaatkankercellen Metastasis

Dit manuscript beschrijft een methode om te kwantificeren tumor cel accumulatie in de longen in een diermodel van uitzaaiing van de tumor.

Long Tumor cel aanwerving Assay

Dit protocol wordt beschreven hoe kwantitatieve real-time PCR (QRT-PCR) gebruikt om tumorcel specifieke mRNA die metastase in de muis longweefsel detecteren.

Evaluatie van longmetastase in muizenborsttumorvirus Modellen van kwantitatieve real-time PCR

Metastase vormt een belangrijk onderdeel van de virulentie van kanker en is naar schatting verantwoordelijk voor 90% van de sterfgevallen.  We rapporteren een protocol voor een metastatisch melanoommodel bij muizen dat nuttig is voor het bepalen van de werkzaamheid van therapeutische middelen tegen dit klinische fenomeen.

Injectie van Syngene muizen Melanoma Cells om hun gemetastaseerde potentieel in de longen bepalen

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van het protocol voor de pulmonaire metastase assay (PuMA). Dit model staat onderzoekers bestuderen metastatische Osteosarcoom (OS) celgroei in longweefsel met behulp van een widefield fluorescentie- of confocale laser scanning microscoop.

Praktische overwegingen bij het bestuderen van uitgezaaide longkanker kolonisatie in met behulp van de pulmonaire metastase Assay Osteosarcoom

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Dit artikel beschrijft een workflow van technieken die worden gebruikt voor het testen van nieuwe kandidaat-mediatoren van melanoommetastase en hun werkingsmechanisme (s).

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer een experimentele metastase-assay om de metastatische potentie van humane kankercellijnen te evalueren via staartaderinjecties in immuundeficiënte muizen. Deze methode kwantificeert longmetastasen.

Experimentele Metastase Assay

Meer video's verkennen