Immunocytochemische analyse van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een Self-Made Cytospin Apparatuur

Hallo, mijn naam is Rick Pasqua, student van het Stem Cell Engineering Lab hier in het Department of Chemical and Life Sciences aan de Virginia Commonwealth University. In deze video zal ik demonstreren hoe ons lab een goedkope en zelfgemaakte STO spin-apparaat gebruikt om een waarneembare monolaag van humane pluripotente stamcellen te creëren voor de kwantificering van celoppervlaktemarkers. Aangezien veel IMMUNOCHEMISCHE protocollen zijn aangepast voor h PSC's gekweekt in chamber slides als kolonies, kunnen er problemen ontstaan bij het karakteriseren van de expressie van de biomarkers op individueel celniveau.

Het hebben van de cellen in een monolaag helpt niet alleen bij de visuele analyse hiervan, maar mogelijk ook bij het kwantificeren van hun expressie. Het sinus spin-apparaat dat onze labs gebruikt, kan worden gebouwd met materialen die in de meeste labs te vinden zijn. Er is slechts een klein celmonster nodig en er is geen specifiek reagens vereist. En nog belangrijker, het is in staat om betrouwbaar een spreiding van enkele cellen te reproduceren voor observatie. Hier zijn enkele van de dingen die je nodig hebt om het cytosine apparaat te bouwen.

Kunststof slides, aangezien deze niet per se schoon hoeven te zijn, kun je oude chamber slides gebruiken als je dat wilt. Voorgezuiverde glazen slides. Deze moeten worden schoongemaakt omdat hier de celmonolaag wordt gecreëerd.

Filterpapier, elk soort zou moeten werken, en micropipet tips. Een tot 10 microliter tips zijn wat ons lab gebruikt voordat de constructie kan beginnen. Gaten moeten eerst in de kunststof slides worden gemaakt.

Dit kan worden gedaan met behulp van een boorpers. De diameter van de gaten hangt af van de grootte van de micropipet tip en moet ongeveer de breedte zijn van het breedste deel van de tip die wordt gebruikt voor een standaard een tot 10 micropipet tip. Dit zou ongeveer zeven millimeter moeten zijn.

De hoeveelheid gaten die je in de kunststof slides maakt, hangt volledig af van het beoogde gebruik ervan. Voor de immunochemische kleuring van ons lab, bijvoorbeeld, gebruiken we meestal twee gaten, één voor de positieve kleuring en de andere voor de negatieve achtergrondcontrole. Deze slides kunnen een onbepaald aantal keer worden hergebruikt.

Voor het filterpapier, knip gewoon een stuk uit volgens de parameters van de kunststof slide. Gebruik de gaten van de slide als referentie voor het maken van gaten in het filterpapier. De grootte van het gat op het filterpapier moet groot genoeg zijn zodat de micropipet tip er strak in past zoals hier getoond.

Vervolgens moeten we het juiste aantal micropipet tips uitknippen, één voor elk gat op ongeveer de helft van de lengte. Dit zal dienen als de basis van de glazen slide voor waar de cellulaire monolaag wordt gecreëerd. Vervolgens wordt het filterpapier bovenop geplaatst.

Het filterpapier zal dienen om eventueel overtollig medium uit de suspensiekleuring te absorberen. Dit wordt vervolgens afgedekt door de kunststof slide die zal dienen als de solide ondersteuning van het apparaat. Dit kan vervolgens aan alle vier zijden worden afgesloten met gewoon huishoudelijk plakband.

Ten slotte worden volledige micropipet tips in de gesneden uiteinden van het apparaat gestoken. Dit is waar de cellulaire monsters na de suspensiekleuring worden geplaatst. Het kan ook nuttig zijn om in eerste instantie te markeren waar de gesneden uiteinden zich op de glazen slide bevinden voor een gemakkelijker herkenning.

Het Immunochemische suspensiekleurprotocol dat ons lab gebruikt, omvat eerst het oogsten van stamcellen in een enkele celsuspensie, meestal gedaan door enzymatische ing, met behulp van trypsine of niet-enzymatische EDTA-gebaseerde celdissociatie buffers. De cellen worden vervolgens overgebracht naar een ml of twee ml microcentrifugebuizen en hun standaard groeimedium. Deze worden vervolgens gecentrifugeerd bij 200 Gs gedurende vier minuten.

Dezelfde centrifugeersnelheid wordt gebruikt voor alle daaropvolgende was- en afcentrifugeer stappen. Het medium wordt vervolgens handmatig afgezogen, wees extra voorzichtig tijdens het afzuiging om ervoor te zorgen dat het cellenpellet ongestoord blijft. Dit wordt vervolgens twee keer met één ml PBS gewassen, elke keer afgecentrifugeerd en afgezogen.

De volgende stap omvat het fixeren van de cellen met behulp van 4% formaldehyde of PFA-reagentia die nodig zijn om dit te maken of vermeld in de bijbehorende uitleg voor deze video. De cellen worden geïncubeerd in de 4% formaldehyde-oplossing en gedurende 10 minuten op kamertemperatuur gelaten. Het wordt aanbevolen om deze stap uit te voeren vóór de extracellulaire suspensie, kleuring voor het gebruik van het cyto spin-apparaat.

Daarna worden de cellen twee keer met PBS gewassen om sporen van de PFA te verwijderen. De cel moet vervolgens worden geblokkeerd om onspecifieke kleuring te voorkomen. Na de PBS-wassingen in de vorige stap, zuigt u de was uit en voegt u één ml van de blokkeeroplossing toe.

Dit moet vervolgens ongeveer 45 minuten op kamertemperatuur worden gelaten. Terwijl u wacht op de blokkeeroplossing, kunt u het primaire antilichaam bereiden door het te verdunnen tot de aanbevolen verdunning en blokkeeroplossing. Bewaar dit op vier graden Celsius.

Nadat de cellen ongeveer 45 minuten in de blokkeeroplossing hebben gestaan, centrifugeer en zuig dit uit en resuspendeer ze opnieuw in de primaire antilichaamoplossing. Voor het detecteren van nonspecifieke binding en achtergrondcontrole, is het het beste om ten minste één monster negatief te houden. Hierin is geen primair antilichaam toegepast en is simpelweg opnieuw gesuspendeerd in PBS.

Alle monsters worden ongeveer een uur op kamertemperatuur gelaten. Indien gewenst, kunnen vaste cellen in de primaire antilichaamoplossing overnacht worden gelaten en twee keer worden gewassen met blokkeeroplossing. De secundaire antilichaamoplossing kan worden gemaakt terwijl het wassen wordt gedaan.

Secundaire antilichamen zijn meestal lichtgevoelig, dus dimm de lablampen indien mogelijk en bedek eventuele gebruikte containers met aluminiumfolie, dit wordt gedaan om fluorescentiebelaching te voorkomen. Anti-FA-reagentia kunnen in het protocol worden opgenomen, maar moet voorzichtig worden gebruikt, omdat dit kan resulteren in een hogere achtergrond zoals het primaire antilicha