Chronisch Salmonella Infected Muis Model

Het algemene doel van deze procedure is het tot stand brengen van een chronisch met salmonella geïnfecteerd muismodel. Dit wordt bereikt door eerst een salmonella-oplossing te bereiden. De tweede stap van de procedure is het toedienen van streptomycine aan muizen via sondevoeding, gevolgd door salmonella of enkel streptomycine.

De derde stap van de procedure is het isoleren van salmonella uit de feces van muizen en het detecteren van een salmonellainfectie in de darm van de muis met behulp van BL chroma-platen. De laatste stap van de procedure is het observeren en registreren van de lichaamsmassa van de muis en het noteren van veranderingen in de vitaliteit na salmonellainfectie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen waaruit blijkt dat een salmonellainfectie kan worden vastgesteld in de darm van muizen die via gavage met salmonella zijn behandeld.

Hoi, ik ben Michelle P uit het laboratorium van Dr. Johnson van de afdeling Geneeskunde aan de University of Rochester. Ik ben ook van het Sun Lab en ik ben Y van het Sun Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het opzetten van een Alytic Lennar-geïnfecteerd massamodel.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de signaaltransductie van de interactie tussen gastheer en bacteriën en de tumorigenese te bestuderen. Laten we beginnen. Bereid vóór de experimenten voldoende Luria-Bertani- of LB-bouillonplaten voor voor elke salmonellastam en voor gebruik gedurende het gehele experiment.

De platen kunnen worden gekoeld en gedurende enkele maanden worden bewaard. Bereid vervolgens een salmonellacultuur voor. Haal een vial met stock salmonella die is ingevroren bij minus 80 °C uit de vriezer en laat deze op het aanrecht ontdooien om de salmonella uit te platen.

Verhit een entlus in een bunsenbrander en dip deze in de ontdooide bacteriële stock. Beweeg de lus in een zigzagpatroon heen en weer over het bovenste derde deel van de LB-plaat. Verhit de lus opnieuw en roteer de plaat.

Beweeg de lus in een zigzagpatroon over de voorgaande strepen om bacteriën over het tweede derde deel van de plaat te verspreiden. Herhaal dit nogmaals. Vlam de lus opnieuw af.

Zorg ervoor dat de inoculatielus niet in de agar dringt. Laat de kolonies groeien door de platen gedurende één nacht in een incubator bij 37 °C te bewaren. Bij een correcte uitvoering moet de salmonellaplaat in ten minste één sectie individuele kolonies vertonen.

De volgende dag. Selecteer een kloon van de LB-plaat met een steriele tandenstoker of bacteriële lus en voeg deze toe aan zeven milliliter LB in een buis van 12 milliliter. Schud de buis gedurende ongeveer vijf uur bij 37 °C.

Gebruik 0,05 milliliters van deze cultuur om 50 milliliters LB in een Falcon-buis te inoculeren. Incubeer gedurende ongeveer 18 uur bij 37 °C zonder schudden.

Centrifugeer de overnight-bacteriecultuur van 50 milliliter bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 5.000 RPM en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens 1,5 milliliter Hank's gebufferde zoutoplossing of HBSS toe aan de buis om de bacteriën te resuspenderen, oftewel 100 delen LB tegenover drie delen HBSS. Breng daarna het totale volume aan met HBSS tot 15 milliliter, oftewel een verhouding van 1 op 10 van LB ten opzichte van HBSS.

Elke muis heeft 100 µL verdunde salmonellacultuur nodig, of tussen 1 × 10⁶ en 1 × 10⁸ colony forming units; onttrek vier uur vóór het experiment water en voedsel aan de muizen voordat de gavage wordt gestart. Bereid vervolgens direct voor de gavage een streptomycine-oplossing door 7,5 mg streptomycinepoeder te verdunnen in 100 µL HBSS. Zorg ervoor dat er voor elke geïnjecteerde muis een extra volume wordt bereid om rekening te houden met verlies vóór de gavage bij de muis.

Bereid eerst een voedingsnaald voor met 100 µL streptomycine-oplossing. Haal de eerste muis uit de kooi voor de gavage en houd de muis met de kop richting het werkblad. Pak de huid over de schouder van de muis stevig vast met de duim en middelvinger, en rek de kop en nek uit met de wijsvinger om de slokdarm recht te maken.

Richt de bolvormige punt van de voedingsnaald langs het gehemelte en naar de rechterkant van de achterzijde van de farynx. Voer de naald vervolgens voorzichtig door naar de slokdarm en injecteer de 100 µL streptomycine-oplossing. Er mag geen weerstand voelbaar zijn.

Herhaal dit proces voor alle experimentele en controlemuizen die aan het experiment deelnemen. Ongeveer 20 uur na de strp de m en gavage en vier uur vóór de salmonella-gavage, wordt het water en voer weggenomen bij de muizen die oraal een salmonella-gavage zullen ontvangen. Voer bij elke muis op dezelfde manier als voorheen een gavage uit, met gebruik van 100 µL salmonellalossing in HBSS.

Plaats na de gavage elke muis in een nieuwe kooi om te beginnen met het verzamelen van feces. Verwijder vanaf ongeveer acht uur na de gavage de ontlasting onmiddellijk nadat deze is uitgescheiden. Verzamel 100 milligram muisontlasting als experimenteel monster.

Verzamel dagelijks of wekelijks monsters, afhankelijk van de duur van de studie, voor de analyse van salmonella in feces. Overbreng het fecale monster naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met één milliliter PBS, vortex krachtig en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 RPM. Overbreng het supernatant naar een schone buis van 1,5 milliliter en centrifugeer bij 6.000 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en voeg 200 µL PBS toe aan de pellets; vortex om te resuspenderen. Detecteer vervolgens salmonella met een BB l roag-plaat. Gebruik 10 tot 100 µL fecale materie-oplossing per plaat en verspreid dit over de plaat zoals getoond in sectie twee.

De salmonellasoorten vertonen een mar-kleur vanwege metabole verschillen in de aanwezigheid van geselecteerde chromogenen. Tel de salmonellakolonies op de plaat om het infectieniveau tussen individuele muizen te vergelijken. In deze experimentele procedure hebben we specifieke pathogeenvrije vrouwelijke C 57 black six muizen gebruikt die zes tot zeven weken oud waren.

Muizen werden geïnfecteerd met salmonella en streptomycine plus HBSS. Controlemuizen kregen via sondevoeding alleen streptomycine. De gebruikte salmonellastammen omvatten de salmonella typhimurium wild-type stam, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, een niet-pathogene salmonellamutantstam en drie FPC-stammen uit het laboratorium van dr. James Madera die het virulentie-geassocieerde AAV R age-gen dragen in het PSKW 29 low-copy plasmide. Met dit protocol kan de kolonisatie door salmonella tyrian in de darmen van de muis worden gedetecteerd.

Chronische salmonellainfectie werd gemeten via analyse van de feces, en er werden monsters van het lichaamsgewicht en intestinal weefsel verzameld voor immunofluorescentiekleuring. Gewoonlijk treden gewichtsverlies en sterfte op binnen vier weken na de infectie. De overlevingspercentages vier weken na de infectie worden hier getoond.

Zodra muizen vier weken na infectie overleven, nemen de muizen in lichaamsgewicht toe en neemt het aantal sterfgevallen af in de resterende 23 weken. In totaal kunnen meer dan 65% van de muizen die geïnfecteerd zijn met salmonellastammen, FSY fsy, A VRA null of fsy. A VRA heterozygote, meer dan zes maanden overleven met een aanhoudende salmonellainfectie in de darm.

Na de acute infectie bleven de overlevenden salmonella dragen, wat zes maanden na de infectie kon worden aangetoond met de in dit protocol beschreven methode. Immunofluorescentieanalyse van weefselmonsters uit de darm van muizen toont de invasie van salmonella in het darmslijmvlies 27 weken na de infectie. In deze afbeelding zijn de kernen blauw gekleurd en de salmonella-infecties worden in het groen weergegeven.

Zoals te zien is in de controlegroep, is er geen heldergroene kleuring aanwezig, wat duidt op het ontbreken van salmonellakolonisatie. Daarentegen is er bij de met salmonella geïnfecteerde muizen, 27 weken na infectie, wel heldergroene kleuring zichtbaar in het darmslijmvlies. Dit toont de persistentie van de salmonellainfectie aan bij de met streptomycine voorbehandelde muis.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe een chronische infectie kan worden geïnduceerd in het muismodel. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de culturen vers voor de inoculatie moeten worden klaargemaakt, dat de juiste inoculatietechnieken worden toegepast en dat de aanwezigheid van ANA wordt gedetecteerd om er zeker van te zijn dat uw experimentele model functioneert. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.