Chronisch Salmonella Infected Muis Model

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een chronisch met salmonella geïnfecteerd muismodel. Dit wordt bereikt door eerst een salmonella-oplossing te bereiden. De tweede stap van de procedure is het toedienen van streptomycine via een sonde aan de muizen, gevolgd door salmonella of enkel streptomycine.

De derde stap van de procedure is het isoleren van salmonella uit de feces van muizen en het detecteren van een salmonellainfectie in de darm van de muis met behulp van BL chroma-platen. De laatste stap van de procedure is het observeren en registreren van de lichaamsmassa van de muis en het noteren van veranderingen in de vitaliteit na de salmonellainfectie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat een salmonellainfectie kan worden vastgesteld in de darm van muizen die via gavage met salmonella zijn behandeld.

Hoi, ik ben Michelle P uit het laboratorium van Dr. Johnson van de afdeling Geneeskunde aan de University of Rochester. Ik ben ook van het Sun Lab en ik ben Y van het Sun Lab. Vandaag laten we u een procedure zien voor het opzetten van een Alytic Lennar-geïnfecteerd massamodel.

Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om signaaltransductie bij interacties tussen gastheer en bacteriën en tumorigenese te bestuderen. Laten we beginnen. Bereid vóór de experimenten voldoende Luria-Bertani- of LB-bouillonplaten voor voor elke Salmonella-stam die gedurende het experiment wordt gebruikt.

De platen kunnen worden gekoeld en gedurende enkele maanden worden bewaard. Bereid vervolgens de salmonellacultuur. Haal een vial met stock-salmonella die is ingevroren bij minus 80 degrees Celsius uit de vriezer en laat deze ontdooien op het aanrecht om de salmonella uit te platen.

Verhit een inoculatieoef in een Bunsenbrander en dip deze in de ontdooide bacteriële stok. Beweeg de lus in een zigzagpatroon heen en weer over het bovenste derde deel van de LB-plaat. Verhit de lus opnieuw en roteer de plaat.

Beweeg de loot in een zigzagpatroon over de voorgaande strepen om de bacteriën over het tweede derde deel van de plaat te verspreiden. Herhaal dit nogmaals. Vlam de loot opnieuw af.

Zorg dat de entlus niet in de agar dringt. Laat de kolonies groeien door de platen gedurende één nacht in een incubator bij 37 °C te bewaren. Bij een correcte uitvoering moet de salmonella-plaat in ten minste één sectie individuele kolonies vertonen.

De volgende dag. Selecteer een kloon van de LB-plaat met een steriel tandenstoker of een bacteriële lus en breng deze over in zeven milliliter LB in een buis van 12 milliliter. Schud de buis gedurende ongeveer vijf uur bij 37 °C.

Gebruik 0,05 milliliters van deze cultuur voor inoculatie van 50 milliliters LB in een Falcon-buis. Incubeer gedurende ongeveer 18 uur bij 37 graden Celsius zonder schudden.

Centrifugeer de overnight-bacteriecultuur van 50 milliliter bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 5.000 RPM en verwijder het supernatant. Voeg vervolgens 1,5 milliliter Hank's gebufferde zoutoplossing of HBSS toe aan de buis om de bacteriën te resuspenderen, oftewel een verhouding van 100 delen LB tegenover drie delen HBSS. Breng daarna het totale volume aan met HBSS aan tot 15 milliliter, oftewel een verhouding van 1 op 10 LB ten opzichte van HBSS.

Elke muis vereist 100 µL verdunde salmonellacultuur, of tussen 1 × 10⁶ en 1 × 10⁸ colony forming units vóór aanvang van de gavage; onttrek vier uur vóór het experiment water en voedsel aan de muizen. Bereid vervolgens direct vóór de gavage een streptomycine-oplossing door 7,5 mg streptomycinepoeder te verdunnen in 100 µL HBSS. Zorg ervoor dat er voor elke geïnjecteerde muis een extra volume wordt bereid om rekening te houden met verlies vóór de gavage bij de muis.

Bereid eerst een voedingsnaald voor met 100 µL streptomycine-oplossing. Haal de eerste muis uit de kooi voor de gavage en houd de muis met de kop richting het werkblad. Pak de huid over de schouder van de muis stevig vast met de duim en middelvinger, en strek de kop en nek met de wijsvinger om de slokdarm recht te maken.

Richt de bolvormige punt van de voedingsnaald langs het gehemelte en naar de rechterkant van de achterzijde van de farynx. Voer de naald vervolgens voorzichtig door naar de slokdarm en injecteer de 100 µL streptomycine-oplossing. Er mag geen weerstand gevoeld worden.

Herhaal dit proces voor alle experimentele en controlemuizen die aan het experiment deelnemen. Ongeveer 20 uur na de strp de m en gavage, en vier uur vóór de salmonella-gavage, wordt het water en voer weggenomen bij de muizen die oraal een salmonella-gavage zullen ontvangen. Dien bij elke muis op dezelfde wijze als voorheen een gavage toe, gebruikmakend van 100 µL salmonella-oplossing in HBSS.

Plaats na de gavage elke muis in een nieuwe kooi om te beginnen met de verzameling van feces. Verwijder vanaf ongeveer acht uur na de gavage de ontlasting onmiddellijk na het uitscheiden uit de kooi. Verzamel 100 milligrams muisontlasting als experimenteel monster.

Verzamel dagelijks of wekelijks monsters, afhankelijk van de studieduur, voor de analyse van salmonella in fecaliën. Overbreng het fecale monster naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met één milliliter PBS, vortex krachtig en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 800 RPM. Overbreng de supernatant naar een schone buis van 1,5 milliliter en centrifugeer bij 6.000 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en voeg 200 µL PBS toe aan de pellets; vortex om te resuspenderen. Detecteer vervolgens salmonella met een BB l roag-plaat. Gebruik 10 tot 100 µL van de fecesoplossing per plaat en verspreid dit op de plaat zoals weergegeven in sectie twee.

De salmonellasoorten vertonen een paarse kleur vanwege metabole verschillen in de aanwezigheid van geselecteerde chromogenen. Tel de salmonellakolonies op de plaat om het infectieniveau tussen individuele muizen te vergelijken. In deze experimentele procedure hebben we gebruikgemaakt van specifieke pathogeenvrije vrouwelijke C 57 black six muizen die zes tot zeven weken oud waren.

Muizen werden geïnfecteerd met salmonella en streptomycine plus HBSS. De controlemuizen kregen via een sonde enkel streptomycine. De gebruikte salmonellastammen omvatten de salmonella typhimurium wildtype-stam, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, een niet-pathogene salmonellamutantstam en drie FPC-stammen uit het laboratorium van Dr. James Madera die het virulentie-geassocieerde AAV R age-gen dragen in PSKW 29, een low-copy plasmide. Met dit protocol kan de kolonisatie van salmonella tyrian in de darm van de muis worden gedetecteerd.

Chronische salmonellainfectie werd gemeten via analyse van de feces en er werden monsters van het lichaamsgewicht en het darmweefsel verzameld voor immunofluorescentiekleuring. Gewoonlijk treden gewichtsverlies en sterfte op binnen vier weken na infectie. De overlevingspercentages vier weken na infectie worden hier weergegeven.

Zodra de muizen de eerste vier weken na infectie overleven, komen zij aan in lichaamsgewicht en neemt het aantal sterfgevallen af gedurende de resterende 23 weken. Over het algemeen kunnen meer dan 65% van de muizen die geïnfecteerd zijn met salmonellastammen, FSY fsy, A VRA null of fsy. A VRA heterozygoot, meer dan zes maanden overleven met een persistente salmonellainfectie in de darmen.

Na de acute infectie droegen de overlevers nog steeds salmonella bij zich, wat zes maanden na de infectie kon worden aangetoond met de methode die in dit protocol wordt beschreven. Immunofluorescentie-analyse van weefselmonsters uit de muizenintestijn laat de invasie van salmonella in het darmslijmvlies zien op 27 weken na de infectie. In deze afbeelding zijn de kernen blauw gekleurd en de salmonella-infecties worden in het groen weergegeven.

Zoals in de controlegroep te zien is, is er geen heldergroene kleuring aanwezig, wat duidt op de afwezigheid van salmonellakolonisatie. Daarentegen is er bij de met salmonella geïnfecteerde muizen 27 weken na infectie wel heldergroene kleuring zichtbaar in het darmslijmvlies. Dit toont de persistentie van de salmonellainfectie aan bij de met streptomycine voorbehandelde muis.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe een chronische infectie kan worden geïnduceerd in het muismodel. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kweek vers moet worden voorbereid voor de inoculatie, dat de juiste inoculatietechnieken worden toegepast en dat de aanwezigheid van ANA wordt aangetoond om er zeker van te zijn dat uw experimentele model correct functioneert. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.