Name: Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer de bloemen-dip methode voor Agrobacterium-transformatie van Arabidopsis thaliana. Dit protocol toont hoe je een GUS-reportergen introduceert en expressie detecteert in transgene zaailingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Chunxin Wang voor de bouw van pTSO2:: GUS en voor de foto&#39;s in figuur 1, Detlef Weigel voor het delen van de GUS-waterdicht protocol, Paja Sijacic, en Courtney Hollender voor nuttige commentaar. Onderzoek in het laboratorium Z. L s wordt ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (IOB0616096 en MCB0744752). ZL wordt gedeeltelijk ondersteund door de Universiteit van Maryland Agricultural Experiment Station.

I. Bloemen-dip transformatie van Arabidopsis thaliana <ol><li> Ongeveer een maand voorafgaand aan de transformatie, zaaien Arabidopsis zaden op 4-8 potten (5 inch vierkante potten) met circa 10-15 planten per pot. Voor installaties met een normale vruchtbaarheid, zal vier potten van planten per plasmideconstruct voldoende zijn. Als men aan mutant Arabidopsis te transformeren met een verminderde vruchtbaarheid, toename van het aantal potten dienovereenkomstig. </li><li> De planten worden geteeld onder standaard condities (16 uur licht en 8 uur donker bij 22 ° C). Als planten worden geteeld onder korter dag of lagere temperatuur, zullen ze meer tijd nodig om te bloeien en langer om klaar te zijn voor transformatie. Een goede plant zorg zal zorgen voor een gezonde planten, die essentieel zijn voor succesvolle transformatie. </li><li> Als de planten zijn net geschroefd en begonnen te bloeien. Ze zijn nu klaar voor de transformatie. Ter verhoging van efficiëntie van de omzetting, 3-4 dagen voor de transformatie, trim uit de belangrijkste bloeiwijze scheuten zodra ze met bouten aan meer secundaire schieten oprichting te bevorderen. Water de planten op de dag voor transformatie. Dit zorgt ervoor dat de grond niet zal genieten van al te veel infiltratie van de media tijdens de bloemen-dompelen. </li><li> Twee dagen voorafgaand aan de transformatie, enten 40ml LB met de juiste antibiotica (in het geval van pTSO2:: GUS, 50 ug / ml kanamycine) met Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 het dragen van de pTSO2:: GUS bouwen. De pTSO2:: GUS is gekloneerd in de vector die pBIN20 NPTII gen dat resistentie verleent tegen kanamycine 3 bezit. Grow 's nachts in een incubator te schudden bij 28-30 ° C. </li><li> De volgende dag, overdracht 8 ml van de overnacht cultuur in 400 ml van LB met 50 ug / ml kanamycine. Grow 's nachts in een incubator te schudden bij 28-30 ° C. </li><li> Op de dag van transformatie, toen de OD 600 van de Agrobacterium cultuur ongeveer 0,8 (OD 600 tussen 0,5 tot1 zijn acceptabel) bereikt, spin down van de Agrobacterium 's nachts cultuur op gedurende 8 minuten bij 5000rpm. </li><li> Resuspendeer de Agrobacterium pellet in een L (liter) van infiltratie media (10mm MgCl 2, 5% sacharose, 0.44mM 6-benzyladenine (BA), 0,3% silwet L-77, 1x Gamborg s vitamine oplossing en geautoclaveerd water). Het medium hoeft niet te worden geautoclaveerd, maar moet worden gemaakt vers zijn. Giet de 1 L Agrobacterium-bevattend medium infiltratie in een schaal (zoals 8 "x15" x2 "Pyrex glazen schaal). </li><li> Keer de pot (planten zullen niet vallen) en alle bovengrondse delen van de planten in de infiltratie-oplossing dip, houdt u gedurende 5 minuten een pot per keer. Terwijl alle bovengrondse delen van de plant zijn ondergedompeld in de infiltratie medium, vermijden dat grond te dringen tot een van de infiltratie media om kans op schimmelgroei te verminderen op de bodem. </li><li> Na het dompelen, plaats alle gedompeld potten op hun kant op meerdere lagen papier handdoek in een lade. De papieren handdoeken genieten van toegang hoeveelheid infiltratie media. Dek de bak af met plasticfolie om te hoge luchtvochtigheid zorgen. Plaats de lade weer in de groei van planten kamer. </li><li> Op de volgende dagen, rechtop verwijder het plastic omhulsel en papieren handdoekjes, en plaats potten. Niet water deze planten voor vier tot vijf dagen. Daarna, normaal onderhoud van de planten tot ze set zaden en het verzamelen van zaden in bulk. </li><li> Giet platen (150x15mm petrischaal) met MS medium dat 50 ug / ml kanamycine (gewicht 2.2g Murashige en Skoog basale zout zonder vitamine, los op in 500 ml water, pH op 5,8 met 1M NaOH, voeg 4 gram agar, autoclaaf, koel en Voeg Kanamycine tot 50 ug / ml uiteindelijke concentratie). Platen zijn bewaard in 4 ° C totdat het nodig is. </li><li> Te selecteren voor de antibiotica-resistente transgene planten, moet men tot 20.000 zaden scherm minimum. 0,1 gram is ongeveer 5000 zaden. Gewicht en een schatting van de hoeveelheid zaden. </li><li> Steriliseren zaden door was ze in 15 ml Falcon buis met 70% ethanol gedurende 30 seconden. Was de zaden met steriel water een keer. Week de zaden voor 30 seconden in een oplossing die 1:10 verdunning van de winkel koopt 5% bleekmiddel (Clorox). Spoel zaden met steriel water drie tot zes keer. In steriele kap, pipet ongeveer 5000 zaden op elke MS (Kanamycine) plaat, verspreid de zaden gelijkmatig over de plaat, afdichting van de platen met Micropore 3M tape om besmetting te voorkomen. </li><li> Incubeer de platen bij 4 ° C in het donker voor 3-4 dagen, vervolgens over de platen op een kamer (kan dezelfde plantengroei kamer zijn). Na ongeveer 14 dagen, transgene zaailingen blijven groen, maar de niet-transgene die draaien bleek en sterven. Breng de transgene zaailingen aan de bodem door het vertragen van het trekken van de wortels uit de medium en plaatste ze in de bodem. </li></ol> II. Het onderzoeken van pTSO2:: GUS expressie patronen <ol><li> Oogst pTSO2:: GUS transgene zaailingen en leg ze in koud 90% aceton in een glazen scintillatieflesje of microfugebuizen buizendie worden bewaard op ijs. Polystyreen microtiterplaten (niet polypropyleen) kan ook worden gebruikt als een analyseert een groot aantal monsters. </li><li> Nadat alle monsters worden geoogst, plaatst u de flacons bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Gedurende deze tijd maken verse vlekken buffer zonder x-Gluc (0,2% Triton x-100, 50 mM NaHPO 4 Buffer pH7.2, 2mm kaliumferrocyanide, 2mm kaliumferricyanide) en leg ze op ijs. </li><li> Verwijder aceton van de monsters en voeg de vlekken buffer. </li><li> Make-up x-Gluc kleuroplossing (0,2% Triton x-100, 50 mM NaHPO 4 Buffer pH7.2, 2mm kaliumferrocyanide, 2mm kaliumferricyanide, 2mm x-Gluc). Haal de vlekken buffer van de monsters en voeg de vlekken buffer met x-Gluc om de monsters. </li><li> Infiltreren in de monsters onder vacuüm gedurende 15 tot 20 minuten. Langzaam los van de stofzuiger en controleer of alle monsters zinken onder de oppervlakte van de kleuroplossing. Indien nodig, herhaal infiltratie totdat alle monsters zinken nadat het vacuüm wordt losgelaten. </li><li> Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende de nacht in de kleuring buffer met x-Gluc. </li><li> Verwijder de monsters van incubator en verwijder vlekken buffer. Was de monsters in opeenvolgende series ethanol (20%, 35% en 50% ethanol) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten elke wijziging. </li><li> Bevestig de weefsels in FAA fixatief (50% ethanol, 5% Formaldehyde, 10% azijnzuur, rest water) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de FAA en voeg 70% ethanol. Op dit punt de weefsels kunnen worden gevisualiseerd en gefotografeerd onder een dissectiemicroscoop uitgerust met een digitale camera. Een donkere blauwe kleur geeft aan waar TSO2 wordt uitgedrukt (figuur 1). Als alternatief kunnen de weefsels worden opgeslagen bij 4 ° C om later te bekijken. <img src="/files/ftp_upload/1952/1952fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 pTSO2:.: GUS-expressie in transgene zaailingen (A), laterale wortels (B), en wortel tip (C). Merk op dat TSO2 promotor is zeer actief bij jonge en delende weefsels. De sporadische expressiepatroon getoond in (C) is typerend voor genen die tot expressie in bepaalde fasen van de celcyclus. </li></ol> Representatieve resultaten Wanneer correct gedaan, moet transformatie-efficiëntie ongeveer 0,1-0,2%. In een ander woord, moet men krijgen 50-10 transgene zaailingen door het screenen van elke 5000 zaden. Gemiddeld, kan ongeveer 100 transgene lijnen worden verkregen door het transformeren van 4 potten van in het wild-type planten. Voor transgene zaailingen met de pTSO2:: GUS construct 3, donker blauwe kleur weerspiegelt GUS activiteit is te vinden in actief delende cellen ook jonge blaadjes, schieten apex, wortel tip, en de laterale wortel primordia (figuur 1). De niet-uniforme sporadisch patroon is kenmerkend voor fase van de celcyclus-specifieke expressie.

<ol><li>Clough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+agrobacterium-mediated+germ+line+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation.</a> Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).</li>
<li>Wang, C., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ribonucleotide+reductases+are+critical+for+cell+cycle+progression%2C+DNA+damage+repair%2C+and+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development.</a> Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).</li>
</ol>

De efficiëntie van de transformatie wordt bepaald door veel verschillende factoren, die hierna worden besproken: <ol><li> De gezondheid van de planten en hun leeftijd zijn van primair belang. Ongeveer een maand oude planten produceren van tal van onvolwassen bloemen knoppen zijn ideaal. Knippen uit primaire scheuten naar secundair scheutvorming 3-4 dagen aan te moedigen voor de transformatie zal toenemen transformatie-efficiëntie. Oudere planten zullen aanleiding geven tot transformanten, maar tegen een lager tarief...

<table><tbody><tr><td>6-benzyladenine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>852430</td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>Crompton Corp.</td><td></td><td>Toxisch, draag handschoenen</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal medium (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s vitaminenoplossing 1000X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl &amp;#946;-D-glucuronide cyclohexaminezout</td><td>Biosynth International, Inc</td><td>B-7300</td><td>Toxisch, lichtgevoelig, donker bewaren</td></tr><tr><td>Micropore 3M Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>19027761</td><td></td></tr></tbody></table>

bloemen-dip transformatie van arabidopsis thaliana om te onderzoeken ptso2:: β-glucuronidase reporter gene expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

De mogelijkheid om vreemde genen te introduceren in een organisme is de basis voor de moderne biologie en biotechnologie. In het model bloeiende plant<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, De bloemen-dip transformatie methode<sup&gt; 1-2</sup&gt; Heeft vervangen alle voorgaande methoden vanwege zijn eenvoud, efficiëntie en lage kosten. In het bijzonder, scheuten van jonge bloeiende<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Planten worden gedompeld in een oplossing van<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; Uitvoering van specifieke plasmide constructen. Na het dompelen worden de planten weer een normale groei en zaaigoed, een klein percentage van die getransformeerd met het vreemde gen en kan worden geselecteerd voor medium met antibiotica. Deze bloemen-dip-methode aanzienlijk vergemakkelijkt<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Onderzoek en in hoge mate bijgedragen aan ons begrip van de plant genfunctie. In deze studie hebben we gebruik maken van de bloemen-dip methode om een ​​reportergen te transformeren,<em&gt; Β-glucuronidase (GUS)</em&gt;, Onder de controle van<em&gt; TSO2</em&gt; Promotor.<em&gt; TSO2</em&gt;, Dat codeert voor het ribonucleotidereductasesysteem (RNR) kleine subeenheid<sup&gt; 3</sup&gt;, Is een celcyclus gereguleerd gen dat essentieel is voor dNDP biosynthese in de S-fase van de celcyclus. Onderzoek van<em&gt; GUS</em&gt; Expressie in transgene<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Zaailingen toont aan dat<em&gt; TSO2</em&gt; Wordt uitgedrukt in actief delende weefsels. De gerapporteerde experimentele methode en materialen kunnen gemakkelijk worden aangepast, niet alleen voor onderzoek, maar ook voor het onderwijs op de middelbare school en universiteit niveaus.

Dit artikel illustreert de bloemen-dip methode van<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt;-Gemedieerde transformatie van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;. Door de introductie van een cel-cyclus gereguleerde promotor-reporter,<em&gt; PTSO2:: β-glucuronidase (GUS)</em&gt;, In<em&gt; Arabidopsis</em&gt;, We zien hoe een verslaggever GUS expressie in transgene zaailingen detecteert.

Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression

Het vermogen om vreemde genen in een organisme te introduceren vormt de basis voor de moderne biologie en biotechnologie. In de modelbloeiplant Arabidopsis ...

Floral dipping wordt gebruikt om arabidopsis-planten te transformeren met een reporterconstruct. De resulterende transgene planten worden vervolgens onderzocht op de expressie van het reportergen. Eerst worden jonge, bloeiende arabidopsis-planten gedoopt in een oplossing van agrobacterium tumefaciens die het reporterconstruct bevat.Vervolgens worden de planten teruggebracht naar hun normale groeiomstandigheden totdat ze zaden produceren, waarvan een klein percentage getransformeerd zal zijn met het vreemde gen. De derde stap van de procedure is het verzamelen van de zaden van de planten en het zaaien ervan op een selectiemedium dat antibiotica bevat. Tot slot worden de zaailingen die op het selectiemedium met antibiotica groeien, onderzocht.Transgene zaailingen die het vreemde gen bevatten zijn resistent tegen de antibiotica en blijven in leven, terwijl de niet-transgene zaailingen uiteindelijk wit worden en afsterven. De expressie van het reportergen in de transgene zaailingen wordt waargenomen door de transgene zaailingen te kleuren met het substraat van het reportergen en de cellen en weefsels onder een dissectiemicroscoop te observeren. Hallo, ik ben Chloe Mara uit het laborato

floral-dip-transformation-arabidopsis-thaliana-to-examine-ptso2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Dit werk beschrijft een nieuwe werkwijze voor het selectief richten subcellulaire organellen in planten, bepaald met de BioRad Gene Gun.

Voorbijgaande Gene Expression Tobacco gebruik Gibson Vergadering en de Gene Gun

De circadiane klok regelt ongeveer een derde van de Arabidopsis transcriptoom, maar het percentage van genen die te gebruiken bij tijdwaarneming blijft onbekend. Hier visualiseren we een methode om circadiane fenotypes snel te beoordelen in welke mutant lijn van Arabidopsis met behulp van lichtgevende beeldvorming van een circadiaan reporter tijdelijk tot expressie gebracht in protoplasten.

Snelle analyse van het circadiaans fenotypes in Arabidopsis protoplasten getransfecteerd met een Lichtgevende klok Reporter

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.

Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Hier presenteren we een protocol voor de zeer efficiënte productie van transgene sojabonenharige wortels.

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Leer de bloemen-dip methode voor Agrobacterium-transformatie van Arabidopsis thaliana. Dit protocol toont hoe je een GUS-reportergen introduceert en expressie detecteert in transgene zaailingen.

Bloemen-dip Transformatie van Arabidopsis thaliana Om te onderzoeken PTSO2:: β-glucuronidase Reporter Gene Expression

Meer video's verkennen