Name: Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Leer de selectie van RNA-aptameren voor amyloïde β-eiwit met behulp van in-vitro-evolutiemethoden. Deze techniek biedt mogelijkheden voor diagnostische en therapeutische toepassingen bij de ziekte van Alzheimer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies AG030709 van NIH / NIA en 07-65798 van het California Department of Public Health. Wij erkennen Margaret M. Condron voor peptide synthese en aminozuur analyse, dr. Elizabeth F. Neufeld voor het helpen en ondersteunen van de eerste stappen van het project, Dr Chi-Hong Chen B. voor het verlenen van steun en reagentia, en Dr Andrew D . Ellington voor nuttige discussies.

<ol><li>Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diagnostics+and+therapeutics+for+Alzheimer%27s+disease-how+early+can+we+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Neurother%22%5BJournal%5D)">Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there.</a> Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).</li>
<li>Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+early+detection+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the early detection of Alzheimer's disease.</a> Nat. Med. 10, S34-S41 (2004).</li>
<li>Kawas, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+practice.+Early+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical practice. Early Alzheimer's disease.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1056-1063 (2003).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+%CE%B2-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid β-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+shifts+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%3A+the+emerging+role+of+oligomeric+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Paradigm shifts in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders: the emerging role of oligomeric assemblies.</a> J. Neurosci. Res. 69, 567-577 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Shanmugam, A., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+of+pre-fibrillar+protein+assemblies+in+Alzheimer%27s+disease+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Alzheimer+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships of pre-fibrillar protein assemblies in Alzheimer's disease and related disorders.</a> Curr. Alzheimer Res. 5, 319-341 (2008).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clin. Chem. 45, 1628-1650 (1999).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4, 588-596 (2006).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Lee, J. F., Stovall, G. M., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamer+therapeutics+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aptamer therapeutics advance.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 282-289 (2006).</li>
<li>Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+specifically+interact+with+the+prion+protein+PrP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers specifically interact with the prion protein PrP.</a> J. Virol. 71, 8790-8797 (1997).</li>
<li>Bibby, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+novel+in+vitro+selection+technique+to+isolate+and+characterise+high+affinity+DNA+aptamers+binding+mammalian+prion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a novel in vitro selection technique to isolate and characterise high affinity DNA aptamers binding mammalian prion proteins.</a> J. Virol. Methods. 151, 107-115 (2008).</li>
<li>Rhie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+2%27-fluoro-RNA+aptamers+that+bind+preferentially+to+disease-associated+conformations+of+prion+protein+and+inhibit+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of 2'-fluoro-RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion protein and inhibit conversion.</a> J. Biol. Chem. 278, 39697-39705 (2003).</li>
<li>King, D. J., Safar, J. G., Legname, G., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioaptamer+interactions+with+prion+proteins%3A+sequence-specific+and+non-specific+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Thioaptamer interactions with prion proteins: sequence-specific and non-specific binding sites.</a> J. Mol. Biol. 369, 1001-1014 (2007).</li>
<li>Proske, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-protein-specific+aptamer+reduces+PrPSc+formation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation.</a> ChemBioChem. 3, 717-725 (2002).</li>
<li>Murakami, K., Nishikawa, F., Noda, K., Yokoyama, T., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-bovine+prion+protein+RNA+aptamer+containing+tandem+GGA+repeat+interacts+both+with+recombinant+bovine+prion+protein+and+its+%CE%B2+isoform+with+high+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Anti-bovine prion protein RNA aptamer containing tandem GGA repeat interacts both with recombinant bovine prion protein and its β isoform with high affinity.</a> Prion. 2, 73-80 (2008).</li>
<li>Luhrs, T., Zahn, R., Wuthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+formation+by+recombinant+full-length+prion+proteins+in+phospholipid+bicelle+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amyloid formation by recombinant full-length prion proteins in phospholipid bicelle solutions.</a> J. Mol. Biol. 357, 833-841 (2006).</li>
<li>Bunka, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+RNA+aptamers+specific+for+amyloid+fibril+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of RNA aptamers specific for amyloid fibril epitopes.</a> J. Biol. Chem. 282, 34500-34509 (2007).</li>
<li>Ylera, F., Lurz, R., Erdmann, V. A., Furste, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+RNA+aptamers+to+the+Alzheimer%27s+disease+amyloid+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selection of RNA aptamers to the Alzheimer's disease amyloid peptide.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 1583-1588 (2002).</li>
<li>Rahimi, F., Murakami, K., Summers, J. L., Chen, C. H., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+generated+against+oligomeric+A%CE%B240+recognize+common+amyloid+aptatopes+with+low+specificity+but+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers generated against oligomeric Aβ40 recognize common amyloid aptatopes with low specificity but high sensitivity.</a> PLoS ONE. 4, e7694-e7694 (2009).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins+%28PICUP%29+applied+to+amyloidogenic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP) applied to amyloidogenic peptides.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers-what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers-what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Chen, C. H., Chernis, G. A., Hoang, V. Q., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heregulin+signaling+by+an+aptamer+that+preferentially+binds+to+the+oligomeric+form+of+human+epidermal+growth+factor+receptor-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heregulin signaling by an aptamer that preferentially binds to the oligomeric form of human epidermal growth factor receptor-3.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 9226-9231 (2003).</li>
<li>Adams, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+DS+%22Lab+math%3A+a+handbook+of+measurements%2C+calculations%2C+and+other+quantitative+skills+for+use+at+the+bench%22">Lab math: a handbook of measurements, calculations, and other quantitative skills for use at the bench</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+developed+for+SELEX%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Methods developed for SELEX.</a> Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182 (2007).</li>
<li>Takahashi, T., Tada, K., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+aptamers+selected+against+amyloid+%CE%B2-peptide+%28A%CE%B2%29+inhibit+the+aggregation+of+A%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">RNA aptamers selected against amyloid β-peptide (Aβ) inhibit the aggregation of Aβ.</a> Mol. Biosyst. 5, 986-991 (2009).</li>
</ol>

Het uitgangspunt van het SELEX proces is de synthese van een willekeurige oligonucleotide bibliotheek meestal met daarin 10 12 -10 15 sequenties. In DNA SELEX, deze bibliotheek direct wordt gebruikt na een ssDNA pool wordt gegenereerd, terwijl in RNA SELEX, toonde hier, is het ssDNA bibliotheek eerst omgezet in een RNA-pool enzymatisch door in-vitro transcriptie. Vervolgens wordt SELEX iteratief uitgevoerd, waarbij elke cyclus bestaat uit de belichting en binding van oligonucleotiden aan h...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946;40</td><td>UCLA Biopolymerlaboratorium</td><td></td><td>Gevriesdroogd poeder</td></tr><tr><td>MX5 Automated-S Microbalance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>met silicium gecoate buisjes van 1,6 ml</td><td>Denville Scientific</td><td>C19033 of C19035</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP)</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Gebruik in een zuurkast.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Vortex tot de oplossing helder is. APS wordt elke keer vers bereid en dient binnen 48 uur te worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II)hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Vortex tot de oplossing helder is. Bedek de RuBpy-buis met folie om het reagens te beschermen tegen omgevingslicht. RuBpy wordt elke keer vers bereid en moet binnen 48 uur worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Dithiothreïtol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>D-Zout&amp;#8482; Excellulose&amp;#8482; ontzoutingskolommen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20449</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>met silicium gecoate buisjes van 0,6 ml</td><td>Denville Scientific</td><td>C19063</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine-gels (10&amp;#8211;20%)</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td>10-well; mini formaat (8 cm X 8 cm); 25 &amp;#x03BC;laadvolume per put; scheidingsbereik 5 kDa tot 40 kDa</td></tr><tr><td>Kwarts cuvette</td><td>Hellma</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr><tr><td>Beckman DU 640 spectrophotometer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ssDNA-bibliotheek</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Op maat besteld</td><td>De bibliotheek was zo ontworpen dat deze 49 willekeurige nucleotiden bevatte, geflankeerd door twee constante regio's met primerbindingsplaatsen en kloonplaatsen: 5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)&lt;sub&gt;49&lt;/sub&gt; 5'-G TCC GTT CGG GAT CCT-3'&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Taq DNA-polymerase</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71160</td><td>Recombinant &lt;em&gt;Thermus aquaticus&lt;/em&gt; DNA-polymerase geleverd met 10&amp;#215; PCR-buffer en een aparte buis met 25 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; voor routinematige PCR.</td></tr><tr><td>PCR-nucleotidemix, 10 mM oplossing</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77212</td><td>(elk 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP)</td></tr><tr><td>Forward primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Op maat besteld</td><td>5&amp;rsquo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Reverse primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Op maat besteld</td><td>5&amp;rsquo;-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Denville Scientific</td><td>Techne TC-312</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Conische, steriele 1,6-ml buisjes met dopjes voorzien van O-ringen</td><td>Denville Scientific</td><td>C19040-S</td><td></td></tr><tr><td>RiboMAX&amp;#8482; Systeem voor grootschalige RNA-productie&amp;#8211;T7</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td>De kit bevat: 120 &amp;#x03BC;Enzymenmengsel (RNA-polymerase, recombinant RNasin)&amp;#174; ribonucleaseremmer en recombinant anorganisch pyrofosfatase); 240 &amp;#x03BC;l transcriptiebuffer 5; 100 &amp;#x03BC;elk van de 4 rNTP's, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-vrije DNase, 1 U/&amp;#x03BC;l; 10 &amp;#x03BC;lineair controle-DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M natriumacetaat (pH 5,2); 1,25 ml nucleasevrij water</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-cytidine 5&amp;rsquo;-trifosfaat, 250 &amp;mu;Ci (9,25 MBq), </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>BLU008H250UC</td><td>Specifieke activiteit: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM tricine (pH 7,6)</td></tr><tr><td>Citraat-verzadigd fenol:chloroform:isoamylalcohol (125:24:1, pH 4,7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77619</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:isoamylalcohol (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Absoluut ethanol voor moleculaire biologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Z216-MK gekoelde microcentrifuge</td><td>Denville Scientific</td><td>C0216-MK</td><td></td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant&amp;#8482; G-50 microkolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>Verworven van Fisher Scientific (45-001-487)</td><td>Vooraf gevuld met Sephadex&amp;#8482; G-50 DNA Grade en vooraf geëquilibreerd in STE-buffer met 0,15% Kathon als biocide</td></tr><tr><td>Triathler benchtop-scintillatieteller</td><td>Hidex Oy, Turku, Finland</td><td>Triathler LSC Model: 425-034</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-ureum monsterbuffer (2&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-Urea-gels 1,0 mm, 10 putjes</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex&amp;#174; TBE-runbuffer (5x)&amp;#215;)</td><td>Invitrogen</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>Radioactiviteitsdecontaminatiemiddel</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-67</td><td></td></tr><tr><td>Tips voor het laden van gels</td><td>Denville Scientific</td><td>P3080</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;em&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-cel</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>XCell &lt;Elektronenmicroscopie&gt;SureLock&lt;/em&gt; Mini-cel</td></tr><tr><td>Autoradiografische film</td><td>Denville Scientific</td><td>E3018</td><td>Gebruik in volledige duisternis</td></tr><tr><td>Autoradiografie-film, Hyperfilm&amp;#8482; ECL</td><td>Amersham</td><td>RPN3114K</td><td>Kan worden gebruikt onder rood veiligheidslicht.</td></tr><tr><td>Membraanschijfjes</td><td>EMD Millipore</td><td>GSWP02500</td><td>Gemengde cellulose-ester, hydrofiel, 0,22-&amp;#x03BC;m-disc membranen</td></tr><tr><td>Gefritte glazen ondersteuningsbodem voor 125-ml kolf</td><td>VWR international</td><td>26316-696</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Ureum</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC32738-0050</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>118430010</td><td></td></tr><tr><td>Glycogeen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol voor moleculaire biologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant RNase-remmer</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II&amp;#8482;Omgekeerd transcriptiesysteem</td><td>Promega Corp.</td><td>A3802</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant RNase-inhibitor</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>71571</td><td></td></tr><tr><td>RapidRun&amp;#8482; Laadkleurstof</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>77524</td><td></td></tr></tbody></table>

selectie van aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van alzheimer

Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve, leeftijd-afhankelijk, neurodegeneratieve aandoening met een verraderlijke cursus die maakt haar presymptomatische diagnose moeilijk 1. Definitieve diagnose AD wordt pas postmortem, dus tot oprichting van presymptomatische, vroege diagnose van AD is cruciaal voor het ontwikkelen en beheren van effectieve therapieën 2,3. Amyloid β-eiwit (Aß) staat centraal in AD pathogenese. Oplosbaar, oligomere Aß assemblages worden verondersteld om neurotoxiciteit onderliggende synaptische dysfunctie en neuronen verlies zullen beïnvloeden in AD 4,5. Verschillende vormen van oplosbare Aß vergaderingen zijn beschreven, echter, hun onderlinge relaties en de relevantie voor AD etiologie en pathogenese zijn complex en niet goed begrepen 6. De specifieke moleculaire herkenning instrumenten kan ontrafelen van de relaties tussen Aß assemblies en vergemakkelijken detectie en karakterisatie van deze vergaderingen vroeg in het ziekteverloop voordat de symptomen ontstaan. Moleculaire herkenning vertrouwt vaak op antilichamen. Echter, een andere klasse van moleculaire herkenning tools, aptameren, biedt belangrijke voordelen ten opzichte van antilichamen 7,8. Aptameren worden oligonucleotiden gegenereerd door in-vitro selectie: systematische ontwikkeling van liganden door de exponentiële verrijking (SELEX) 9,10. SELEX is een iteratief proces dat vergelijkbaar is met de evolutietheorie van Darwin maakt selectie, versterking, verrijking, en bestendiging van een onroerend goed, bijvoorbeeld, Avid, specifieke, ligand binding (aptameren) of katalytische activiteit (ribozymen en DNAzymes). Ondanks de opkomst van aptameren als hulpmiddelen in de moderne biotechnologie en de geneeskunde 11, zijn ze nog onvoldoende benut in het amyloid veld. Weinig RNA of ssDNA aptameren zijn geselecteerd tegen diverse vormen van prion-eiwitten (PrP) 12-16. Een RNA-aptameer gegenereerd tegen recombinant bovine PrP bleek de runder-PrP β 17 herkennen, een oplosbaar, oligomere, β-sheet-rijke conformationele variant van volledige lengte PrP dat amyloïd fibrillen 18 vormen. Aptameren gegenereerd met behulp van monomere en diverse vormen van fibrillair β 2-microglobuline (β 2 m) bleken fibrillen bepaalde andere amyloidogenic eiwitten binden naast β 2 m fibrillen 19. Ylera et al.. beschreven RNA aptameren geselecteerd op grond van geïmmobiliseerd monomere Aβ40 20. Onverwacht, deze aptameren gebonden fibrillair Aβ40. Al met al deze gegevens maken een aantal belangrijke vragen op. Waarom heeft aptameren geselecteerd op grond van monomere eiwitten herkennen hun polymere vormen? Zou aptameren tegen monomere en / of oligomere vormen van amyloidogenic eiwitten worden verkregen? Om deze vragen te beantwoorden, hebben we geprobeerd om aptameren te selecteren voor covalent-gestabiliseerd oligomere Aβ40 21 gegenereerd met behulp van foto-geïnduceerde verknoping van niet-gemodificeerde eiwitten (PICUP) 22,23. Net als bij eerdere bevindingen 17,19,20, deze aptameren reageerde met fibrillen van Aß en enkele andere amyloidogenic eiwitten waarschijnlijk het herkennen van een mogelijk gemeenschappelijke amyloid structurele aptatope 21. Hier presenteren we de SELEX methodologie die wordt gebruikt bij de productie van deze aptameren 21.

Aptameren zijn korte ribo-/deoxyribo-oligonucleotides geselecteerd door<em&gt; In-vitro</em&gt; Evolutie methoden op basis van affiniteit voor een specifieke doelgroep. Aptameren zijn moleculaire herkenning gereedschappen met veelzijdige therapeutische, diagnostische en wetenschappelijke toepassingen. Tonen we methoden voor de selectie van aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer.

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

De ziekte van Alzheimer (AD) is een progressieve, leeftijdsafhankelijke, neurodegeneratieve aandoening met een sluipend beloop, waardoor de presymptomatische diagnose ervan ...

Het algemene doel van selectie-experimenten is het selecteren van RNA-moleculen die specifiek en sterk binden aan een doeleiwit in RNA Selects. Dit wordt bereikt door RNA in vitro te transcriberen vanuit een bibliotheek van willekeurige DNA-oligonucleotiden, gevolgd door incubatie van de getranscribeerde RNA-pool met het doeleiwit. Als tweede stap wordt filterbinding toegepast.Hiermee worden de target-bindende RNA-moleculen gescheiden van de pool met ongebonden RNA. Vervolgens worden de target-bindende RNA-moleculen geïdentificeerd. Deze worden reverse getranscribeerd naar D-N-A, via P-C-R geamplificeerd en opnieuw getranscribeerd naar RNA.Deze RNA-pool, die nu verrijkt is met bepaalde bindende aptameren, wordt gebruikt voor binding aan het doelwit in de volgende selectiecyclus. Over het algemeen worden na acht tot 20 cycli zeer affiene, doelwitspecifieke aptameren geselecteerd en gekarakteriseerd. Hallo, ik ben Gal Bean van de afdeling neurologie aan UCLA, vandaag met Farah Rahimi.Een senior postdoc in mijn laboratorium zal een proces demonstreren dat cellex wordt genoemd. We hebben dit proces in het laboratorium gebruikt om abers voor amyloïde beta-oligomeren te selecteren. Laten

selection-aptamers-for-amyloid-protein-causative-agent-alzheimer-s

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, eiwit scheiding door SDS-PAGE, antigen retrieval en immunoblotting met een antilichaam tegen het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, wij consequent te sporen monomere en multimere Aß in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

Met behulp van atoomkrachtmicroscopie in combinatie met biopanning-technologie hebben we een negatief en positief biopanning-systeem gemaakt om antilichamen te verkrijgen tegen ziektespecifieke eiwitvarianten die aanwezig zijn in elk biologisch materiaal, zelfs bij lage concentraties. We zijn erin geslaagd om antilichamen te verkrijgen voor TDP-43-eiwitvarianten die betrokken zijn bij Amyotrofe Laterale Sclerose.

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Hoewel het transport van celoppervlak-eiwitten relatief gemakkelijk bestudeerd visualiseren van de handel in intracellulaire eiwitten is veel moeilijker. Hier gebruiken we constructen waarin activeerbare GFP en tonen een werkwijze om nauwkeurig volgen amyloïd precursor eiwit van het Golgi apparaat naar stroomafwaartse compartimenten en volg de klaring.

Beeldvorming van de intracellulaire mensenhandel van APP met fotoactiveerbare GFP

Om de effecten van Aβo in vivo te bestuderen, ontwikkelden we een model op basis van herhaalde hippocampische infusies van oplosbare Aβo gekoppeld aan continue infusie van Aβo-antilichaam (6E10) in de hippocampus met behulp van osmotische pompen om het neurotoxische effect van Aβo tegen te gaan.

Neurodegeneratie in een diermodel van chronische Amyloid-beta oligomeer infusie wordt tegengewerkt door antilichaambehandeling doordrongen osmotische pompen

Hierin beschrijven we een speciaal HPLC zuiveringsprotocol hoogzuivere amyloïde beta 42 (Aß42) en amyloïde beta 40 (Aβ40) peptiden, kunnen oligomeervorming oplevert. Amyloid beta is een zeer gevoelig aggregatie, hydrofoob peptide betrokken bij de ziekte van Alzheimer. De amyloidogenic aard van het peptide maakt de zuivering ervan een uitdaging.

Een op maat HPLC Zuivering Protocol dat zijn vruchten High-zuiverheid Amyloïd Beta 42 en Amyloid Beta 40 Peptiden, in staat oligomeervorming

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Aβ oligomeren van een synthetische peptide in vitro en relatieve hoeveelheid Aβ oligomeren evalueren door een stip bevlekken analyse.

A11-positieve β-amyloid oligomeren voorbereiding en de evaluatie met behulp van Dot bevlekken analyse

Moleculaire beeldvorming met laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie gebaseerde imaging massaspectrometrie (MALDI-IMS) kan de gelijktijdige koppeling van meerdere analyten in biologische monsters. Hier presenteren we een protocol voor de detectie en de visualisatie van amyloïde β eiwit op weefsels van de hersenen van Alzheimer en Cerebrale amyloïde angiopathie monsters met behulp van MALDI-IMS.

Visualisatie van amyloïde β-deposito's in de menselijke hersenen met Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging

Het huidige protocol beschrijft en vergelijkt de procedure om een volledige regio of subregio van belang analyse uit te voeren van sagittale muishersensecties om amyloïde-bètabelasting te kwantificeren in het APP / PS1 transgene muismodel van de ziekte van Alzheimer.

Volledige versus subregionale kwantificering van amyloïde-bètabelasting op hersensecties van muizen

Deze biochemische zuiveringsmethode met op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse vergemakkelijkt de robuuste karakterisering van amyloïde fibrilkernen, wat de identificatie van doelen voor het voorkomen van de ziekte van Alzheimer kan versnellen.

Biochemische zuivering en proteomische karakterisering van amyloïde fibrilkernen uit de hersenen

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Leer de selectie van RNA-aptameren voor amyloïde β-eiwit met behulp van in-vitro-evolutiemethoden. Deze techniek biedt mogelijkheden voor diagnostische en therapeutische toepassingen bij de ziekte van Alzheimer.

Selectie van Aptameren voor amyloid β-eiwit, de verwekker van de ziekte van Alzheimer

Meer video's verkennen