Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) test voor eiwit-eiwit interactie in Onion cellen met behulp van de Helios Gene Gun
12 juni 2010
Dit artikel illustreert hoe goed gebruik van de BioRad Helios Gene Gun om plasmide DNA te introduceren in ui epidermale cellen en hoe om te testen voor eiwit-eiwit interacties in ui cellen op basis van het principe van de Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC)
Deze procedure test in vivo eiwit-eiwit interactie tussen twee Arabidopsis transcriptieregulators, seus gespeld SEU, in het kort en lu homoloog of LUH. Door gebruik te maken van de biomoleculaire fluorescentiecomplementatie is seus gefuseerd met het eindterminalfragment van een geel fluorescent eiwit, of YFP en LUH is gefuseerd met het C-terminaalfragment van Y-F-P-D-N-A van de twee plasmideconstructies. Seuss, NYFP en L-U-H-C-Y-F-P worden gebombardeerd in uienepidermaal cellen om hun interactie te testen.
Een interactie tussen Seuss en LUH leidt tot de associatie van de eindterminal- en C-terminaalfragmenten van YFP in kernen, wat leidt tot YFP-fluorescentie in kernen. Na incubatie gedurende 16 tot 20 uur in het donker, worden de uienepidermale laagjes onder een fluorescentiemicroscoop waargenomen om fluorescentie te visualiseren. Hallo, ik ben Courtney Hollander van het laboratorium van Dr. Zhi Lu aan het Department of Cell Biology and Molecular Genetics aan de University of Maryland.
Vandaag laten we u een procedure zien voor het testen van eiwit-eiwit interactie in uiencellen met behulp van de BioRad Helios gene gun. We gebruiken deze procedure in ons lab voor het testen van eiwit-eiwit interacties en eiwit lokalisatie in plantencellen. Dus laten we beginnen.
Om deze procedure te beginnen, bereid cartridges voor de Helios gene gun voor volgens het Joe Video Protocol door Woods en Zeto 2008 dat in detail de cartridgevoorbereidingsprocedure voor elke voorbereiding van cartridges demonstreert. 50 microgram totaal plasma DNA worden gemengd met 12,5 milligram goudpartikels en 0,5 milligram per milliliter PVP-oplossing voor BIFC. Met dezelfde cartridgevoorbereiding worden de twee plasma DNA's van de putatieve interacterende eiwitten Seuss, gefuseerd met de N-terminale helft van YFP, afgekort seus, NYFP en LU Homoloog, gefuseerd met de C-terminale helft van YFP, afgekort L-U-H-C-Y-F-P.
De gecombineerde hoeveelheid is 50 microgram per voorbereiding, wat resulteert in maximaal 50 cartridges bij één microgram DNA per 0,25 milligram goud per cartridge. Elke cartridge is voor één schot. Na cartridgevoorbereiding, test de cartridges om te zien of de goudpartikels efficiënt worden voortgestuwd.
Wickel een vierkant stukje paraform rond een petrischaal. Stel vervolgens de heliumdruk in op tussen de 150 en 200 PSI en schiet de nieuw gemaakte cartridges in het paraform vierkant. Observeer zwakke goudpartikels op het parfum.
Verschillende hoeveelheden goudpartikels kunnen bij verschillende heliumdrukken op het parfum worden voortgestuwd. Echter, als er geen significant verschil is, kies dan de lagere druk voor het bombardement. Deze test geeft ook het gebied aan dat door elke schot wordt bedekt.
Om de uienweefsels voor te bereiden, trek de buitenste laag van een grote gele ui af met een schone en scherpe scheermesjes. Snijd een rechthoekig gebied van twee bij acht centimeter, vier tot vijf lagen diep. Neem het rechthoekige uienweefsel eruit en gooi de buitenste twee lagen weg.
Snij de resterende lagen van de ui in ongeveer 1,5 centimeter vierkante stukken. Plaats de uienstukken in een petrischaal met cirkels van drie mm filterpapier. Bevochtig met steriel water en bedek de petrischaal.
De uienstukken zijn klaar voor bombardement. Laad eerst de cartridges in de witte ronde cartridgehouders. Laad cartridges met verschillende plasmideconstructies in verschillende cartridgehouders. Elke cartridgehouder kan maximaal 12 cartridges voor 12 schoten bevatten.
Er zijn drie verschillende houders hier geladen. De eerste houder heeft cartridges met een sterk en constitutief promotor van het bloemkoolmozaïekvirus, 35 S-G-F-P-A. Dit plasmide dient als positieve controle.
De tweede houder is geladen met de experimentele cartridges met een gelijke hoeveelheid van S-E-U-N-Y-F-P en L-U-H-C-Y-F-P. De derde cartridgehouder is geladen met cartridges met een gelijke molare mix van de puck spine vector en LUH puck spice. Dit dient ook als negatieve controle.
Plaats de batterij en de verse looplijner in de Helios gene gun. Zorg ervoor dat zowel de looplijner als de pistool hun respectieve O-ringen hebben. Plaats vervolgens een lege cartridgehouder in de gene gun met het merknummer 12 op de cartridgehouder naar de bovenkant van het pistool gericht.
Schuif de cartridgehouder een of twee keer om te controleren of deze correct is ingebracht. Bevestig vervolgens het pistool aan de heliumtank en pas de druk aan tussen 150 en 200 PS.I. Draag gehoorbescherming en vuur het pistool een paar keer af door de zijknop ingedrukt te houden terwijl je de trekker overhaalt. Het afvuren van het pistool met de lege cartridgehouder reinigt de wapenkamer en zorgt ervoor dat de druk stabiel is.
Voordat je het DNA schiet, kan het schieten van een stuk ui hier een negatieve controle zijn voor achtergrondfluorescentie. Om de met DNA gecoate goudpartikels te schieten, verwijder de lege cartridgehouder en plaats de eerste geladen cartridgehouder met de positieve controle. Schuif de cartridgehouder zodat de cartridge die bedoeld is om af te vuren, op de onderkant van de cartridgehouder is gepositioneerd.
Plaats nu uienstukken in het midden van een lege petrischaal met de binnenste laag van de ui naar boven. Plaats de looplijner van het gene gun op de petrischaal en schiet het pistool af. Schuif naar de volgende cartridge en schiet een ander uienstuk.
Herhaal deze stap totdat vier tot vijf uienstukken zijn geschoten. Elk uienstuk wordt slechts één keer geschoten. Breng het gebombardeerde uienstuk over naar een petrischaal met vochtige drie mm filterpapier om de experimentele cartridges te schieten.
Verander naar cartridge Holden. Nummer twee, vergeet niet om de looplijner te vervangen om besmetting te voorkomen. Schiet vier tot vijf uienstukken zoals net getoond voor de positieve controle.
Verander vervolgens naar cartridge Holden. Nummer drie, bevat de negatieve controle DNA. En schiet opnieuw vier tot vijf uienstukken.
Verander de looplijner om besmetting te voorkomen. Na bombardement. Bedek de petrischalen met de uienstukken met deksels.
Wickel ze in met paraform om uitdrogen te voorkomen. In
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert het gebruik van de BioRad Helios Gene Gun voor het introduceren van plasmide-DNA in uiepidermaalcellen. Het beschrijft ook een methode voor het testen van eiwit-eiwitinteracties met behulp van Bimoleculaire Fluorescerende Complementatie (BiFC).
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Moleculaire genetica
- Plantenbiologie
Achtergrond
- Eiwit-eiwitinteracties zijn cruciaal voor het begrijpen van cellulaire processen.
- Bimoleculaire Fluorescerende Complementatie (BiFC) is een techniek die wordt gebruikt om deze interacties in vivo te bestuderen.
- Uiepidermaalcellen dienen als modelsysteem voor dergelijke studies.
- De BioRad Helios Gene Gun is een effectief hulpmiddel voor het leveren van plasmide-DNA in plantencellen.
Doel van de studie
- Om het gebruik van de BioRad Helios Gene Gun voor genlevering te illustreren.
- Om de BiFC-methode voor het detecteren van eiwitinteracties te demonstreren.
- Om een praktisch protocol te bieden voor onderzoekers in plantenmoleculaire biologie.
Gebruikte methoden
- Plasmidconstructies voor SEU en LUH werden gemaakt met YFP-fragmenten.
- Uiepidermaalcellen werden gebombardeerd met deze constructies met behulp van de Gene Gun.
- Cellen werden 16 tot 20 uur in het donker geïncubeerd.
- Fluorescentiemicroscopie werd gebruikt om YFP-fluorescentie in de kernen te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle introductie van plasmide-DNA in uicellen werd bereikt.
- YFP-fluorescentie gaf een eiwit-eiwitinteractie aan tussen SEU en LUH.
- Fluorescentie was gelokaliseerd in de kernen van de cellen.
- De methode bleek effectief voor het bestuderen van transcriptiefactorinteracties.
Conclusies
- De BioRad Helios Gene Gun is een betrouwbare methode voor genlevering in plantencellen.
- BiFC is een waardevolle techniek voor het visualiseren van eiwitinteracties in vivo.
- Deze studie biedt een raamwerk voor toekomstig onderzoek in plantenmoleculaire genetica.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction validation is a critical step in target de-risking for biopharma discovery pipelines. The BiFC assay in onion cells provides a rapid, visual readout for confirming intracellular interactions, supporting early hypothesis testing and mechanistic confidence. This approach enables scalable, low-background screening of transcription factor complexes relevant to disease pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of transcription factor interactions in living plant cells, supporting functional validation of putative targets.
- Operational Value: Utilizes onion epidermal cells as a reproducible, low-autofluorescence system for transient expression and interaction screening.
- Predictive Value: Nuclear-localized YFP signal confirms co-localization and interaction of SEU and LUH, providing mechanistic insight into transcriptional regulatory complexes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Plasmid DNA delivery via Helios Gene Gun allows standardized, high-efficiency transfection of onion epidermal cells for interaction testing.
- Quantitative Output: Fluorescence intensity and subcellular localization (nuclear vs. cytoplasmic) provide measurable readouts for interaction strength and specificity.
- Scalability: Multiple constructs (positive, experimental, negative controls) can be tested in parallel using separate cartridge holders, enabling comparative screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: While performed in a plant model, the assay framework supports conservation of interaction networks applicable to eukaryotic transcriptional regulation.
- Mechanistic De-risking: Observed nuclear YFP fluorescence upon co-bombardment of SEU-NYFP and LUH-CYFP validates intracellular interaction, reducing false-positive risk in target validation.
- Translational Continuity: The BiFC-Helios Gene Gun workflow establishes a reusable platform for testing protein interactions in semi-intact cellular environments.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC assay integrated with Helios Gene Gun bombardment fits within early discovery workflows, supporting target validation prior to lead identification and preclinical assessment.
- Discovery Biology: Tests intracellular protein-protein interactions in situ, clarifying whether putative partners co-localize and associate in a native-like cellular context.
- Screening: Enables standardized delivery of plasmid pairs via gene gun, ensuring reproducible transfection efficiency across biological replicates.
- Analytics: Nuclear YFP fluorescence serves as a quantitative, imaging-based readout for interaction confirmation, complementing biochemical assays.
- Translational Research: While using onion cells, the method supports conservation of interaction mechanisms relevant to human transcription factor networks.
- Enterprise Reuse: The Helios Gene Gun and BiFC protocol can be adapted across multiple protein pairs and plant-based expression systems for repeated use in discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides spatial and temporal resolution of protein interactions in living cells, reducing reliance on lysate-based assays that may miss transient or context-dependent associations.
- Operational Value: Combines transient expression with visual readout, enabling rapid iteration and optimization of construct design and delivery parameters.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions on target pairs by confirming intracellular interaction, thereby reducing investment in non-validated hypotheses.
- Portfolio Impact: Enables prioritization of transcription factor complexes with demonstrated nuclear co-interaction, improving risk-adjusted target selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to generate N- and C-terminal YFP fusion constructs.
- Dependent on Helios Gene Gun optimization, including helium pressure (150–200 PSI), gold particle preparation, and cartridge standardization.
- Necessitates fluorescence microscopy with appropriate YFP filter sets and controls for background signal from wounded cells or debris.
- Requires standardized incubation (16–20 hours in dark) to allow for protein expression, interaction, and fluorophore maturation.
- Limited by transfection efficiency; not all cells are transformed, necessitating population-level analysis and use of positive/negative controls for interpretation.
