Name: Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Leer de afleiding van trofoblast stamcellen uit muizenblastocysten voor placenta-onderzoek. Deze methode omvat isolatie, kweek op feederlagen en differentiatie-inductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Janet Rossant voor het oorspronkelijke protocol. Deze studie werd ondersteund door de National Institute of Health te verlenen CA106308 aan WH.

In dit protocol beschrijven we de voorbereiding van de muis blastocysten en de vestiging van TS cellijnen. Algemeen muis manipulaties voorafgaand aan het verzamelen van blastocysten, waaronder de instelling voor natuurlijke bevruchting en de inductie van de super ovulatie, in principe volgen de standaard protocol geïllustreerd door Nagy et al.. 2003 (pp146-150). Afleiding en het onderhoud van de TS-cellen <ol><li> Setup fokken kruising tussen muizen van belang. </li><li> Bereid je muis embryonale fibroblasten (MEF) als feeder cellen. Twee dagen vóór de verzameling van blastocysten, MEFs (2 x 10 6 cellen) worden uitgeplaat in 100 mm gerechten. De volgende dag worden deze cellen behandeld met 10 ml van TS medium dat mitomycine C (20 mg / ml) voor een 2 uur incubatie bij 37 ° C, 5% CO 2. Dit wordt gevolgd door wassen cellen tweemaal met PBS. De mitomycine C behandelde cellen worden vervolgens gezaaid in 12-well platen (1 x 10 5 cellen / well). </li><li> Op de dag van de blastocyst collectie (3,5 dpc, aangeduid als een dag), is MEF kweekmedium vervangen door TS medium plus 1x FGF4/Heparin (0,5 ml / putje). </li><li> De voorbereiding voor de inzameling van de baarmoeder: euthanaseren de muis en zoek de baarmoeder (figuur 1a). </li><li> Verwijder de baarmoeder door het vast te pakken met een pincet in de baarmoederhals (achter de blaas) en dwars door de kruising van de baarmoeder en baarmoederhals (Figuur 1B). Trek de baarmoeder, weg te trimmen het membraan-en vetweefsel en snijd de baarmoeder onder de kruising met de eileider (Figuur 1C). Plaats de baarmoeders (figuur 1D) in een klein volume (0,2 ml) van TS medium in een 60 mm plaat. </li><li> Spoel elke baarmoeder hoorn met 1 ml van TS medium met behulp van een 1-ml spuit met een 26-gauge naald. Steek de naald in de basis van de baarmoeder en spoel langzaam in een nieuwe 60 mm plaat met 1 ml TS medium. De baarmoeder moet worden opgeblazen en volledig uitgebreid tijdens het spoelen. </li><li> Verzamelen en zorgvuldig overdragen van de blastocysten in een schone 12 wells plaat met TS medium met behulp van een mond-gecontroleerde pipet. Was blastocysten drie keer door de seriële overdracht via TS medium in 12-well platen. Plaats een blastocyst per well (figuur 2A) in een 12-wells plaat met de mitomycine C-behandelde MEF feeders en cultuur bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> De blastocysten zullen luik van zona pellucida en hechten aan de putten in 24 tot 36 uur. Een kleine uitgroei zal gemakkelijk worden waargenomen op dag 3. Voer de culturen met 500 ul vers medium TS plus 1x FGF4/Heparin. </li><li> Op dag 4 of 5, moet de blastocyst uitgroei klaar voor disaggregatie afhankelijk van de grootte. De ideale grootte voor TS cel differentiatie wordt geïllustreerd in figuur 3B. Ze wast de culturen met 0,5 ml PBS. Voeg 100 ml 0,25% trypsine / EDTA en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2. Breek de uitgroei in kleine groepjes door en neer te pipetteren krachtig met een P100 pipetteman. Stop de behandeling met trypsine door het toevoegen van TS-70CM-1.5F4H (30% TS medium, 70% MEF-CM plus 1,5 x FGF4/Heparin) in de put. Verandering medium 8 uur na de uitsplitsing en blijven cellen te voeden om de 2 dagen. </li><li> Tussen dag 6 en 10 (zeer variabel) TS cel kolonies kunnen worden waargenomen. Ze hebben platte, epitheliale sheet zoals morfologie met een duidelijke begrenzing kolonie (figuur 2C). Ga verder naar de culturen voeden om de 2 dagen </li><li> Bij de TS-cellen 50% confluentie (meestal tussen dag 15 en 20) te bereiken, een keer wassen met PBS en voeg 100 ml 0,25% trypsine / EDTA. Pipet op en neer tijdens de behandeling met trypsine een bijna single-cell suspensie blijft. Stop de behandeling met trypsine door het toevoegen van TS-70CM-1.5F4H en transfer naar nieuwe 6-well of 60mm platen die de mitomycine C-behandelde MEF feeders (2,5 x 10 5 cells/6-well of 5 x 10 5 cells/60mm plaat). </li><li> Verandering medium 8 uur na de passage en blijven de culturen voeden om de 2 dagen. </li><li> Na een of twee meer passages (3-5 dagen tussen passages) op de MEF feeders, kan TS cellen worden gekweekt zonder hen. Omdat MEF hechten aan de cultuur plaat veel sneller dan TS-cellen na behandeling met trypsine, kan dergelijk verschil in de aanhanger tarief worden gebruikt om TS cellen te scheiden van de MEF feeders. Na het passeren van de gekweekte cellen, incubeer ze bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 30 minuten. De meeste MEF zal hechten aan de plaat en de TS bevolking blijft in suspensie. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe plaat. Herhaal dit proces voor een aantal passages van een pure TS bevolking te verkrijgen. </li><li> Behouden TS cellen in TS-70CM-1.5F4H en geef ze elke 4 dagen (1u10-01u20 split) of wanneer de cultuur in 70% confluentie. Het passeren van de cellen met hoge dichtheid (hoger dan 1:05 split) of kweken ze als overdreven samenvloeiing kunnen hun differentiatie veroorzaken. </li><li> De identiteit van de TS-cellen kan worden bevestigd door immunokleuring van een cel marker, CDX2 (figuur 3). </li></ol> Invriezen TS-cellen <ol><li> Bereid 2x bevriezing medium (50% FBS, 30% TS middelgrote en 20% DMSO). </li><li> Coafhalen TS-cellen door trypsinebehandeling, gevolgd door centrifugatie bij 450 g gedurende 6 minuten. Resuspendeer ze in TS medium met gelijk volume van 2x bevriezing medium. </li><li> Bevriezing van de cellen langzaam met behulp van een isopropylalcohol kamer bij -70 ° C en over te dragen aan vloeibare stikstof na 24-48 uur. </li><li> Een 60 mm plaat (70% confluent) wordt gewoonlijk in twee flesjes. </li></ol> Ontdooien TS-cellen <ol><li> Snel dooi de flacon in 37 ° C, te verzamelen in 10 ml TS media door middel van centrifugeren (450, 6 min), en resuspendeer in 30% TS media, 70CM-1.5F4H. </li><li> Een flacon van cellen is geënt in een 60 mm plaat. </li></ol> TS-cel differentiatie in TGC Differentiatie van TS cellen in trofoblast reusachtige cellen (TGCs) kan worden geïnduceerd door de terugtrekking van de MEF-CM, FGF4 en heparine. De TGC fenotype (grote kernen) kan worden gedetecteerd vier dagen na de inductie (Tanaka et al.., 1998 en Chiu et al.. 2008). Immunokleuring van p450scc detecteren de uitdrukking van dit TGC marker in de gedifferentieerde cultuur (Figuur 4A). Flowcytometrische analyse van de PI (propidiumjodide) gekleurde cellen toont verder de aanwezigheid van gedifferentieerde cellen met hogere DNA-inhoud (Figuur 4B). Deze resultaten suggereren dat TS cellen endoreduplicatie ondergaan te worden polyploïde TGCs. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Dissectie van de muis uteri. (A) Locatie van de uteri wordt aangegeven door pijlen. (B) dwars door de kruising van de baarmoeder en baarmoederhals, zoals afgebeeld. (C) Snij de baarmoeder net onder de eileider (OD) onder de eierstok (OV). (D) Afbeelding van de baarmoeders. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve foto's illustreren de muis blastocyst, blastocyst uitgroei en trofoblast kolonie. (A) Een muis blastocyst verzameld op E3.5 wordt weergegeven. ICM, binnenste celmassa, MT, muurschildering trophectoderm, PT, polaire trophectoderm. (B) Een trofoblast uitgroei op MEF feeders wordt weergegeven. TS, trofoblast stamcel. (C) A trofoblast stamcel kolonie toont een duidelijke voorsprong op MEF feeders. Pijlen geven de cel grens. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Identificatie van de TS cellen door immunokleuring analyse. TS (AD) en ES (controle, EH) cellen zijn afhankelijk van de marker identificatie. Cellen worden immunostained met antilichamen tegen Oct4 (A, E) of CDX2 (B, F) te herkennen en tegengekleurd door DAPI (C, G) gepresenteerd in samengevoegd beelden (D, H). Schaalbalk, 50 urn. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Differentiatie van TS cellen in vitro. (A) Ongedifferentieerde (Undiff) of gedifferentieerde (Diff) cellen in de cultuur werden onderzocht voor de expressie van een TGC marker, p450scc (groen), tegengekleurd met DAPI (rood). (B) Flowcytometrische analyse van de gedifferentieerde cellen, gekleurd met PI, meet de DNA-inhoud (M1, twee tot vier exemplaren, M2, meer dan vier exemplaren). De M2 bevolking vertegenwoordigt de polyploïde trofoblast cellen.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

In deze video, tonen we het proces om E3.5 blastocysten van baarmoeders en experimentele procedures verzamelen om TS cellijnen vast te stellen. We beschrijven ook de voorwaarde om de stemness van TS cellen te handhaven en hun differentiatie te induceren in de gedifferentieerde cellen. Twee cruciale stappen om pure TS cellijnen te verkrijgen zijn de timing voor de uitgroei disaggregatie (stap 9) en de verwerking van de eerste passage (stap 11). Het is gemeld dat de primitieve endoderm-afgeleide cellen kunnen voordoen in ...

Reagentia TS medium: RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM natrium pyruvaat, 100 mM beta-mercapto-ethanol en 100 mg / ml penicilline-streptomycine. Mitomycine C: Los 2 mg mitomycine C (Sigma M-0503) in 2 ml PBS en voeg deze 2 ml mengsel in 200 ml TS medium (10 ng / ml). Maak 20 aliquots (10 ml) en bewaar bij -20 ° C tot gebruik. Voeg een aliquot per 100 mm plaat. Muis embryonale fibroblast-conditie medium (MEF-CM): Plaat MEFs in 100 mm platen (1 x 10 6 / plaat). De volgende dag, voeg 10 ml TS medium per schotel en blijven tot cultuur voor 48 uur. Verzamel het kweekmedium, filteren (0,45 mm) en bewaar bij -20 ° C in 35 ml porties. Dooi elk aliquot wanneer dat nodig is, die kan worden opgeslagen bij 4 ° C. De MEF kan gebruikt worden om voor te bereiden op nog twee partijen CM voordat ze confluent. PBS / BSA: Los BSA, fractie V (Sigma A3311, 0,1% (w / v)) in PBS (10 ml), filter door middel van een 0,45 mm spuitfilter en maak 1 ml monsters in 1,5 ml buizen. Bewaren bij -70 ° C en dooi een tube als dat nodig is om FGF4 voor te bereiden. FGF4 (1000x): Resuspendeer gevriesdroogde FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) met 1 ml van het PBS / BSA-oplossing. Meng goed en 10 aliquots (100 ml) in 1,5 ml buizen en op te slaan maken bij -70 ° C. Dooi elke buis wanneer dat nodig is en bewaar de rest bij 4 ° C, niet opnieuw invriezen. Verdunnen 1000 keer in de TS middellange tot 1x FGF4 (25 ng / ml) te verkrijgen. Heparine (1000x): Resuspendeer heparine (Sigma H3149, 10.000 eenheden) in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml (1000x). Maak 100 ml tot 1,5 ml buisjes en bewaar bij -70 ° C. Dooi aliquots wanneer dat nodig is en bewaar de rest bij 4 ° C, niet opnieuw invriezen. Verdunnen 1000 keer in TS middellange tot 1x heparine (1 ng / ml) te verkrijgen.

afleiding van mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specificatie van de trophectoderm is een van de eerste differentiatie gebeurtenissen van zoogdieren ontwikkeling. De trofoblast lijn afkomstig van de trophectoderm bemiddelt implantatie en genereert de foetale deel van de placenta. Als gevolg hiervan, de ontwikkeling van deze lijn is van essentieel belang voor de overleving van embryo&#39;s. Afleiding van trofoblast stam (TS) cellen van muizen blastocysten werd voor het eerst beschreven door Tanaka<em&gt; Et al..</em&gt; 1998. Het vermogen van TS cellen aan de trofoblast specifieke eigenschap en hun expressie van het podium-en celtype-specifieke merkers te behouden na een goede stimulatie biedt een waardevol model systeem om trofoblast lineage ontwikkeling te onderzoeken, waarbij indient vroege placentatie evenementen. Verder trofoblast cellen zijn een van de weinige somatische celtypen ondergaat natuurlijke genoom versterking. Hoewel de moleculaire pathways onderliggende trofoblast polyploidization zijn begonnen te ontrafelen, de fysiologische rol en profiteer van trofoblast genoom versterking blijft grotendeels ongrijpbaar. De ontwikkeling van diploïde stamcellen in polyploïde trofoblast cellen in cultuur maakt dit<em&gt; Ex vivo</em&gt; Systeem een ​​uitstekend hulpmiddel voor het ophelderen van het reguleringsmechanisme van genoom replicatie en instabiliteit in gezondheid en ziekte. Hier beschrijven we een protocol op basis van eerdere rapporten met wijzigingen gepubliceerd in Chiu<em&gt; Et al..</em&gt; 2008.

In deze video, tonen we de isolatie van de muis blastocysten en de afleiding van trofoblast stamcellen uit blastocysten. We beschrijven ook de voorwaarden voor het onderhoud van de stamcel terrein en in de inductie van differentiatie in cultuur.

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

De specificatie van het trofectoderm is een van de vroegste differentiatiegebeurtenissen in de ontwikkeling van zoogdieren. De trofoblastlijn, afgeleid van de ...

Het algemene doel van deze procedure is het afleiden van TS-cellen uit blastocysten van muizen. Dit wordt bereikt door eerst de uterine hoorns te isoleren en blastocysten te winnen uit drachtige muizen. De tweede stap van de procedure is het kweken van de blastocysten op meth-feederlagen onder omstandigheden die de groei van TS-cellen bevorderen.De derde stap van de procedure is het uitbreiden van TS-kolonies en uiteindelijk het kweken van TS-cellen zonder meth-feeders. De laatste stap van de procedure is het kweken van TS-cellen met behoud van stamceleigenschappen om cryoconservering uit te voeren en trophoblastdifferentiatie te induceren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via immunofluorescentiemicroscopie de expressie tonen van een trophoblaststamcelmarker IE CDX two in ongedifferentieerde TS-cellen, of een gedifferentieerde marker IEP four 50 SCC na hun rijping tot trophoblastreuzencellen.Hoi, ik ben Shani Chu van het laboratorium van de afdeling Biomedische Genetica aan het University of Rochester Medical Center. Vandaag laten we u een procedure zien voor de kweek van trofoblaststamcellen. We gebruiken deze procedure om de groei en differentiatie van trofoblasten te bestuderen en hun rol in extra-embryonaal weefsel voor de vorming van een gezonde placenta.Laten we beginnen. Om deze procedure te starten, stelt u een kruising op tussen de muizen van belang. Bereid vervolgens muis embryonale fibroblasten (MEF's) voor als feeder-cellen.Twee dagen voor de collectie van blastocysten, zaai meth-cellen uit in 100 millimeter schalen. Behandel deze meth-cellen de volgende dag gedurende twee uur bij 37 °C en 5% CO2 met 10 milliliter TS-medium dat 20 µg/mL mitomycine C bevat. Was de cellen na twee uur tweemaal met PBS, resuspendeer de met mitomycine C behandelde meth-cellen in 10 milliliter TS-medium en zaai de cellen uit in een 12-wells plaat. Vervang op de dag van de blastocystcollectie het kweekmedium van de meth-cellen door TS-medium aangevuld met 1X FGF4-heparine.We zijn nu klaar om de blastocysten uit de baarmoeder van de muis te verzamelen. Leg eerst het geëuthanaseerde dier op de rug en reinig de huid en vacht met 70% ethanol. Maak vervolgens een kleine laterale incisie, trek de huid richting de kop en snijd lateraal door het peritoneum om het abdomen bloot te leggen.Om de buikholte bloot te leggen, lokaliseert u de uterus. Verwijder de uterus door deze met een pincet vast te pakken bij de cervix, die zich achter de blaas bevindt, en door te snijden over de overgang tussen de uterus en de cervix. Trek de uterus weg en trim het membraan en het vetweefsel.Snijd vervolgens de uterus door onder de aansluiting met de eileider. Plaats de uterus in 0,2 milliliters TS-medium in een 60 millimeter plaat. Vul nu een spuit van één milliliter met één milliliter TS-medium.Bevestig een naald van 26 gauge en steek de naald in de basis van één baarmoeder. Spoel langzaam uit in een nieuwe plaat van 60 millimeter. De baarmoeder moet tijdens het spoelen volledig opgeblazen en uitgerekt zijn.Spoel op dezelfde wijze de andere uterine horn door met behulp van een mondgestuurde pipet. Verzamel de blastocysten en breng deze voorzichtig over naar een schone 12-wells plaat met TS-medium. Was de blastocysten drie keer door ze opeenvolgend over te brengen via TS-medium in 12-wells platen.Plaats één blast assist per putje. Gebruik hiervoor een 12-wells plaat met de met mitomycine C behandelde meth-feeder-cultuur bij 37 °C en 5% carbon dioxide. De blast assists zullen binnen 24 tot 36 uur uit de zona lucida uitkomen en zich aan de putjes hechten.Op dag drie zal een kleine uitgroei duidelijk zichtbaar zijn. Voed de culturen op dag vier of vijf met 500 µL vers TS-medium plus één X FGF4-heparine. De blast-assist uitgroei zou, afhankelijk van de grootte, klaar moeten zijn voor disaggregatie.De ideale grootte voor de disaggregatie van TSL wordt hier geïllustreerd. Was de culturen één keer met 0,5 milliliters PBS. Voeg vervolgens 100 microliters 0,25% tripsin in EDTA toe en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide.Nu zijn we klaar om de blasten te dissociëren, wat waarschijnlijk het meest kritieke deel van deze procedure is. Breek vervolgens de blast-assist uitgroei in kleine klompjes door krachtig op en neer te pipetteren met een P 100 pipet. Stop de trypsinisatie door 0,5 ml 70 cm 1.5 F four H medium aan de well toe te voegen en plaats de cellen onmiddellijk terug in de incubator. Vervang het medium acht uur na de disaggregatie.Ga door met het voeden van de cellen om de twee dagen tussen dag zes en 10. Dit is zeer variabel. TSL-kolonies kunnen worden waargenomen.Ze hebben een platte, epitheliale, veldachtige morfologie met een duidelijke koloniegrens. Ga door met het voeden van de culturen om de twee dagen. Wanneer de TS-cellen een confluentie van 50% bereiken, gewoonlijk tussen dag 15 en 20, was ze eenmaal met PBS en voeg 100 µL 0,25% trypsin EDTA toe; pipetteer de suspensie tijdens de trypsinisatie herhaaldelijk op en neer om een nagenoeg enkelvoudige cel-suspensie te verkrijgen.Stop de trypsinisatie na vijf minuten door zeven DCM 1.5 F four H medium toe te voegen. Breng de cellen vervolgens over naar nieuwe zeswells-platen die de eerder voorbereide met mitomycine C behandelde meth-feeders bevatten en incubeer deze bij 37 °C in 5% koolstofdioxide. Verschoon het medium acht uur na passage en blijf de culturen elke twee dagen voeden. Na nog één of twee passages op de meth-feeders kunnen de TSL zonder deze worden gekweekt om de TSL van de meth-feeders te scheiden.Incubeer de gepasseerde gecultiveerde cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C in 5% koolstofdioxide. Omdat mes-cellen na trypsinisatie veel sneller aan de kweekplaat hechten dan TS-cellen, zullen de meeste mes-cellen aan de plaat hechten, terwijl de TS-populatie in suspensie blijft. Overbreng het supernatant naar een nieuwe plaat.Herhaal dit proces van het scheiden van de TS-cellen van de meth-feeders gedurende meerdere passages om een zuivere TS-populatie te verkrijgen. Houd de TS-cellen in 70 cm, 1.5 F four H medium en pas ze elke vier dagen of wanneer de cultuur een confluentie van 70% bereikt. Ten slotte kan de identiteit van de TS-cellen worden bevestigd door immunokleuring van een celmarker.Voeg twee eenheden CDX toe om TS-cellen te bevriezen, oogst deze door ionisatie, gevolgd door centrifugatie bij 450 GS gedurende zes minuten. Resuspendeer de cellen in TS-medium met een gelijk volume twee x vriesmedium en breng deze over naar cryovials. Een 60 millimeter plaat die voor 70% confluent is, wordt gewoonlijk verdeeld over twee vials.Bevries de cellen langzaam met behulp van een isopropylalcoholkamer bij -70 °C. Verplaats ze na 24 tot 48 uur naar vloeibare stikstof. Het ontdooien van TSL moet snel gebeuren door het buisje te ontdooien bij 37 °C.Breng de haw-cellen over naar een buis van 15 milliliter met 10 milliliter TS-medium en verzamel de cellen door centrifugatie; resuspendeer de cellen in 70 cm, 1.5 F four H-medium en zaai elke vial met cellen uit in een plaat van 60 millimeter. De differentiatie van TS-cellen tot trofoblast-reuzencellen of tgc kan worden geïnduceerd door het onttrekken van MEC four en heparine. De T GCs zijn in kweek eenvoudig te identificeren aan hun vergrote kernen en cellichamen.Het TGC-fenotype kan ook worden aangetoond door immunokleuring van een TGC-marker, P40 SCC, in het groen weergegeven, met een tegenkleuring van DAPI in het rood, zoals hier waargenomen. Gedifferentieerde cellen brengen P40 SCC tot expressie, terwijl ongedifferentieerde cellen dat niet doen. Flowcytometrische analyse van de gedifferentieerde cellen, gekleurd met propidiumjodide, laat verder een hoger DNA-gehalte zien, waarbij M1 twee tot vier kopieën vertegenwoordigt en M2 meer dan vier kopieën DNA.Deze resultaten suggereren dat TSL's endoreduplicatie ondergaan om polyploïde TCS te worden, vertegenwoordigd door de M twee populatie. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe blastocysten worden verzameld en hoe muis TS-cellen uit blastocysten worden afgeleid. Het is belangrijk om bij het opzetten van de TSL-lijnen de uitgroei nauwlettend in de gaten te houden en ervoor te zorgen dat hun pluripotentie onder de kweekcondities behouden blijft.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

derivation-of-mouse-trophoblast-stem-cells-from-blastocysts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

Het vermogen van menselijke embryonale stamcellen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle celtypen van het lichaam, suggereert dat zij een grote belofte voor zowel de medische toepassingen en als een research tool voor het aanpakken van fundamentele vragen bij ontwikkeling en ziekte vast te houden. Hier bieden wij een beknopte, stap-voor-stap protocol voor de winning van menselijke embryonale stamcellen uit embryo's door immunosurgical isolatie van de binnenste celmassa.

Afleiding van menselijke embryonale stamcellen door Immunosurgery

Het vermogen van embryonale kiemcellen om in primordiale kiemcellen differentiëren tijdens de vroege ontwikkelingsstadia is een perfect model om onze hypothese te pakken over kanker en onvruchtbaarheid. Dit protocol laat zien hoe primordiale kiemcellen van de ontwikkeling van gonaden isoleren in 10.5-11.5 dagen na coitum muizenembryo's.

Isolatie en Afleiding van muis embryonale cellen Germinal

In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

Hier presenteren we een protocol voor de directe omzetting van muis embryonale fibroblasten in volledig functionele en stabiele trofoblast-stamcellen door tien dagen overexpressie van Tfap2c, Gata3, Eomes en Ets2.

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Dit artikel beschrijft een protocol om efficiënt ontlenen en cultuur pluripotente stamcellijnen uit muis embryo's in het blastocyst stadium.

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Een protocol dat de vorming van menselijke blastoïden schetst die efficiënt, tijdig en sequentieel blastocystachtige cellen genereren.

Protocol voor humane blastoïden modellering blastocyst ontwikkeling en implantatie

In deze video, zullen we laten zien hoe je netvlies stamcellen uit het ciliaire epitheel van de muis oog te isoleren en te groeien ze in cultuur tot klonale netvlies bollen te vormen. De bollen die zijn geïsoleerd beschikken over de kardinale eigenschappen van stamcellen: self-vernieuwing en multipotentiality.

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

Leer de afleiding van trofoblast stamcellen uit muizenblastocysten voor placenta-onderzoek. Deze methode omvat isolatie, kweek op feederlagen en differentiatie-inductie.

Afleiding van Mouse trofoblast stamcellen uit blastocysten

Meer video's verkennen