Name: Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Leer genexpressieanalyse in larvenweefsels van Agrilus planipennis met kwantitatieve real-time PCR. Deze methode onthult differentiële expressiepatronen in verschillende ontwikkelingsstadia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen de hulp van Lourdes Delta Arrueta Antequera (afdeling Entomologie, Ohio State University / OARDC, Wooster, OH) in de setup van de experimenten. Wij danken dr. Therese Polen (USDA, Bos Services, NRS) voor het versturen EAB larven monsters. Hulp van dr. Luis A Canas en Nuris M Acosta met de microscoop setup wordt gewaardeerd. De financiering voor dit project werd verstrekt door de staat en federale fondsen toegerekend aan de Ohio Agricultural Research and Development Center, The Ohio State University.

Het complete protocol met verschillende stappen wordt afgebeeld in het stroomschema in figuur 1. Afzonderlijke stappen vormen dissectie, worden RNA-extractie, eerste streng cDNA-synthese en qRT-PCR hieronder beschreven. I. larvale Dissection <ol><li> Voorafgaand aan de start van deze procedure, plaats Emerald as boor, of EAB, larven op vochtig tissue papier tot dissecties worden uitgevoerd. Houd vers bereide 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, of PBS, op ijs om de buffer te koud te houden gedurende de dissectie. </li><li> Om te beginnen, stelt de EAB larven op de dissectie plaat met fijne dissectie pinnen. Voeg vervolgens koud 1X PBS aan de dissectie plaat. </li><li> De eerste, onthoofden larven met een fijne paar van dissectie schaar. Verwijder vervolgens de laatste abdominale segment van de larven. </li><li> Met behulp van een horlogemaker tang, til de cuticula van de larvale karkas. Dan maakt een incisie over de lengte van het karkas met behulp van een schaar. Zorg ervoor dat u scheuren de darm als de incisie wordt gemaakt. </li><li> Zorgvuldig te isoleren middendarm weefsel van andere weefsels zoals vet organen en bindweefsel. Daarna, spoel het weefsel in verse 1X PBS buffer om ervoor te zorgen dat er geen besmetting van fatbody. Breng de geïsoleerde middendarm tot 500 ul van pre-gekoelde TRIzol reagens in een 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Vervolgens isoleren het vet lichaam weefsel met behulp van een tang en breng het in een 1,5 ml Eppendorf buisje met 500 pi van gekoelde TRIzol reagens. </li><li> Tot slot, isoleren van de cuticula weefsel van de larvale karkas door sloop af daaraan klevend weefsel, zorg ervoor dat u de integriteit weefsel beschadigen. Spoel de geïsoleerde cuticula weefsel in verse PBS buffer en overbrengen naar een 1,5 ml Eppendorf buis met 500 pl van gekoelde TRIzol reagens. </li><li> De geïsoleerde dik lichaam, nagelriem en middendarm weefsel kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot RNA-extractie. </li><li> Ter voorbereiding van RNA-extractie, sorteren van de verschillende EAB monsters volgens de ontwikkelingsstadia. Deze fasen zijn 1e-, 2e-, 3e-en 4e-stadia, prepupae en volwassenen. </li></ol> II. RNA-extractie (Per fabrikant s-protocol voor het gebruik van TRIzol Reagens) Homogenisering <ol><li> Om te beginnen RNA-extractie, het eerste gebruik plastic stampers naar de weefsels homogeniseren in de TRIzol met 1,5 ml Eppendorf-buisjes. Na homogenisering, brengt het totale volume van elk monster tot1 mL met de TRIzol reagens. </li><li> Voor de ontwikkelingsstadia, homogeniseren hele dier in vloeibare stikstof met een mortier en een stamper. Voeg vervolgens een hoeveelheid van de homogenaat (50 ug) tot 1 ml TRIzol. </li></ol> Fasescheiding: <ol start="3"><li> Incubeer het monster buisjes met een mL TRIzol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Na de incubatie, voeg 200μL van chloroform aan elke buis. Onmiddellijk na het toevoegen van chloroform, krachtig schudden van de buizen voor ongeveer 15 seconden. Dan, incubeer de buizen bij kamertemperatuur voor een extra 2-3 minuten. </li><li> Vervolgens centrifuge de monsters bij 12.000 xg gedurende 15 minuten bij 2 ° C. Na het centrifugeren, wordt het RNA in de waterige fase. Het volume van de waterfase moet 600 ul, of 60% van het totale volume TRIzol worden. </li></ol> RNA neerslag <ol start="6"><li> Verwijder voorzichtig alleen de waterige fase. Aanwezigheid van stoffen onder de waterige fase zal leiden tot vervuiling van het geëxtraheerde RNA. Dan overdracht van de waterige fase in een passend etiket 1,5 mL eppendorfbuisje. </li><li> Aan neerslag het RNA uit de waterige fase, mix 0,5 ml isopropylalcohol aan elke buis. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na de incubatie, centrifuge de buizen bij 12.000 xg gedurende 10 minuten bij 2 ° C. </li></ol> RNA Wash <ol start="8"><li> Na centrifugatie, gooi het supernatans van de buizen. RNA is aanwezig in de gel-achtige pellet gevormd op de bodem van de buis. Was de pellet met 75% ethanol, het toevoegen van ten minste 1 mL van 75% ethanol per 1 ml TRIzol. En door vortexen gemengd. Dan, centrifuge de buizen op 7500Xg gedurende 5 minuten bij 2 ° C. </li></ol> RNA elutie <ol start="9"><li> Verwijder het supernatant van de buizen. Weer Centrifugeer de buizen in de kleine tafel centrifuge gedurende 1 minuut. Verwijder eventuele overtollige supernatans van de buis door een zorgvuldige pipetteren. Laat de tube open en laat de pellet drogen aan de lucht gedurende 5-10 minuten. Wees voorzichtig niet meer dan drogen de korrel, omdat dit sterk zal dalen zijn oplosbaarheid. </li><li> Na het drogen aan de lucht, resuspendeer de pellet in <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diethylpyrocarbonate</a> , of DEPC, behandeld water. De hoeveelheid water die wordt gebruikt om de pellet opnieuw in suspensie zal afhangen van de grootte van de pellet. Gebruik 50 ul van DEPC behandeld water voor een smalle pellet of 100 uL voor een grote pellet. Laat de pellet volledig in DEPC behandeld water op te lossen door het verplaatsen van de pipetpunt op en neer een paar keer. </li><li> Nadat de pellet is opgelost, plaats het monster bij 55 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Dan, het meten van de concentratie van elk RNA-monster met behulp van een Nanodrop spectrofotometer (2 pi van het RNA monster). </li><li> Bewaar het RNA monsters bij -80 ° C tot verder gebruik. </li></ol> III. Eerste streng cDNA Synthese (Per fabrikant s-protocol met behulp van SuperScript eerste streng synthese kit van Invitrogen.) <ol><li> Voor elk RNA-monster voeg de volgende in een PCR-buis: <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> x ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix M </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> Oligo (dt) (0,5 pg / pl) </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> DEPC behandeld water </td><td> (8-x) ul </td></tr><tr><td> Totaal Volume: </td><td> 10 pi </td></tr><tr><td colspan="2"> Let op: x is het volume van de RNA wordt gebruikt voor de cDNA synthese. Afhankelijk van de concentratie van het RNA, zal 2 tot 3 pg van RNA worden gebruikt voor elke reactie en het totale volume van elke reactie moet 10 pi te worden. </td></tr></tbody></table></li><li> Plaats de bovenstaande reactie mix in een thermocycler bij 65 ° C gedurende 4 minuten. </li><li> Haal de buizen van de theromocyler en leg ze op ijs onmiddellijk gedurende minstens 2 minuten. </li><li> De voorbereiding van de eerste streng master mix door toevoeging van het volgende: <table border="0"><tbody><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25MM MgCl 2 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT </td><td> 2 pi </td></tr><tr><td> RNase uit </td><td> 1 pi </td></tr></tbody></table></li><li> Voeg 9 pl master mix aan elke buis met het RNA-monster, meng door pipetteren en centrifugeer het mengsel kort. </li><li> Plaats de buizen in de thermocycler en incubeer gedurende 2 minuten bij 42 ° C. </li><li> Pauzeer het thermocycler en voeg 1 pl Superscript II reverse transcriptase enzym (Invitrogen) aan elke buis. Deze stap moet snel worden gedaan. </li><li> Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 1,5 uur. </li><li> Beëindig de reactie bij 70 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Haal de buizen van de thermocycler en plaats ze op ijs. </li><li> Voeg 1 ui van RNase H aan elke buis en plaats ze terug in de thermocycler bij 37 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Na het nemen van de monsters uit de thermocycler, voeg 20 ul van nuclease-vrij water in elke buis. Het volume van elk monster wordt verdubbeld in dit stadium. </li><li> Controleer de concentratie van elk monster met behulp van 2 pi van het monster. Neem de hoeveelheid van elk monster, om de concentratie van 20ng/μl te maken voor gebruik in qRT-PCR. De hoeveelheid water te maken van de monsters naar een concentratie van 20ng/μl zal afhangen van de aanvankelijke concentratie van het cDNA gesynthetiseerd. </li></ol> IV. qRT-PCR: Primer Ontwerp en Bepaling van de referentie-gen <ol><li> Ontwerp van primers met een smelttemperatuur (Tm) van 60 ° C en een product grootte van ~ 100 basispunten. </li><li> AP-PERI1 wordt gebruikt als het gen van belang zijn voor dit experiment. Een verwijzing gen of de interne controle is nodig voor latere analyse en normalisatie van de gegevens. Ribosomaal eiwit (AP-RP1) wordt gebruikt als de referentie-gen voor dit experiment. </li><li> Bereid 5UM werkvoorraden van de primers die gebruikt zullen worden, met inbegrip van uw referentie-gen. </li></ol> Opstellen van normen <ol start="4"><li> Om de efficiëntie van de primers gebruikte normen moeten worden gesteld te berekenen. </li><li> Maak een mix van het cDNA van de verschillende monsters die zal worden getest. </li><li> Maak 5x seriële verdunningen voor elk gewenst punt in de grafiek. Vier verdunningen zou genoeg moeten zijn, maar vijf zijn sterk aanbevolen. </li><li> Het volume is afhankelijk van hoeveel punten en hoeveel technische repliceert worden gebruikt. Er moet genoeg zijn om een ​​standaard voor elk gen wordt getest met inbegrip van het referentie-gen te maken. </li></ol> Plaat Template <ol start="8"><li> Ontwerp een sjabloon waarin de sample naam voor elke goed in de qRT-PCR-plaat. Vergeet niet om normen voor elk gen en ten minste twee technische duplo's per steekproef op te nemen. </li></ol> Stel de fiets-parameters <ol start="9"><li> Draai de qRT-PCR machine op en voer het fietsen parameters. Het fietsen parameters voor dit experiment is als volgt: Stap 1: <ul><li> Een cyclus: 95 ° C 3 min </li></ul> Stap 2: <ul><li> 40 cycli: 95 ° C 15 seconden, gevolgd door 60 ° C 30 sec (Optioneel: voor het bepalen van de smeltcurve omvat de volgende stappen) </li></ul>Stap 3: <ul><li> Een cyclus: 95 ° C 1 min. </li></ul> Stap 4: <ul><li> 1cycle: 55 ° C 1 min. </li></ul> Stap 5: <ul><li> 81 cycli: 55 ° C 30 sec </li></ul></li></ol> Plaat opgezet voor CFX96 (BioRad) machine <ol start="11"><li> Bereid de master mix voor elk gen (inclusief de referentie-gen) in aparte buis. Voor elke goed, de meester mix bestaat uit <table border="0"><tbody><tr><td> Nuclease gratis water </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2.5 X SYBR groen </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Primer vooruit </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Primer achteruit </td><td> 1 pi </td></tr><tr><td> Totale volume </td><td> 8 ul </td></tr></tbody></table></li><li> Bij de voorbereiding van de master mix zijn 1-2 extra reacties om rekening te houden pipetteren fouten. </li><li> Volgens de eerder ontworpen sjabloon, voeg 2 pl (20 ng / pl) van cDNA aan elk putje. Vervolgens voegt u 8 pi van de master mix in elk putje, wat resulteert in een totaal volume van 10 pi per reactie. </li><li> Pipet op en neer (2-3x) om te controleren of het monster goed gemengd is. Controleer of er geen vloeistof blijft op het puntje. Om te voorkomen dat kruisbesmetting, gebruik een nieuwe tip voor elk monster. </li><li> Zodra de hele plaat is ingesteld, bedek de plaat met optische tape. Vermijd het aanraken van de tape als de aanwezigheid van vet kan de lezing van invloed zijn. Dan, centrifuge de plaat bij 500 rpm gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen dat alle producten in de putjes zijn aan de onderkant van de plaat. </li><li> Na centrifugatie, controleer of er geen ijs of water op de bodem van de plaat. Tot slot plaatst u de plaat in de qRT-PCR-machine en start het PCR-programma. </li></ol> V. Schematische weergave van het Experiment <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Schema beeltenis van de volgorde van stappen voor de genexpressie te bestuderen. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: A) larven EAB dissectie zien middendarm in het midden. B) geïsoleerde middendarm van larvale EAB <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3: A) Gemiddelde relatieve expressie waarden (toerental) voor een peritrophin gen (AP-PERI1) in verschillende weefsels waaronder larven cuticula (Cu), middendarm (MG) ​​en vet organen (FB). Een EAB specifieke ribosomaal eiwit (hierin genoemd, AP-RP1) werd gebruikt als de interne controle voor het normaliseren van de gegevens verkregen voor het gen van belang, AP-PERI1. B) Relatieve voudige verandering van de AP-PERI1 in larvale weefsels. De nagelriem weefsel toonde de minst expressie en daarom werd genomen als de kalibrator (1X) monster (Pfaffl, 2001). <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: A) Gemiddelde relatieve expressie waarden (toerental) voor een peritrophin gen (AP-PERI1) in verschillende ontwikkelingsstadia van EAB inclusief larve stadia (1e, 2e, 3e en 4e), prepupae (PP) en volwassenen (A). Een EAB specifieke ribosomaal eiwit (AP-RP1) werd gebruikt als de interne controle voor het normaliseren van de gegevens verkregen voor het gen van belang, AP-PERI1. B) Relatieve voudige verandering van de AP-PERI1 in verschillende ontwikkelingsstadia. De PP monster toonde de minst niveau van mRNA niveaus en daarom werd genomen als de kalibrator (1x monster). VI. Conclusie Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. Verder is qRT-PCR meestal is het belangrijkste instrument om gegevens gegenereerd uit high throughput genexpressie analyses zoals microarrays en de nieuwe generatie RNA-Seq valideren.

<ol><li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritrophic+matrix+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li>
<li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly%2C+Mayetiola+destructor+%5BSay%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arc+of+Insect+Bio%22%5BJournal%5D)">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li>
<li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li>
<li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li>
<li>Tellam, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTellam%2C+RL+%22Biology+of+the+Insect+Midgut%22">Biology of the Insect Midgut</a>. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).</li>
</ol>

De drempel cycli (Ct) waarde wordt verkregen voor elk monster in de qRT-PCR-plaat. Voor het maken van de standaard curve, is de Ct-waarde verkregen voor elke verdunning uitgezet tegen de log van de concentratie. De Ct-waarden voor de experimentele monsters werden vervolgens uitgezet op deze verdunningsreeks standaardcurve. Target hoeveelheden werden berekend op basis van aparte standaard curves gegenereerd voor elk experiment dat wil zeggen weefsel en ontwikkeling expressie. De relatieve expressie-waarden (toerental) we...

analyse van genexpressie in emerald ash borer ( agrilus planipennis) met behulp van kwantitatieve real time-pcr

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald as boor (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) Is een exotische invasieve pest, die heeft gedood miljoenen essen (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) in Noord-Amerika.<strong&gt;</strong&gt; EAB blijft snel verspreiden en aanvallen essen bomen van verschillende leeftijden, van jonge boompjes tot volwassen bomen. Echter, tot op heden weinig of geen moleculaire kennis bestaat voor EAB. Wij zijn geïnteresseerd in het ontcijferen van de moleculaire basis van fysiologische processen in het weefsel niveau dat de steun EAB in succesvolle kolonisatie van essen. In dit rapport tonen we het effectieve gebruik van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) om na te gaan mRNA niveaus in de verschillende larvale weefsels (inclusief middendarm-, vet-instellingen en cuticula) en verschillende ontwikkelingsstadia (waarvan 1<sup&gt; St</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; E</sup&gt;-Stadia, prepupae en volwassenen) van EAB. Als voorbeeld, een peritrophin gen (hierna genoemd,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) Is een voorbeeld als het gen van belang en een ribosomale eiwit (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Als de interne controle. Peritrophins zijn belangrijke componenten van de peritrophic membraan / matrix (PM), dat is de bekleding van het insect darm. De PM heeft diverse functies, waaronder de spijsvertering en mechanische bescherming aan de middendarm epitheel.

Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) is een doeltreffend instrument om mRNA niveaus te diagnosticeren in verschillende insecten weefsels en ontwikkelingsstadia. In dit rapport tonen we het gebruik van de qRT-PCR na te gaan mRNA niveaus in de verschillende weefsels en larvale ontwikkelingsstadia van de invasieve soorten insecten, smaragd as boor.

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

De esenprachtkever (EAB, Agrilus planipennis) is een exotische invasieve plaag die miljoenen essen (Fraxinus spp) in Noord-Amerika heeft gedood. De EAB ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de genexpressie in weefsels en ontwikkelingsstadia van de smaragdgroene esboorder te analyseren met behulp van kwantitatieve PCR. Dit wordt bereikt door dissectie van larvale weefsels en categorisatie van ontwikkelingsstadia. Als tweede stap wordt RNA uit de weefsels en ontwikkelingsstadia geëxtraheerd met behulp van triol-reagens, dat vervolgens als template wordt gebruikt om de eerste streng, cDNA, te genereren; na de synthese van de eerste streng cDNA wordt kwantitatieve RT-PCR uitgevoerd.Er worden resultaten verkregen die een differentiële expressie van het doelgen laten zien in verschillende larvale weefsels en ontwikkelingsstadia, gebaseerd op volledige veranderingsgegevens verkregen uit de cycle threshold-waarden na kwantitatieve R-T-P-C-R amplificaties. Hallo, ik ben Prakash Mi, de PI van dit laboratorium in de afdeling Entomologie aan de Ohio State University.Mijn laboratorium richt zich hoofdzakelijk op de genomische of moleculaire aspecten van de interacties tussen de smaragdgroene esenkevers, de as en de burer. De smaragdgroene esenkever, of EAB, is een exotische invasieve plaag uit China die het voortbestaan van espop

analysis-gene-expression-emerald-ash-borer-agrilus-planipennis-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen...

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

We beschrijven een protocol met behulp...

Kwantitatieve en geautomatiseerde high-throughput genoomwijde RNAi schermen in C. elegans</em

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

RNA-Seq-analyses worden steeds belangrijker voor het identificeren van de moleculaire grondslagen van adaptieve eigenschappen bij niet-modelorganismen. Hier wordt een protocol beschreven om differentieel tot expressie gebrachte genen te identificeren tussen diapauze en niet-diapauze Aedes albopictus muggen, van het kweken van muggen tot RNA-sequencing en bioinformatica-analyses van RNA-Seq-gegevens.

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug, Aedes albopictus

Dit protocol beschrijft een methode om de hypothese te testen dat de omkering van het effectieve geomagnetische veld (GMF) differentiële genexpressie induceert en de morfologie van Arabidopsis thaliana verandert. Een triaxial octagonaal systeem van Helmholtz spoelparen werd gebruikt om kunstmatig omgekeerde GMF-condities in de plantengroeikamerber te genereren.

Aardmagneetveld (Gmf) en Plant Evolutie: Onderzoek naar de effecten van Gmf Reversal op<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ontwikkeling en Gene Expression

Effectieve vallen aantrekken en vangen van de emerald ash borer (EAB) een sleutelelement voor het opsporen en beheren van deze invasieve pest. Dubbeldekker vallen, geplaatst in de volle zon in de buurt van ash bomen, visuele en olfactorische aanwijzingen nemen en waren meer kans te vangen EAB dan andere val ontwerpen in veldproeven.

Dubbeldekker Traps voor vroegtijdige opsporing van Emerald Ash Borer bouwen

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

Een verbeterde protocol wordt gepresenteerd voor de meting van voorbijgaande genexpressie van verslaggever constructies in gerst aleurone cellen na deeltje bombardement. De combinatie van geautomatiseerde graan malen met 96-wells-plaat enzym testen biedt hoge doorvoer voor de procedure.

Meten van de genexpressie in gebombardeerd gerst Aleurone lagen met grotere gegevensdoorvoer

De bladluis Aphis Oleanderpijlstaart koloniseert op zeer verdedigd planten uit de familie van de onderfamilie (Apocyanaceae) en biedt tal van mogelijkheden om te studeren plant-insect interacties. Hier presenteren we een reeks van protocollen voor het onderhoud van de installaties en de bladluis culturen, en de generatie en de analyse van moleculaire en - dienst gegevens voor A. Oleanderpijlstaart.

Behoud van de biologische culturen en meten van de genexpressie in Aphis Oleanderpijlstaart: een Non-modelsysteem voor Plant-insect interacties

We beschrijven een immunofluorescentie en kwantitatieve PCR-methode voor de lokalisatie en kwantificering van begomovirussen in insectenweefsels. Het immunofluorescentieprotocol kan worden gebruikt om virale en vectoreiwitten samen te lokaliseren. Het kwantitatieve PCR-protocol kan worden uitgebreid om virussen in hele wittevlieglichamen en met virussen geïnfecteerde planten te kwantificeren.

Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR

In dit artikel wordt een protocol met hoge doorvoer beschreven voor een snelle en betrouwbare bepaling van de genexpressieniveaus in enkele of bulk C. elegansmonsters. Dit protocol vereist geen RNA-isolatie en produceert cDNA rechtstreeks uit monsters. Het kan worden gebruikt samen met high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Kwantitatieve RT-PCR met hoge doorvoer in enkele en bulk C. elegans-monsters met behulp van nanofluïdische technologie

Leer genexpressieanalyse in larvenweefsels van Agrilus planipennis met kwantitatieve real-time PCR. Deze methode onthult differentiële expressiepatronen in verschillende ontwikkelingsstadia.

Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Meer video's verkennen