Analyse van genexpressie in Emerald Ash Borer ( Agrilus planipennis) Met behulp van kwantitatieve Real Time-PCR

Het algemene doel van het volgende experiment is om de genexpressie in weefsels en ontwikkelingsstadia van de smaragdgroene esboorder te analyseren met behulp van kwantitatieve PCR. Dit wordt bereikt door dissectie van larvale weefsels en categorisatie van ontwikkelingsstadia. Als tweede stap wordt RNA uit de weefsels en ontwikkelingsstadia geëxtraheerd met behulp van triol-reagens, dat vervolgens als template wordt gebruikt om de eerste streng, cDNA, te genereren; na de synthese van de eerste streng cDNA wordt kwantitatieve RT-PCR uitgevoerd.

Er worden resultaten verkregen die een differentiële expressie van het doelgen laten zien in verschillende larvale weefsels en ontwikkelingsstadia, gebaseerd op volledige veranderingsgegevens verkregen uit de cycle threshold-waarden na kwantitatieve R-T-P-C-R amplificaties. Hallo, ik ben Prakash Mi, de PI van dit laboratorium in de afdeling Entomologie aan de Ohio State University.

Mijn laboratorium richt zich hoofdzakelijk op de genomische of moleculaire aspecten van de interacties tussen de smaragdgroene esenkevers, de as en de burer. De smaragdgroene esenkever, of EAB, is een exotische invasieve plaag uit China die het voortbestaan van espopulaties in heel Noord-Amerika bedreigt. Vandaag laten we u een protocol zien voor het aanleren van genexpressieanalyse bij de EAB met behulp van qPCR of kwantitatieve real-time PCR.

De laboratoriumleden die betrokken zullen zijn bij dit protocol zijn Swapna pri ou, die de dissecties van de vallen zal uitvoeren, en vervolgens bin Bandari, die de RNA-isolatie zal demonstreren. Ten slotte zal Lauren Rivera Vega de qPCR-analyse uitvoeren. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium ook om de genexpressie van ash te bestuderen.

Laten we beginnen. Plaats vóór aanvang van deze procedure de larven van de esdoornboorkever op vochtig weefselpapier. Houd vers bereide 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS op ijs tot de dissecties worden uitgevoerd, om de buffer gedurende de gehele dissectie koud te houden.

Begin met het fixeren van de EAB-larven op de dissectieplaat met fijne dissectienaalden. Voeg vervolgens koud 1× PBS toe aan de dissectieplaat. Decapiteer de larven vervolgens met een fijn dissectieschaartje.

Verwijder vervolgens het laatste abdominale segment van de larven met een pincet voor horlogemakers. Til de cuticula van het larvenkarkas op en maak vervolgens met een schaar een incisie langs de lengte van het karkas. Zorg ervoor dat het darmkanaal niet wordt beschadigd.

Isoleer tijdens het maken van de incisie zorgvuldig het weefsel van de middendarm van andere weefsels, zoals vetlichamen en bindweefsel. Spoel het weefsel vervolgens met verse 1X PBS-buffer om contaminatie door vetlichamen te voorkomen. Breng de middendarm over naar 500 µL voorkoelde TRIzol-reagentia in een 1,5 ml Eppendorf-buisje.

Isoleer vervolgens het vetlichaamweefsel met een pincet en breng dit over naar een Eppendorf-buisje van 1,5 milliliter met 500 microliters gekoeld triol-reagens. Isoleer tot slot het cuticuleweefsel uit het larvale karkas door eventueel aanhechtend weefsel weg te schrapen, waarbij u er zorg voor draagt dat de integriteit van het weefsel niet wordt beschadigd.

Spoel het geïsoleerde cuticuleweefsel in verse PBS-buffer en breng het over naar een Eppendorf-buisje van 1,5 milliliter met 500 µL gekoeld triazolereagens. Het geïsoleerde vetlichaam, de cuticula en de midgut-weefsels kunnen worden bewaard bij -80 °C tot aan de RNA-extractie. Sorteer ter voorbereiding op de RNA-extractie de verschillende EAB-monsters op basis van de ontwikkelingsstadia.

Deze stadia omvatten de eerste, tweede, derde en vierde stadia in sterren, PrepU en volwassenen. Gebruik voor de start van de RNA-extractie eerst plastic stampertjes om de weefsels te homogeniseren in triol in 1,5 milliliter einor-buisjes. Breng na homogenisatie het totale volume van elk monster aan met het triol-reagens aan tot één milliliter.

Homogeniseer voor de ontwikkelingsstadia het hele dier in vloeibare stikstof met een vijzel en stamper. Voeg vervolgens een aliquot van het homogenaat toe aan één milliliter triol. Incubeer de monsterbuisjes met één milliliter triol gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Voeg na de incubatie onmiddellijk 200 microliters chloroform toe aan elke buis. Schud de buizen krachtig gedurende ongeveer 15 seconden. Incubeer de buizen vervolgens nog twee tot drie minuten bij kamertemperatuur.

Centrifuge vervolgens de monsters bij 12.000 GS gedurende 15 minuten bij twee graden Celsius. Na centrifugatie bevindt het RNA zich in de waterige fase. Het volume van de waterige fase moet 600 microliters of 60% van het totale triolvolume zijn.

Verwijder voorzichtig alleen de waterfase. De aanwezigheid van stoffen onder de waterfase zal leiden tot contaminatie van het geëxtraheerde RNA. Draag de waterfase vervolgens over naar een适当 gelabelde einor-buis van 1,5 milliliter.

Voeg om het RNA uit het mengsel van de waterige fase neer te slaan 0,5 milliliters isopropylalcohol toe aan elke buis. Incubeer de monsters 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buizen na de incubatie 10 minuten bij 12,000 Gs bij twee graden Celsius. Verwijder na centrifugatie het S natin uit de buizen.

RNA is aanwezig in het gelachtige pellet dat zich onderin de buis heeft gevormd. Was het pellet met 75% ethanol door ten minste één milliliter 75% ethanol per ene milliliter mengsel toe te voegen en te mengen door middel van vortexen. Centrifugeer de buizen vervolgens 5 minuten bij 7.500 G bij twee graden Celsius.

Verwijder het supernatant uit de buisjes. Centrifugeer de buisjes opnieuw gedurende één minuut in de kleine tafelcentrifuge. Verwijder eventueel resterend supernatant uit het buisje door voorzichtig te pipetteren.

Laat de buis openstaan en laat het pellet vijf tot 10 minuten aan de lucht drogen. Pas op dat het pellet niet te veel uitdroogt, aangezien dit de oplosbaarheid na het drogen aanzienlijk zal verminderen. Resuspendeer het pellet in dathyl percarbonaat of DEP-behandeld water.

De hoeveelheid water die wordt gebruikt om het pellet te resuspenderen, is afhankelijk van de grootte van het pellet. Gebruik 50 µL dep sea treated water voor een klein pellet of 100 µL voor een groot pellet. Laat het pellet volledig oplossen in dep sea treated water door de pipetpunt meerdere keren op en neer te bewegen.

Zodra de pellet is opgelost, wordt het monster 10 minuten lang bij 55 °C geplaatst. Meet vervolgens de concentratie van elk RNA-monster met een NanoDrop-spectrofotometer. Voer tot slot de synthese van de eerste cDNA-streng uit voor de betreffende RNA-monsters met behulp van het Invitrogen SuperScript first strand synthesis system voor RT-PCR.

Deze procedure kan worden gevonden in het schriftelijke gedeelte van dit protocol. Ontwerp voor het starten van de kwantitatieve real-time PCR of Q-R-T-P-C-R elke primer zodanig dat deze een smelttemperatuur heeft van 60 °C en een productgrootte van ongeveer 100 baseparen. AP par 1 wordt gebruikt als het gen van belang voor dit experiment.

Een referentiegen of interne controle is nodig voor latere analyse en normalisatie van de gegevens. Hier wordt ribosomaal eiwit a P RRP een gebruikt als referentiegen. Ontwerp vervolgens een sjabloon waarin de naam van het monster voor elke put en de QR tpcr-plaat wordt aangegeven.

Vergeet niet om voor elk gen standaarden en ten minste twee technische replica's per monster op te nemen. Zet vervolgens de QRT-PCR-machine aan en voer de cyclusparameters in om de plaat voor de CFX 96-machine in te stellen. Bereid vervolgens de mastermix voor elk gen voor in een afzonderlijke buis voor elke put.

De mastermix bestaat uit 2 µL nucleasevrij water, 4 µL 2,5 x cyber green, 1 µL primer forward en 1 µL primer reverse, voor een totaalvolume van 8 µL. Voeg volgens het eerder ontworpen schema 2 µL cDNA toe aan elke well. Voeg vervolgens 8 µL van de mastermix toe aan elke well, wat resulteert in een totaalvolume van 10 µL per reactie. Pipetteer herhaaldelijk op en neer om ervoor te zorgen dat het monster goed is gemengd.

Controleer of er geen vloeistof op de tip is achtergebleven. Gebruik om kruiscontaminatie te voorkomen voor elk monster een nieuwe tip. Zodra de volledige plaat is voorbereid, wordt de plaat afgedekt met optische tape.

Vermijd het aanraken van de tape, aangezien de aanwezigheid van vet de aflezing kan beïnvloeden. Centrifugeer de plaat vervolgens gedurende één minuut bij 500 RPM om ervoor te zorgen dat alle producten in de wells zich na centrifugatie onderin de plaat bevinden. Controleer of er geen ijs of water op de bodem van de plaat aanwezig is.

Plaats tenslotte de plaat in het QR TPCR-apparaat en voer het PCR-programma uit; representatieve resultaten voor larvale EAB zijn weergegeven. De dissectie en QR TPCR worden hier getoond. De dissectie van de EAB-larve moet de middendarm in het midden van de EAB-larve onthullen.

De middendarm van de EAB-larve wordt geïsoleerd zoals hier getoond, gemiddelde relatieve expressiewaarden of RAV's. Voor het paratrophine-gen AP par one worden hier resultaten getoond voor verschillende larvale weefsels, waaronder de cuticula, de middendarm en vetlijfamen. Het EAB-specifieke ribosomale eiwit ARP one werd gebruikt als interne controle voor het normaliseren van de verkregen gegevens voor het gen van belang.

De relatieve fold change van AP AP par one werd geëxtraheerd voor de verschillende larvale weefsels. Het cuticula-weefsel vertoonde de laagste expressie en werd daarom genomen als de calibrator steekproefgemiddelde RVs voor AP Perry. One in verschillende ontwikkelingsstadia van EAB, inclusief het eerste, tweede, derde en vierde larvale stadium in sterren.

De PrepU en volwassenen werden bepaald met gebruik van aprp one als interne controle om de gegevens te normaliseren. De relatieve fold-verandering van AP Perry one werd bepaald voor verschillende ontwikkelingsstadia. Hier vertoonde het PrepU-monster het laagste mRNA-niveau en werd daarom als calibrator gebruikt.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u laterale dissecties uitvoert en vervolgens genexpressieanalyse verricht met behulp van de laterale zijde, evenals verschillende ontwikkelingsstadia van Emeral ra, door gebruik te maken van kwantitatieve R-T-P-C-R tijdens deze procedure. Wees voorzichtig tijdens het dissecteren om kruiscontaminatie van weefselmonsters te voorkomen. Daarnaast moet er bij het uitvoeren van Q-R-T-P-C-R zorgvuldig worden gewerkt, zodat de respectievelijke monsters in de juiste PCR-wells worden gepipetteerd.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken naar onze video en veel succes met uw experimenten.