Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen
25 juli 2010
De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.
Het algemene doel van het volgende experiment is om neurale cellen met een hoge resolutie in beeld te brengen in het zebravisembryo. Eerst wordt DNA dat codeert voor membraangegericht groen fluorescent eiwit geïnjecteerd in een zebravisembryo in het eencellige stadium, wat resulteert in mozaïekovererving, waardoor verbeterde beeldvorming van verspreide cellen mogelijk wordt. De embryo's worden vervolgens immunogelabeld met anti-GFP en in coupes gesneden, wat de visualisatie van de morfologie van individuele cellen met een hoge resolutie in een gefixeerde preparaat mogelijk maakt. Alternatief kunnen levende embryo's worden onderzocht met time-lapse videomicroscopie om cellulaire dynamiek in beeld te brengen.
Er worden resultaten verkregen die de celmorfologie of dynamiek tonen. Hier wordt de achterhersenen van de zebravis in beeld gebracht met confocale microscopie. Hallo iedereen.
Ik ben PR Chandran van het laboratorium van Dr. Rachel Brewster van de afdeling biologische wetenschappen aan de University of Maryland Baltimore County. Vandaag laten we u een procedure zien om neurale cellen in zebravisembryo's te labelen en met een hogere resolutie in beeld te brengen. In ons laboratorium gebruiken we deze procedure doorgaans om de mechanismen van neurale relatie in zebravisembryo's op cellulair niveau te bestuderen.
Laten we beginnen. Plaats natte Kimwipes rond de rand van een 100 millimeter Petrischaal.
Bevestig een glazen micro-injectienaald zorgvuldig op een strook was in de bevochtigde schaal. Richt de naald onder een dissectiestereomicroscoop uit tegen een gradueel objectglas. Gebruik een schoon scheermesje om voorzichtig tegen de naald te tikken op het punt waar deze een diameter van 1 µm heeft, om zo een opening van de juiste grootte te verkrijgen.
Bevestig de naald aan het microinjectieapparaat en pipetteer 0,5 µL van een oplossing van fenolrood en water op parafilm, en vul de naald vanuit de druppels. Stel de microinjectiedruk in op 7 kPa en begin met een puls van 20 ms. Tel het aantal pulsen dat nodig is om alle vloeistof te dispenseren. Varieer de tijd tussen 10 en 30 ms, zodat er ongeveer 250 pulsen nodig zijn voor volledige dispensatie.
0,5 µL van de oplossing. Gebruik een micropipet om de naald te vullen met 0,5 tot 1 µL MG FPD NA in water, gemengd met fenolrood voor visualisatie. Dek de bevochtigte schaal af om verdamping van de oplossing uit de naald onder de stereomicroscoop te voorkomen.
Plaats vissenembryo's in het ene-celstadium gescheiden van elkaar in een Petrischaal van 60 millimeter gevuld met embryo.Medium. Gebruik een fijne pincet om het chorion voorzichtig vast te pakken en het embryo te stabiliseren. Beweeg de naald gevuld met MGFP en fenolrood naar het doelgebied voor injectie.
Voor een brede expressie van MGFP dient men in de dooier of het cytoplasma te injecteren. Gebruik het micro-injectieapparaat om ongeveer twee nanoliters van de MGFP-oplossing toe te dienen. Controleer de locatie van de fenolrood-indicator om een correcte injectie te bevestigen.
Verwijder de naald voorzichtig uit het embryo. Injecteer alle embryo's in het schaaltje, tot maximaal 30 embryo's tegelijk. Vermijd blootstelling van de embryo's aan licht; incubeer bij 28,5 °C onder de stereomicroscoop om de embryo's te laten ontwikkelen tot het gewenste stadium.
Gebruik een fijne pincet om de Corian voorzichtig van de embryo's af te pellen. Gebruik een pastapipet om de lege corian uit de schaal te verwijderen, zodat alleen de gecoate embryo's achterblijven. Gebruik een vuurgepolijste pastapipet om de geïnjecteerde gecoate embryo's over te brengen naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.
Verwijder zoveel mogelijk overtollig medium en voeg vervolgens één milliliter ative toe. Was de embryo's drie keer gedurende vijf minuten elk in één XPB S bij kamertemperatuur. Verplaats de embryo's onder de stereomicroscoop naar een petrischaal gevuld met één XPBS.
Gebruik fijne pincetten om het embryo nabij de staartregio vast te houden. Gebruik een tweede set pincetten of een probeerpen om zoveel mogelijk van het geel te verwijderen zonder de achterste frame-regio aan te raken. Til het embryo onder de stereomicroscoop met de fijne pincetten uit de schaal en plaats het in een insluitingsvorm gevuld met 4% low melting point agarose.
Plaats het embryo aan één uiteinde van de mal. Laat het aros bij kamertemperatuur uitharden. Gebruik een spatel om het uitgeharde arosblok uit de mal te halen en snijd met een scheermes het onderste uiteinde van het blok gelijkmatig af.
Gebruik een druppel secondelijm om het blok, indien gewenst met de snijkant naar beneden, op het vibratostatief te bevestigen. Lijn meerdere blokken op het statief uit. Bevestig het statief aan de vibrator.
Zorg ervoor dat het mesje volledig door elk embryo snijdt, maar niet geheel door het blok. Vul het plateau met één XPBS-sectie. Snijd de embryo's voorzichtig los van het blok en breng ze over naar een Petrischaal gevuld met één XPBS.
Scheid de secties onder een stereomicroscoop. Gebruik een fijne pincet om de gewenste secties in een multi-well plaat te plaatsen die is gevuld met 1x PBS. Gebruik voor elk embryo een aparte well.
Kleur de coupes met DPI en label deze immunologisch met anti GFP. Indien dit niet gebeurt, moet de beeldvorming binnen 48 uur plaatsvinden. Monteer maximaal zes coupes per objectglas en plaats een dekglas op de coupes voor confocale beeldvorming.
Bewaar de preparaten in het donker om fotobleking te voorkomen. Tijdens de live-imaging moeten de met MGFP geïnjecteerde embryo's worden beschermd tegen licht. Gebruik een pincet om de embryo's te overbrengen 30 minuten voordat ze het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken.
Breng de gecoate embryo's over naar een sedatieve oplossing van embryo-medium met 0,01% Trica en incubeer deze 15 minuten bij kamertemperatuur. Pipetteer een druppel 1% reguliere agarose in water op een glazen cultuurschaal met een bodem van 35 millimeter, zodat de mal wordt gevuld. Laat de agarose stollen.
Gebruik de glazen capillaire buis van 90 millimeter om drie gaatjes te maken in de druppel aros onder de stereomicroscoop. Inspecteer de bodem van de put en verwijder eventuele resten aros met een pincet. Vul de schaal met embryo-medium onder de stereomicroscoop.
Gebruik een pastapipet om één embryo naar elk gat in de aros te overbrengen. Gebruik een fijne pincet om het embryo zo te positioneren dat het gebied van belang, in dit geval de dorsale kop, tegen het glas rust. Dek de schaal af.
Transporteer de schaal voorzichtig naar de tafel van een confocale microscoop. Gebruik ruimteverwarmers om de embryo's gedurende de beeldvorming op 28,5 °C te houden. Hier is een doorsnede door de ruitenhersenen van een wildtype embryo bij vier tot vijf somiten, dubbel gelabeld met membraangebonden GFP in het groen en D in het blauw; slechts één cel is gelabeld met membraangebonden GFP, wat hoge-resolutie beeldvorming van de cellulaire morfologie en organisatie mogelijk maakt.
Dit is een vergelijkbare afbeelding van de achterhersenen van een nardi-mutant bij vier tot vijf somiten. Deze afbeelding laat zien dat de cellen in nardi-mutanten er niet in slagen zich tijdens de neurulatie correct te oriënteren ten opzichte van de middellijn. In tegenstelling tot de methode voor het markeren van cellen met MGFP, maakt labeling van de achterhersenen met een algemene celoppervlaktemarker zoals bèta-catenine het niet mogelijk om de morfologie van individuele cellen te visualiseren.
Time-lapse imaging van de rhombencephalon van een MG FP-gelabeld embryo onthult dat de celgedragingen die neuronale relaties in de zebravis aansturen zeer dynamisch zijn en het uitsteken van membraanuitstulpingen omvatten terwijl cellen migreren en intercolleren. We hebben u zojuist laten zien hoe u zowel gefixeerde als levende zebravisembryo's kunt prepareren voor single-cell imaging met een hoge resolutie. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een techniek voor hoge-resolutie beeldvorming van neurale cellen in zebravissembryo's met behulp van membraan-getarget Groen Fluorescerend Proteïne. De methode maakt de visualisatie van individuele cellen en hun dynamiek mogelijk, wat inzicht biedt in morfogenetische processen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de embryonale ontwikkeling is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- Beeldvormingstechnieken met een hoge resolutie zijn essentieel voor het bestuderen van de celmorfologie.
- Zebravisjes dienen als modelorganisme vanwege hun transparante embryo's.
- Membraangerichte fluorescerende eiwitten verbeteren de beeldvormingsmogelijkheden.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het labelen en in beeld brengen van neurale cellen in zebravissenembryo's.
- Het mogelijk maken van de visualisatie van celmorfologie en -dynamiek met een hoge resolutie.
- Het faciliteren van de studie naar morfogenetische processen tijdens de vroege ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Injectie van DNA dat codeert voor membraangegericht Green Fluorescent Protein in embryo's in het eencellige stadium.
- Mozaïekovererving maakt verbeterde beeldvorming van verspreide cellen mogelijk.
- Immunolabelling met anti-GFP voor gefixeerde preparaten.
- Live imaging met time-lapse videomicroscopie om cellulaire dynamiek waar te nemen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van de morfologie van individuele cellen in zebravissenembryo's.
- Dynamische beeldvorming van neurale cellen in levende embryo's.
- Confocale microscopie gebruikt voor beeldvorming van de rhombencephalon van de zebravis.
- Resultaten tonen de effectiviteit van de beeldvormingstechniek aan.
Conclusies
- De techniek biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling.
- Beeldvorming met een hoge resolutie kan inzichten verschaffen in de cellulaire dynamiek.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse studies binnen de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Celbeeldvorming met hoge resolutie in zebravissenembryo's maakt een nauwkeurige visualisatie van de morfologie en het dynamische gedrag van neurale cellen tijdens de vroege ontwikkeling mogelijk. Deze mogelijkheid ondersteunt mechanistische risicoreductie en doelwitvalidatie in onderzoekspijplijnen voor neuro-ontwikkeling. De benadering vergroot het voorspellend vertrouwen voor vroege ontdekkingsfasen en translationele studies met neurale systemen van gewervelden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar neurale morfogenese op enkelcelresolutie mogelijk voor de verduidelijking van signaalpaden.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de visualisatie van celoriëntatie en -migratie tijdens de neurulatie.
- Faciliteert functionele targetvalidatie door directe observatie van cellulaire gedragingen in vivo.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde zebravismodellen voor voor daaropvolgende assays op basis van imaging.
- Standaardiseert protocollen voor celmarkering en imaging voor reproduceerbare kwantitatieve resultaten.
- Maakt schaalbare screening mogelijk van genetische of farmacologische perturbaties die de neurale ontwikkeling beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante systemen door de vorming van de neurale buis bij gewervelden te modelleren.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via live- imaging en imaging van gefixeerd materiaal.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde vooruitgang door de cellulaire mechanismen te onthullen die ten grond liggen aan ontwikkelingsfenotypes.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze beeldgevingsmethodiek is geïntegreerd in het vroege continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en ondersteunt hypothesetesten en mechanistische studies naar de neurale ontwikkeling van gewervelden.
- Discovery Biology: Maakt hypothese-gestuurde analyse van neurale celgedragingen en morfogenetische processen mogelijk.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs voor comparatieve studies.
- Analytics: Levert high-content morfologische en dynamische readouts voor het vergelijken van condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen discovery-bevindingen en preklinische modellen van neurale ontwikkeling.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform voor diverse neuro-ontwikkelingsonderzoeken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurale targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert imaging-workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over verschillende studies heen.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door direct bewijs van cellulaire fenotypes te leveren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van neurodevelopmentale targets en modellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de hantering van zebravisembryo's en microinjectietechnieken.
- Toegang tot confocale microscopie en infrastructuur voor immunolabeling is noodzakelijk.
- Standaardisatie van beeldgevings- en labelingsprotocollen over teams heen is vereist.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende ontwikkelingsstadia of genetische achtergronden.
- Fotobleken en mozaïekexpressie zijn praktische beperkingen om rekening mee te houden.
