Flash Invriezen en Cryosectioning E12.5 hersenen van muizen

Hallo, ik ben Spencer Curley van de University of California Irvine en het laboratorium van Ed Maki, en ik ga demonstreren hoe cryosectie wordt uitgevoerd. Hiervoor gebruik ik eerst deze veelgebruikte reagentia. Het insluitmiddel of de inbeddingsmedia die ik gebruik, wordt OCT genoemd, wat staat voor optimal cutting temperature.

Het is een heldere oplossing, zeer dik en viskeus, en het houdt het weefsel goed vast terwijl u het kunt oriënteren waarna het bevriest; uiteindelijk is het wateroplosbaar, zodat u het tijdens elke vorm van kleuringsprocedure kunt verwijderen. Daarom bedrijf ik het weefsel in een mal. Deze cryomallen voor biopsiecontainers zijn verkrijgbaar in verschillende formaten.

Ik gebruik hier deze kleinere mal omdat ik embryonaal weefsel van muis gebruik. We vriezen ons weefsel snel in met vloeibare stikstof. Eerst vul ik deze beschermende vacuümfles met vloeibare stikstof uit onze tank hier.

Voordat het weefsel snel wordt ingevroren, moet het weefsel worden cryoprotecteerder; anders zal het vriesproces zelf het weefsel vernietigen. Hiervoor wordt het weefsel gedurende één nacht ondergedompeld in een 30% sucrose-oplossing. Als dit langer duurt, is dat geen probleem, zolang het weefsel maar zinkt.

En zoals u kunt zien, zijn de koppen van muizenembryo's van embryonale dag 12,5 gezonken in de sucrose-oplossing, waardoor ze klaar zijn om te worden ingevroren. Ik zal nu het weefsel dat in de sucrose-oplossing staat simpelweg overgieten in een grotere schaal, zodat ik het weefsel kan manipuleren. Ik neem wat van deze OCT en giet het in deze schaal van 35 millimeter, die eigenlijk op zijn deksel rust zodat ik deze schuin kan houden.

Zo verzamelt het OCT zich langs de rand voor de diepte. Daarom gebruik ik een paar oudere, stompe pincetten, simpelweg omdat ze niet scherp hoeven te zijn en ik geen ander paar pincetten wil beschadigen. Ik neem ze en til een van deze koppen heel voorzichtig op, en plaats deze in dit eerste OCT-bad.

Ik wil het embryo alleen coaten met OCT. Dit zorgt voor een betere en gelijkmatigere invriezing van het weefsel. Er mag geen residu van sucrose rond het weefsel aanwezig zijn en er mogen geen luchtbellen ontstaan.

Vermijd absoluut luchtbellen. Ik roer het OCT voorzichtig rond en onder het hoofd, beweeg het hoofd door het OCT en laat het daar enkele seconden rusten terwijl ik mijn cryovorm vul. Nu ga ik de cryovorm vullen met het OCT, waarbij ik opnieuw bellen vermijd.

En ik ga het vullen tot aan de bovenkant van de vorm. En zoals u zult merken, heb ik de vorm gelabeld, zodat ik mijn oriëntatie kan bepalen nadat deze is ingevroren.

Wanneer het OCT bevriest, wordt het wit en kunt u uw weefsel niet meer zien. Daarom is het essentieel om de cryovorm te markeren met een permanente marker.

Ik had inderdaad een luchtbel in het OCT, dus ik ga mijn pincet gebruiken om deze over de rand weg te duwen. Je wilt niet dat dit het invriezen van je weefsel verstoort. Nu ga ik de kop vanuit deze schaal overbrengen naar het OCT in mijn mal.

Ik til het nu voorzichtig uit de schaal en plaats het zeer behoedzaam in het malletje. Vervolgens ga ik naar de microscoop om het weefsel te oriënteren. Ik heb het weefsel hier in mijn cryomalletje en ik zal door de microscoop kijken om de oriëntatie te bepalen.

Ik ga coronale doorsneden maken door deze muizenkop. Daarom moet ik deze zo oriënteren dat ik hem in de cryostaat kan positioneren voor coronale doorsneden. Opnieuw gebruik ik deze oude, stompe pincetten en zoals u kunt zien, zitten hier enkele luchtbellen die ik zo goed mogelijk probeer te verwijderen.

Maar deze kleinere belletjes zijn niet erg. Ik heb niets gemerkt bij deze kleinere belletjes. Je wilt alleen geen grote bellen.

Ik zal ze dus zo goed mogelijk verschuiven en de pincet zeker vaak afvegen, omdat je op die manier bellen beter kunt voorkomen. En als je mijn markeringen kunt zien, heb ik hierboven een T staan en links van me een F. Dat geeft voor mij aan dat de kop, de bovenkant van de kop, naar boven gericht is en de voorkant of het gezicht naar links wijst.

Op die manier weet ik welk oppervlak ik moet doorsnijden voor coronale coupes en verschuif ik het weefsel slechts een klein beetje. En wederom: soms ontstaan er luchtbellen en die wil je er gewoon uitdrukken, zodat ze niet samen met het weefsel bevriezen. Het is ongunstig om luchtbellen te hebben, voornamelijk omdat luchtbellen in het weefsel tijdens het vriezen kunnen leiden tot een inconsistente bevriezing.

Het doel van het vriesdrogen (flash freezing) is om alles tegelijkertijd te laten bevriezen. Bovendien, wanneer u door het weefsel snijdt met de cryostaat, kan het mes in een luchtbel terechtkomen in plaats van in de OCT of het weefsel, wat een hapering of een scheur kan veroorzaken en uw weefsel kan beschadigen of kapotmaken. U wilt deze luchtbellen dus absoluut vermijden.

Vooral de grotere. Dus ik ben het hier nog aan het oriënteren. Dit weefsel is gedurende 24 uur gefixeerd, dus het is vrij stevig bij mijn manipulaties.

Ander weefsel kan iets zachter zijn, dus wees zeer voorzichtig. Zodra ik het onder de microscoop heb geplaatst met het gezicht naar links en de bovenkant van het hoofd omhoog, moet ik controleren of de positionering in de overige oriëntatievlakken ook correct is. Daarom til ik het op en bekijk ik alle zijden van het blokje om er zeker van te zijn dat het juist ligt.

En ik zie dat het iets naar beneden is gebogen, dus ik moet het gewoon met mijn pincet optillen. Oké? En dit vergt absoluut veel oefening. Oké, het ziet er goed uit.

Ik ga nu naar deze plek lopen en het weefsel invriezen in vloeibare stikstof. Nu het weefsel correct is georiënteerd in de cryovorm, ga ik de vloeibare stikstof in deze schaal gieten. Dit is gewoon een normale plastic Petrischaal voor weefselkweek, tot aan de rand gevuld.

Het verdampt vrij snel. Ik ga mijn pincet gebruiken om de cryovorm te laten zakken. En zoals u kunt zien, heb ik de onderste rand eigenlijk omgebogen.

Dat zorgt zeker voor een betere hantering. Ik ga het invriezen. En zodra het weefsel en het OCT bevriezen, wordt het egaal wit.

En zodra dit voltooid is, zal alles wit zijn. Vervolgens moet ik het bevroren weefsel snel in de vriezer van -80 °C plaatsen voor bewaring. Houd het zo vast dat het weefsel niet ondergedompeld raakt.

U moet dus heel voorzichtig zijn en het alleen net aan het oppervlak van de vloeibare stikstof houden. Oké, nu is het bevroren. Houd het daar nog enkele seconden vast voordat ik het naar de -80 °C verplaats.

Oké, nu ga ik het naar -80 °C brengen. Ik heb mijn weefsel uit de -80 °C gehaald en in deze cryostaat geplaatst. De kamer is inmiddels afgekoeld tot -24 °C.

Op dit moment moet u het weefsel ongeveer een half uur tot een uur laten equilibreren voordat u kunt beginnen met het snijden. Anders is het te broos. Omdat alle cryostaten verschillen, zal ik enkele basisaspecten van dit specifieke apparaat toelichten.

We maken gebruik van de Leica CM 30 50 s. Dit is een goed apparaat omdat het beschikt over een aparte koelunit voor het specimen zelf, wat een mooi extra voordeel is. De temperatuur van het specimen kan worden ingesteld, aangezien verschillende weefsels verschillende temperaturen vereisen voor het snijden.

Wanneer u uw weefsel voor het eerst plaatst, moet u verschillende aanpassingen maken. Deze zijn vergelijkbaar bij alle cryostaten. Sommige hiervan zijn elektronisch, andere worden handmatig bediend.

U moet bijvoorbeeld de arm van de cryostaat intrekken of naar voren bewegen om deze verder van of dichter bij het mes te positioneren. Dit kan snel of langzaam gebeuren. Met deze plus- of minknop kunt u de dikte van de coupes instellen.

Vervolgens selecteert u tussen trim- of sectiedikte, wat wordt aangegeven via de middelste knop hier. U stelt de temperatuur van de kamer of het monster zelf in naast dit digitale display door simpelweg op deze knop te drukken en de pijltoetsen omhoog of omlaag te gebruiken om de temperatuur aan te passen. Voor ons, wanneer we cryosecties uitvoeren, gebruiken we deze Fisher brand Super frosts plus microscoopglaasjes.

Ze zijn gecoat met een kleefstof zodat het weefsel tijdens de verwerking niet loslaat. Soms zul je tijdens het snijden merken dat het weefsel wat zacht lijkt; een indicatie hiervan is wanneer het weefsel het mes raakt en gaat kreukelen. Om dit op te lossen kun je deze Fisher brand super friendly freeze gebruiken.

Het, het vriest het weefsel razendsnel in; je richt het simpelweg op het weefsel en knijpt in de trekker, waarna het weefsel snel opnieuw wordt ingevroren als het te zacht is. Voordat we het weefsel op een houder voor sectionering monteren, wil ik jullie kort meenemen langs enkele onderdelen van de machine. Hier plaats je het mes, dat met deze metalen plaat wordt vastgezet.

Door deze arm omhoog te trekken, kunt u het mes naar behoefte verwijderen en vervangen. Zorg ervoor dat het stevig vastzit. Zet het mes niet te strak vast, anders kan het vervormen.

En u zult merken bij het snijden dat de weefseldikte niet consistent is. U moet deze arm dus niet helemaal naar beneden duwen. U wilt hem precies zo instellen dat hij ongeveer op gelijke hoogte met het mes zelf staat.

Dit is nog een onderdeel dat u mogelijk tijdens het doorsnijden moet afstellen. Dit wordt de anti-rolplaat genoemd. Het is een glasplaatje dat in deze houder past en dat u kunt afstellen met deze geveerde schroef.

En u beweegt het in feite naar voren of naar achteren. Dit houdt uw weefsel of uw coupes vlak, zodat u ze op een objectglas kunt monteren. Een ander aspect dat u tijdens het coupesnijden wellicht wilt aanpassen, is de positie op het mes die het eigenlijke snijden uitvoert.

Om dit aan te passen, tilt u simpelweg deze hendel op, waarna u het gehele mechanisme naar links of rechts kunt schuiven. Dit doet u eigenlijk alleen als u merkt dat uw weefsel blijft haken aan een bepaald deel van het mesje, of als u mesjes wilt besparen omdat deze vrij duur zijn. Door dit naar voren en achteren te bewegen, kunt u eenvoudig een schoon gedeelte vinden.

Een ander aspect dat u kunt aanpassen is de snijhoek. Aan de zijkant, die u nu niet kunt zien, bevinden zich drie verschillende posities. Wij maken gebruik van de middelste positie; u kunt dit aanpassen door deze andere hendel op te tillen.

En, en dat kan, u kunt dit mechanisme omhoog en omlaag bewegen. We houden het altijd in het midden. Dus ik laat het nu zo staan.

Dit gedeelte hier is de kop van de cryostaat. Hierin wordt het bevroren weefselmonster gehouden tijdens het snijden. De kop beweegt op en neer en schuift richting het mes.

In principe monteert u het weefsel op deze houder en plaatsen we de houder in de kop, draaien we deze vast en gebruiken we vervolgens deze knoppen aan de achterzijde om de hoek aan te passen voor een rechtere snede. Ik ga nu het weefsel op de houder monteren. Houd de houders op kamertemperatuur, omdat u eerst een laag OCT toevoegt en u wilt niet dat deze onmiddellijk bevriest, zodat er een mooie vlakke laag ontstaat.

En we zullen dit apparaat hier gebruiken, het wordt een hitte-extractor genoemd. Eigenlijk zal het worden gebruikt om het OCT af te vlakken terwijl het bevriest. Dus wat ik eerst doe, is dat ik het blok op kamertemperatuur neem en het in deze houder plaats.

Neem een deel van mijn OCT-bellen. Dat maakt hier niet uit, want ze worden eruit geknepen. Voeg gewoon een klein beetje toe; er is niet veel nodig.

Neem de warmte-extractor en plaats deze direct op die positie. Wacht enkele seconden. Daarna is te zien dat de OCT mooi vlak is.

Nu ik het weefsel heb, moet ik het OCT-blok markeren. Ik markeer een punt op het OCT om de positie aan te geven. Daar heb ik nu de bovenkant met een blauwe stip gemarkeerd.

Ik haal nu het weefselblok uit de mal door tegen de achterkant te duwen. Ik duw voorzichtig tegen de achterkant aan om het in mijn hand te duwen, maar ik wil voorkomen dat het ontdooit. Daarom plaats ik het direct terug.

Nu ziet u het weefselblok met de blauwe markering die ik erop heb geplaatst. Zo weet ik dat dit de bovenkant van de kop van het embryo is. Ik wil coupes maken door het gezicht, aangezien dit coronale doorsneden zijn.

Ik voeg nu nog een grote druppel OCT toe, en ik moet snel handelen omdat alles koud is. Vervolgens neem ik het weefsel en plaats dit precies in het midden, waarbij ik erop let dat het plat op de reeds aangebrachte OCT-bodem ligt. Nu laat ik dit bevriezen, wat ongeveer een minuut of twee zal duren.

Het invriezen is nu voltooid. Ik ga nu het weefsel dat op de houder is gemonteerd in de kop plaatsen, het zo recht mogelijk uitlijnen en vervolgens vastzetten. Het moet stevig vastzitten.

Ik plaats het vlak voor het mes en schuif het dan naar voren, wat enkele seconden kan duren. Oké, nu gebruik ik de platte zijde van het mes om het weefsel zeer nauwkeurig te positioneren. Ik kijk simpelweg naar de rand en beweeg het weefsel op en neer om er zeker van te zijn dat de randen precies uitlijnen.

Als dat niet het geval is, weet u dat het er ongeveer zo uit kan zien. Ik overdrijf het hier uiteraard, maar u kunt hier zien dat het niet recht tegen het mes aan staat. Daarom blijf ik aanpassingen maken totdat ik het gevoel heb dat het zo recht mogelijk staat.

Ik denk dat het zo goed is. Dus ik kijk vanuit elke hoek om er zeker van te zijn dat het weefsel recht tegen het mes aan zal snijden en ik gebruik de rand van het mes om dat aan te geven. Ik kijk dus van bovenaf en vanaf de zijkant, en het weefsel ziet er eigenlijk vrij goed uit.

Ik hoef niet veel aanpassingen te maken, maar als dat wel het geval zou zijn, zou ik gewoon de knoppen aan de achterzijde van de kop gebruiken. Door deze naar links of rechts te draaien, is te zien dat er op die manier fijne afstellingen kunnen worden gemaakt. Maar het ziet er redelijk goed uit.

Nu ben ik het weefsel aan het voortbewegen. Het wordt nog niet gesneden omdat het nog niet tegen het mesje aan ligt. Het weefsel is diep ingebed in het OCT.

Het kan dus enkele minuten duren voordat het weefsel is bereikt. U wilt niet te snel gaan, omdat het OCT en uw weefsel dan kunnen haken en scheuren, maar u wilt ook niet te langzaam gaan, omdat het anders zeer lang kan duren. Deze machine heeft een handige functie waarmee u kunt trimmen met een dikker segment, waardoor u sneller kunt werken.

Ik snijd nu door het OCT-medium, dus ik vertraag mijn tempo een beetje. Ik ben nog niet bij het weefsel aangekomen, maar dit is het moment waarop ik inschat hoe het snijden zal verlopen. Veel variabelen kunnen ervoor zorgen dat het snijden van het weefsel zeer goed of juist zeer slecht gaat.

Wat ik het vaakst merk bij deze cryostaat is dat het weefsel eigenlijk iets te koud is. Ik heb de temperatuur verlaagd, maar het lijkt nog steeds een beetje te koud te zijn. Wat er dan gebeurt, is dat het mes gaat klapperen tijdens het snijden door het weefsel en door het OCT.

Zo ontstaan er kleine lijnen, horizontale lijnen door het OCT. Wat ik doe, is mijn duim gebruiken om de rand simpelweg op te warmen, het OCT op te warmen door het voorzichtig aan te raken en mijn duim te laten glijden, niet voor heel lang. En wanneer ik er vervolgens coupes van maak, merk ik dat ze veel beter uitvallen en dat het klapperen is gestopt.

Dit zijn dus de zaken die ik beoordeel voordat ik aan het weefsel begin. Ik heb gemerkt dat er, terwijl het mes door het weefsel gaat, een hapering of eigenlijk een scheur in het OCT ontstaat. Daarom is een van de eerste dingen die ik doe het vervangen van het mes.

Ik weet niet hoe lang dit mesje hier al op zit en wie het voor mij heeft gebruikt, dus ik ga gewoon een nieuw mesje pakken. Deze zijn overduidelijk erg scherp, dus je moet voorzichtig zijn. Ik ga nu de anti-rolplaat instellen; onderaan zit een veerbelaste schroef die je van onderaf kunt bereiken om de plaat naar binnen of buiten te bewegen.

Ik ben nu ver genoeg doorgegaan met het doorsnijden zodat ik het weefsel heb bereikt. Helaas is er een scheur ontstaan in het OCT-blok; dit gebeurt vaak en is helaas niet echt te voorkomen, maar er zijn wel stappen die je kunt ondernemen om dit te herstellen. Als de scheur door het weefsel zelf zou lopen, moet het monster worden weggegooid of moet je proberen om te redden wat er nog mogelijk is.

In dit geval lijkt de scheur zich boven het weefsel te bevinden. Wat ik nu ga doen, is een scheermesje gebruiken dat in de cryostaat heeft gezeten. Het is afgekoeld.

En ik ga proberen om alleen het gebarsten gedeelte af te snijden, dat zich aan de bovenkant van het OCT-blok bevindt. Dus opnieuw zal ik mijn duim gebruiken om het oppervlak van het OCT-blok op te warmen. Daarna ga ik coupes maken, en zoals u hier kunt zien, is het gebarsten.

Vervolgens heb ik het stukje met het weefsel verwijderd en de rest van de OCT, het gebarsten gedeelte, simpelweg weggegooid. Wat ik nu ga doen, is proberen dat gebarsten gedeelte af te snijden met een gekoeld scheermesje. Ik moet hierbij heel recht naar binnen gaan, beide handen gebruiken en gelijkmatige druk op het mesje uitoefenen.

Vervolgens beweeg ik het mesje heen en weer in het OCT. Terwijl ik het mesje heen en weer beweeg, snijd ik langzaam in het OCT. Hopelijk verwijder ik hiermee het gebarsten deel.

Oké, ik ga nu het overtollige OCT verwijderen door het weg te snijden. Oké, dat ziet er goed uit. Vervolgens trek ik de kop iets terug, omdat ik randen heb gecreëerd die aan het mes kunnen blijven haken; als dat gebeurt, zou het OCT en het weefsel kunnen afbreken, wat mijn monster zou ruïneren.

Ik ben dus teruggetrokken, dus ik zal iets verder moeten gaan om weer in het weefsel te komen en hopelijk heb ik de scheur gecorrigeerd. Oké, nu ga ik weer terug in het weefsel. Oké, het lijkt erop dat ik het heb gecorrigeerd.

Er zijn dus geen scheuren meer in het OCT, waardoor het afnemen van de coupes veel gemakkelijker zal gaan. Nu ga ik naar het deel van het weefsel gaan dat voor mij van belang is. Op dit moment bereik ik net het oppervlak en wil ik doordringen tot de hersenen van dit embryo.

Deze zijn groot genoeg zodat ik daadwerkelijk de structuren kan zien waarin ik geïnteresseerd ben. Ik ben vergeten te vermelden dat ik deze borstels gebruik om het mesje schoon te maken tussen elke sectie die ik ga vastleggen. Deze grote borstel is enkel bedoeld om het gebied schoon te maken en het overtollige OCT te verwijderen.

Ik gebruik deze fijnere penselen ook om de sectie tegen deze koude plaat hier te manoeuvreren om deze te positioneren wanneer ik deze vastzet op de coupesnijmachine. Ook deze worden koud gehouden, zodat het OCT niet smelt en aan de penselen blijft kleven. Om het weefsel vast te zetten, ga ik eerst het OCT en het weefsel met mijn duim verwarmen.

Vervolgens neem ik een van deze objectglazen die ik al heb gelabeld. Ik houd het objectglas ondersteboven; iedereen doet dit op een andere manier. De manier waarop ik het doe, is dat ik met mijn rechterhand de rechterbovenhoek vasthoud terwijl het objectglas naar beneden is gericht.

Gebruik vervolgens mijn linkerduim als draaipunt, zodat ik recht naar beneden tegen het plaatje kan gaan om het coupesje op te vangen. Het OCT en het weefsel zullen daadwerkelijk smelten tegen het objectglas en zichzelf bevestigen. Dus eerst warm ik het weefsel langzaam op met mijn duim, snijd ik de coupe, pak ik mijn objectglas, houd ik de rechterhoek vast met mijn rechterhand, verplaats ik het plaatje, laat ik het recht naar beneden zakken en laat ik het smelten.

Ik controleer het weefsel om er zeker van te zijn dat er geen plooien of luchtbellen aanwezig zijn en dat het er goed uitziet. Dit blijf ik doen totdat ik door de hele hersenen heen heb gesneden. Ik bekijk de coupes nu via de dissectiescoop om te controleren of ze er goed uitzien, en dat is het geval; u kunt de voorhersenen bovenaan de coupe zien en ze zien er allemaal zeer goed uit.

Deze cryosneden kunnen worden gebruikt voor toepassingen zoals in situ hybridisatie. Soms voeren we basis-histologie uit, zoals H&E-kleuringen. Daarnaast kunnen immunofluorescentie en diverse soortgelijke assays worden uitgevoerd.

Voor mij in het bijzonder werden deze secties gefixeerd en verwerkt voor in situ hybridisatie. Dat is wat ik vervolgens ga doen.