Flash Invriezen en Cryosectioning E12.5 hersenen van muizen
May 28th, 2007
Aangetoond in deze video zijn de technieken voor flash invriezen en snijden embryonale hersenweefsel van de muis. Nuttige tips voor het gebruik van de cryostaat worden gegeven, waaronder het oplossen van problemen methoden die gebruikt kunnen worden tijdens het snijden om ervoor te zorgen dat de resulterende weefsel secties zijn vrij van scheuren en andere vervormingen.
Hallo, ik ben Spencer Curley van de University of California Irvine en Ed Maki's Lab, en ik ga demonstreren hoe cryosectionering wordt gedaan. Om dat te doen, gebruik ik eerst deze veelgebruikte reagentia. De inbeddingsverbinding of inbeddingsmedium die ik gebruik, wordt OCT genoemd voor optimale snijtemperatuur.
Het is een heldere oplossing, het is erg dik en stroperig, en het houdt het weefsel mooi vast terwijl je het kunt oriënteren en het vervolgens bevriest, en uiteindelijk is het wateroplosbaar, dus je kunt er vanaf komen tijdens elk type kleuringsprocedure. Dus ik bedek het weefsel in een mal. Deze cryo mal biopsiecontainers zijn er in verschillende maten.
Ik ga deze kleinere mal hier gebruiken omdat ik embryonaal weefsel van muis doe. We bevriezen ons weefsel in vloeibaar stikstof. Dus eerst ga ik deze beschermende vacuümkolf vullen met vloeibaar stikstof van onze tank hier.
Voordat je het weefsel bevriest, moet je wat cryo-bescherming van het weefsel noemen, anders zal het bevriezen zelf het weefsel vernietigen. Dus wat je doet is het weefsel in een 30% sucrose-oplossing een nacht laten zakken. En als het langer duurt, is dat oké, zolang het weefsel maar zakt.
En zoals je kunt zien, zijn de embryonale dag 12,5 muiskoppen gezonken in de sucrose-oplossing, dus ze zijn klaar om bevroren te worden. Dus nu ga ik het weefsel dat zich in een sucrose-oplossing bevindt, in een grotere schaal gieten die ik heb, zodat ik het weefsel kan manipuleren. Ik ga wat van deze OCT nemen en in deze 35 millimeter schaal gieten die eigenlijk op zijn deksel rust, zodat ik het onder een hoek kan krijgen.
Dus de OCT verzamelt zich langs de rand voor diepte. Dus ik gebruik een paar oudere stompe pincetten, gewoon omdat je ze niet scherp hoeft te maken en je geen andere paar pincetten wilt verpesten. Dus ik neem ze en til een van deze hoofden heel voorzichtig op en plaats het in dit eerste bad van OCT.
Ik wil alleen het embryo in OCT coaten. Dit zorgt voor een betere, meer uniforme bevriezing van het weefsel. Je wilt geen resterende sucrose rond het weefsel of luchtbellen.
Vermijd zeker luchtbellen. Dus ik ben bezig met het OCT voorzichtig rond en onder het hoofd te roeren, het hoofd door het OCT te bewegen en het daar een paar seconden te laten staan terwijl ik mijn cryo mal vul. Dus nu ga ik de cryo mal vullen met de OCT, opnieuw, en probeer geen luchtbellen te maken.
En ik ga het gewoon tot aan de bovenkant van de mal vullen. En zoals je zult merken, heb ik de mal gelabeld. Dus ik zal, ik zal mijn oriëntatie kunnen zien nadat het bevroren is.
Wanneer de OCT bevriest, wordt het wit en je kunt je weefsel niet meer zien. Dus je wilt het zeker in een permanente marker markeren, de cryo mal.
Ik heb eigenlijk een luchtbel in de OCT gekregen, dus ik ga mijn pincetten gebruiken om het gewoon over de rand te duwen. Je wilt niet dat het de bevriezing van je weefsel verstoort. Dus nu ga ik het hoofd van deze schaal in het OCT overbrengen dat zich in mijn mal bevindt.
Ik ga het uit de schaal tillen en heel voorzichtig in de mal plaatsen. Dan ga ik naar de microscoop waar ik het weefsel zal oriënteren. Ik heb het weefsel in mijn cryo mal hier en ik ga door de scope kijken zodat ik het kan oriënteren.
Ik ga coronale secties doen door dit muiskop. Dus ik moet het oriënteren zodat ik het in de cryostaat kan plaatsen voor coronale secties. Dus nogmaals, ik gebruik deze oude stompe pincetten en zoals je kunt zien, zijn er hier wat luchtbellen en ik ga mijn best doen om ze eruit te krijgen.
Maar deze kleinere luchtbellen zijn niet slecht. Ik heb niets opgemerkt met deze kleinere luchtbellen. Je wilt gewoon geen grote luchtbellen.
Dus ik ga ze zo goed mogelijk verwijderen en veeg de pincetten vaak schoon omdat je op die manier beter luchtbellen kunt voorkomen. En nu als je mijn label kunt zien, heb ik een T hierboven en een F naar mijn linkerkant hier. Dat geeft me alleen aan dat het hoofd, de bovenkant van het hoofd, omhoog gaat en de voorkant of het gezicht naar mijn linkerkant gaat.
Op die manier weet ik welke oppervlakte ik moet doorsnijden voor coronale secties en ik duw het weefsel gewoon. En nogmaals, soms introduceert dat luchtbellen en je wilt ze gewoon verwijderen zodat ze niet naast het weefsel bevriezen. Dus het is slecht om luchtbellen te hebben, vooral omdat wanneer je bevriest, kunnen weefselbubbels ongelijkmatige bevriezing veroorzaken.
Het doel van het bevriezen is om alles tegelijk te bevriezen. Ook wanneer je door het weefsel snijdt en de cryostaat, als het mes door een luchtbel gaat in plaats van door de OCT of het weefsel, kan het een hapering of scheur veroorzaken en je weefsel vernietigen of breken. Dus je wilt deze luchtbellen ten koste van alles vermijden.
Vooral de grotere. Dus ik ben het hier nog aan het oriënteren. Dit weefsel is 24 uur gefixeerd, dus het is behoorlijk stevig voor mijn manipulaties.
Ander weefsel kan een beetje zachter zijn, dus je wilt gewoon heel voorzichtig zijn. Dus zodra ik het onder de microscoop heb gepositioneerd met het gezicht naar links en de bovenkant van het hoofd omhoog, moet ik ervoor zorgen dat het ook goed is in andere oriëntatie-vlakken. Dus ik ga het opnemen en door alle gezichten van de kubus kijken om er zeker van te zijn dat het goed is.
En ik zie dat het iets naar beneden is gekanteld, dus ik moet het gewoon met mijn pincetten optillen. Oké? En dit vergt echt veel oefening. Oké, het ziet er goed uit.
Nu ga ik hierheen en het in vloei
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze video demonstreert technieken voor het snel bevriezen en doorsnijden van embryonaal hersenweefsel van muizen. Het geeft nuttige tips voor het gebruik van een cryostaat, inclusief oplossingen voor problemen om ervoor te zorgen dat weefselsneden vrij zijn van scheuren en vervormingen.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Weefselverwerking
- Cryosectioneringtechnieken
Achtergrond
- Embryonaal hersenweefsel vereist zorgvuldige behandeling voor effectieve analyse.
- Cryosectionering is een cruciale techniek in neurowetenschappelijk onderzoek.
- Juiste inbedding en bevriezingstechnieken zijn essentieel voor hoogwaardige weefselsneden.
- Veelvoorkomende problemen tijdens het doorsnijden kunnen de integriteit van de monsters beïnvloeden.
Doel van de Studie
- Om effectieve methoden voor cryosectionering van hersenweefsel te demonstreren.
- Om oplossingen te bieden voor veelvoorkomende problemen die tijdens het proces worden ondervonden.
- Om de kwaliteit van weefselsneden te verbeteren voor latere analyse.
Gebruikte Methoden
- Gebruik van OCT (Optimal Cutting Temperature) inbeddingsmiddel.
- Inbedding van weefsel in cryo mold biopsie containers.
- Snel bevriezingstechnieken voor het behoud van de weefselintegriteit.
- Gebruik van een cryostaat voor het doorsnijden.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle demonstratie van cryosectioneringtechnieken.
- Verstrekking van praktische tips voor het effectief gebruik van een cryostaat.
- Identificatie van veelvoorkomende oplossingen voor problemen.
- Er is voor gezorgd dat de resulterende weefselsneden vrij zijn van vervormingen.
Conclusies
- Effectieve cryosectionering is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Juiste technieken kunnen de kwaliteit van weefselmonsters aanzienlijk verbeteren.
- Begrip van veelvoorkomende problemen en oplossingen verbetert onderzoeksresultaten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Cryosectioning of embryonic mouse brain tissue enables high-fidelity preservation of neuroanatomical structures for downstream molecular assays. This technique supports target validation workflows by providing reproducible tissue sections suitable for in situ hybridization and immunohistochemistry. Reliable sectioning reduces technical variability, improving data confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial gene expression patterns in developing brain regions.
- Operational Value: Standardized embedding and freezing protocols minimize sectioning artifacts.
- Predictive Value: High-quality sections support accurate target localization and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces consistent tissue sections for biomarker screening and assay optimization.
- Operational Value: OCT embedding facilitates uniform section adhesion to slides, reducing loss during processing.
- Scalability: Cryostat temperature controls allow adaptation across tissue types and section thicknesses.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Preserves embryonic brain architecture for correlating molecular findings with developmental phenotypes.
- Operational Value: Flash freezing in liquid nitrogen prevents ice crystal formation that compromises section integrity.
- Translational Continuity: Sections support validation of targets identified in vitro or in silico models.
Pipeline & Workflow Integration
Cryosectioning bridges discovery biology and assay development by generating tissue sections ready for molecular profiling. The method supports lead identification through spatially resolved target engagement studies. Enterprise reuse is enabled by standardized cryostat setup and troubleshooting protocols.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via spatial mapping of gene expression in embryonic brain.
- Screening: Enables reproducible section preparation for high-sensitivity detection assays.
- Analytics: Facilitates quantitative image analysis by minimizing section thickness variability.
- Translational Research: Connects early target findings to preclinical models through conserved neuroanatomical references.
- Enterprise Reuse: Cryostat optimization practices are transferable across projects and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of sectioning artifacts improves data reliability for target validation.
- Operational Value: Standardized OCT embedding and freezing enhance lab-to-lab reproducibility.
- Strategic Value: Enables confident go/no-go decisions based on spatially resolved target data.
- Portfolio Impact: Reduces risk of false negatives in target engagement studies due to sectioning failure.
Implementation Considerations
- Technical expertise in tissue orientation and cryostat blade adjustment.
- Access to liquid nitrogen and -80°C storage for tissue preservation.
- Standardized OCT embedding protocols to prevent bubble formation.
- Routine blade maintenance and anti-roll plate alignment to prevent section tearing.
- Temperature equilibration protocols to avoid brittle or soft tissue during sectioning.
