Name: De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer de voorbereiding van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie met lectine-coating en immunokleuring. Dit protocol verbetert de visualisatie van celstructuren en eiwitlokalisatie voor genfunctieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door het National Cancer Institute P30 CA23074, de American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31, en van de Univ. van Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Voor de celbiologie veld, zou een ideaal systeem goedkoop te onderhouden, gemakkelijk te manipuleren, en vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken. Drosophila S2 cellen voldoen aan deze eisen, en dus ze hebben het systeem van de keuze snel te worden voor een groeiend aantal van de cel biologie labs. We hebben presenteerde een kort overzicht van de methoden om S2 cellen voor te bereiden op microscopie. Een opmerkelijk hoofde van S2 cellen is het feit dat ze goed groeien in een ...

<table><tbody><tr><td>S2-cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2-cellen</td><td>DGRC</td><td>voorraadnummer 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2-cellen</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s S2-medium</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Voeg 10% (eindconcentratie) hitte-geïnactiveerd FBS toe om een compleet medium te maken.</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>hitte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>100x antibioticumoplossing</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>bevat penicilline (10000 U/mL),&lt;br/&gt;streptomycine (10000 &amp;#x03BC;g/mL), en&lt;br/&gt;amfotericine B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavaline A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>32% oplossing</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anhydrisch, ACS-grade</td></tr><tr><td>Moleculaire zeven</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>type 3A</td></tr></tbody></table>

de voorbereiding van drosophila s2 cellen voor lichtmicroscopie

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

De ideale experimentele systeem zou zijn goedkoop en gemakkelijk te onderhouden, vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken, en zou worden ondersteund door een uitgebreide literatuurstudie en de genoomsequentie database. Gekweekte Drosophila S2 cellen, het product van gedistantieerd 20-24 uur oude embryo&#39;s 1, bezitten al deze eigenschappen. Bijgevolg, S2 cellen zijn uitermate geschikt voor de analyse van cellulaire processen, waaronder de ontdekking van de genen die coderen voor de moleculaire componenten van het proces of mechanisme van belang. De kenmerken van S2 cellen die het meest verantwoordelijk zijn voor hun nut zijn het gemak waarmee ze worden onderhouden, hun gevoeligheid voor exquise dubbelstrengs (ds) RNA-gemedieerde interferentie (RNAi), en hun volgzaamheid aan fluorescentie microscopie als live of vaste cellen. S2 cellen kunnen worden gekweekt in een verscheidenheid aan media, waaronder een aantal goedkope, in de handel verkrijgbare, volledig gedefinieerd, serum-vrije media 2. Daarnaast, ze groeien optimaal en snel bij 21-24 ° C en kan worden gekweekt in een verscheidenheid van containers. In tegenstelling tot de cellen van zoogdieren, hoeft S2 cellen niet nodig een geregelde atmosfeer, maar in plaats daarvan doen het goed met normale lucht en kan zelfs worden gehandhaafd in verzegelde flessen. Als aanvulling op het gemak van RNAi in S2 cellen is de mogelijkheid om gemakkelijk experimenteel geïnduceerde fenotypes analyseren door fase of fluorescentie microscopie van vaste of levende cellen. S2 cellen groeien in de cultuur als een monolaag maar niet tonen contact remming. In plaats daarvan, cellen hebben de neiging om te groeien in kolonies in dichte culturen. Bij een lage dichtheid, S2 culturen geteeld op glas of weefselkweek behandelde plastic zijn rond en losjes bevestigd. Echter, de cytologie van de S2-cellen sterk verbeterd worden door hen ertoe te uitgebreid plat door kort kweken ze op een oppervlak bedekt met de lectine, Concanavaline A (ConA) 3. S2 cellen kunnen ook stabiel getransfecteerd worden met fluorescent-gemerkte markers te labelen structuren of organellen van belang in levende of vaste cellen. Daarom is de usual scenario voor de microscopische analyse van cellen is dit: ten eerste, S2-cellen (die kan bezitten transgenen te getagd markers te uiten), worden behandeld door RNAi naar een doelwit eiwit (s) te elimineren. RNAi behandeling tijd kan worden gecorrigeerd voor verschillen in eiwit-turn-over kinetiek en naar cel trauma / overlijden te minimaliseren als het doel eiwit is belangrijk voor de levensvatbaarheid. Vervolgens worden de behandelde cellen overgebracht naar een schotel met een dekglaasje aan pre-gecoat met ConA tot cellen te verspreiden induceren en strak houden aan het glas. Tot slot worden de cellen afgebeeld met de keuze van de onderzoeker van de microscopie modi. S2-cellen zijn bijzonder goed voor studies die uitgebreide visualisatie van levende cellen, omdat deze cellen gezond te blijven bij kamertemperatuur en normale atmosfeer.

Drosophila Schneider (S2)-cellen zijn een steeds populairder systeem voor de ontdekking en functionele analyse van genen. Ons doel is het beschrijven van een aantal van de microscopische technieken die S2 cellen te maken die een steeds belangrijker experimenteel systeem.

De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

Het ideale experimentele systeem zou goedkoop en gemakkelijk te onderhouden zijn, geschikt zijn voor een verscheidenheid aan technieken en ondersteund worden door een uitgebreide literatuur...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van de preparatie van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst glazen kweekschalen met een glazen bodem voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het coaten van de glazen bodem met het lectine Conval.A om de adhesie en afplatting van de S two-cellen te bevorderen. De derde stap van de procedure is het toevoegen van kweekmedium en S two-cellen aan de kweekschaal. De laatste stap van de procedure is het fixeren en immunokleuren van de S two-cellen in de kweekschaal.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de lokalisatie van fluoro-four-gelabelde of immuun-gelabelde eiwitten van belang aantonen via fluorescentiemicroscopie van respectievelijk levende of gefixeerde S2-cellen. Hallo, ik ben Joey Club van het laboratorium van Greg Rogers van de afdeling Cell Biology Anatomy aan de University of Arizona. Ik ben John Nye, ook van het Rogers Lab.En ik ben Dan Buster. Ik werk in het laboratorium van Greg Rogers. Vandaag laten we u een procedure zien voor het prepareren van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de regulatie van centraal duplicatie in Drosophila te bestuderen door veranderingen in het centrale aantal en de structuur te analyseren na eliminatie of overexpressie van belangrijke regulatoire eiwitten. Laten we beginnen. Wij gebruiken standaard 35 millimeter Petrischalen om onze schaaltjes met glazen bodem te maken.Deze schaaltjes met glazen bodem houden cellen in een conditie die zeer vergelijkbaar is met hun normale kweekcondities, en maken het mogelijk om levende cellen te onderzoeken via glas van microscopiekwaliteit. Voor de assemblage van de schaaltjes met glazen bodem wordt een afgeplakt oppervlak van een dikwandige piepschuimdoos als booroppervlak gebruikt. Plaats de onderste helft van een 35 millimeter Petrischaal op het booroppervlak met de onderkant van de schaal tegen de piepschuimdoos; houd de zijkanten van de schaal stevig vast en gebruik een handboor met een spadeboor van drie kwart inch om een gat door de schaal te boren.Nadat u alle schaaltjes heeft geboord, gebruikt u een kegelvormige slijpboor met een grove korrel en een diameter die ongeveer gelijk is aan die van de gatzaag om de buitenrand van de gaten glad te maken. Plaats de elektrische boormachine op zijn zijkant, waarbij de boor over de rand van het aanrecht steekt. Houd de boormachine op zijn plaats door er iets zwaars maar buigzaams op te leggen, zoals een stevige plastic zak met 10 kg zand.Gebruik de vergrendelknop om de boor continu te laten draaien. Maak de rand van uw schaaltje glad door deze vast te houden en tegen de freesboor te bewegen, zodat de ruwe rand van het nieuwe gat wordt weggeslepen. Nadat de buitenrand van de gaten is gladgemaakt, plaatst u de bodems van de schaaltjes in een groot bekerglas en spoelt u deze meerdere keren af met gedestilleerd water.Hiermee worden de kleine losse stukjes plastic of piepschuim verwijderd, die vervolgens zullen drijven. Leg de bodems van de schalen uit om te drogen. Wanneer de schalen droog zijn, bereid dan de Sard 180 4 lijm.Meng de hars en het hardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10 op 1 en roer grondig. Breng een kleine cirkel lijm aan rond het geboorde gat op het buitenoppervlak van elke schaal. Plaats vervolgens een dekglas over het gat in contact met de lijm.Het dekglas moet ongeveer een millimeter groter zijn dan het gat in de Petrischaal en kleiner dan de diameter van de schaal. Het dekglas moet glad en gelijkmatig op de schaal rusten. Zet de schalen nu opzij.Plaats de schaaljes met de onderkant naar boven om te drogen. Dit kan op kamertemperatuur een dag of langer duren, maar u kunt de uithardingssnelheid verhogen door de schaaljes in een warme incubator te plaatsen. Zodra de schaaljes droog zijn, kunnen ze worden gecoat met lectine concanavaline A of con A. Wij gebruiken con A omdat S two-cellen die op met con A gecoate dekglasjes worden geplaatst, zich uitgebreid zullen uitspreiden en uitstekende specimens voor microscopie worden.Om een glazen bodemschaaltje te coaten, verspreidt u 10 µL van de conne-oplossing over de bovenzijde van het glas. Steriliseer na het drogen het schaaltje en de stolp met UV-licht. Draai de onderdelen in een weefselkweekkast zo dat de binnenoppervlakken direct naar de UV-lamp zijn gericht en schakel het steriliserende UV-licht gedurende ten minste 45 minuten in.S two-cellen kunnen in verschillende media worden gekweekt. Voor onze doeleinden gebruiken we in VITROGEN SF 902-medium. Om RNAi-behandelde S two-cellen voor microscopie voor te bereiden, resuspendeer de cellen voorzichtig en breng ze over naar een met conne gecoate glazen bodemschaal met twee milliliters medium; gezonde cellen die in contact komen met het met conne gecoate dekglas zullen stevig hechten en beginnen zich uit te spreiden.Dit proces zou na ongeveer 15 minuten zichtbaar moeten zijn en zou na 45 minuten tot een uur voltooid moeten zijn. Aangezien S two-cellen eenvoudig in stand kunnen worden gehouden onder normale laboratoriumtemperatuur en atmosferische omstandigheden, zijn er geen speciale condities of apparatuur nodig wanneer de cellen onder de microscoop liggen om uitdroging te voorkomen; zorg dat er voldoende medium in de schaal op de microscoop blijft. Live-imaging van S two-cellen gedurende langere perioden is mogelijk.De looptijd van deze experimenten wordt enkel beperkt door de gebruikelijke problemen met fotobleken en fototoxiciteit. De S two-cellen kunnen worden gefixeerd op zowel een schaaltje met glazen bodem als op een gewoon dekglas. In deze video demonstreer we echter het fixeren en immunokleuren in een schaaltje met glazen bodem.Methanol en formaldehyde zijn twee veelgebruikte fixatiemiddelen voor S two cellen. Voor cel-fixatie met methanol wordt eerst ongeveer 300 milliliters anhydroos methanol in een afgedekt glazen bekerglas van één liter gekoeld in een explosieveilige vriezer op minus 20 degrees Celsius. Wanneer de methanol koud is, wordt deze uit de vriezer gehaald. Verwijder snel het medium uit de schaal met glazen bodem en dompel de schaal vervolgens rap in de methanol.Plaats het bekerglas met de schaal snel terug in de vriezer en fixeer de cellen gedurende 10 tot 15 minuten. Verwijder na 10 tot 15 minuten de schaal uit het bekerglas, giet het resterende methanol af en rehydrateer de cellen. Door PBST toe te voegen zijn de cellen nu klaar voor standaard kleuringsprocedures, zoals later zal worden gedemonstreerd voor celfixatie.Voor de fixatie gebruiken we 10% formaldehyde en buffer. Deze relatief hoge concentratie formaldehyde wordt gebruikt omdat S2-cellen geen cytoplasmatische intermediaire filamenten hebben, die anders zouden helpen bij het behoud van de celmorfologie en organisatie tijdens het fixatieproces. Fixeer de cellen in 10% formaldehyde gedurende 10 tot 15 minuten.Zodra de fixatie is voltooid, giet het formaldehyd af in een afvalbeker en was de gefixeerde cellen met drie korte wasbeurten met PBST. Begin de immunokleuringsprocedure door één milliliter blokkeringsoplossing aan de gefixeerde cellen toe te voegen gedurende 15 minuten. Wij gebruiken routinematig 5% normaal geiten serum in PBST.Giet de blokkeringsoplossing af en voeg het primaire antilichaam direct toe aan de cellen. Plaats het Petri-deksel terug op de schaal om verdamping van de antilichaamoplossing te voorkomen en laat het antilichaam 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen met de cellen. Verwijder na 30 minuten de primaire antilichaamoplossing.Gebruik een transferpipet om twee milliliters PBST aan de schaal toe te voegen en wacht vijf minuten voordat de PBST wordt vervangen. Was daarna drie keer met PBST. Voeg na de laatste wasbeurt 100 microliters secundair antilichaam rechtstreeks op de cellen toe.Plaats het deksel terug op de Petrischaal en laat het antilichaam 30 minuten incuberen met de cellen bij kamertemperatuur. Wanneer de 30 minuten voorbij zijn, wordt het secundaire antilichaam verwijderd en volgen er drie wasstappen van vijf minuten met PBST.Voeg ten slotte een paar druppels monteermedium direct op de cellen toe. Plaats het deksel van de Petri-schaal terug en bewaar de schaal, indien nodig, bij vier degree Celsius in het donker. Hier worden representatieve fasecontrastbeelden getoond van S two cellen na het uitplaten op een conval en een gecoate glazen bodemschaal, waarbij de getallen het aantal minuten na het uitplaten aangeven.Zelfafplatting is zichtbaar na 15 minuten en is in essentie voltooid na 60 minuten. Let op dat de cellen donkerder worden in fasecontrast terwijl ze zich afplatten op het gecoate dekglas. In deze vergrote afbeelding van gehechte cellen zijn hun uitgestrekte en afgeplatte randen, aangegeven door de pijl, duidelijk zichtbaar.S two-cellen kunnen worden getransfecteerd om fluorescentielabelled eiwitten tot expressie te brengen die structuren van belang markeren in gefixeerde cellen of levende cellen. In dit voorbeeld werden S two-cellen transient getransfecteerd met een fusieconstruct bestaande uit nucleo foin, een marker voor de nucleus, gefuseerd aan het fluorofoor EGFP. Deze cellen werden uitgeplaat op een met conna gecoate glazen bodemschaal en vervolgens gebeeld met DIC en epi-fluorescentie.Met RNAi behandelde S2-cellen kunnen ook gefixeerd en geanalyseerd worden via immunofluorescentie. Deze beelden tonen gefixeerde S2-cellen die immunogekleurd zijn voor de centrale marker PLP, weergegeven in het groen, en microtubuli, weergegeven in het rood, evenals Hoechst-kleuring voor chromosomen, weergegeven in het blauw. Voorafgaand aan de fixatie en immunokleuring werden de cellen gedurende vier dagen behandeld met respectievelijk een controle, RNAi of RNAi om het NCDA KINESIN-achtig eiwit, dat de focus van de spoelpool bevordert, neer te reguleren.Behandeling met NCD RNAi resulteerde in cellen met gespreide spoelpolen en gedesorganiseerde spoelen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zeer voorzichtig te zijn bij het boren van gaten in de kweekschalen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

preparation-of-drosophila-s2-cells-for-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat...

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.

Organel Transport in gekweekte Drosophila Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

SEM analyse is een effectieve methode om te helpen bij de identificatie van soorten of fenotypische discriminatie. Dit protocol beschrijft de methoden voor de behandeling van specifieke morfologische details van drie representatieve soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van functies van veel organisch en weefseltypes (HLA).

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Leer de voorbereiding van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie met lectine-coating en immunokleuring. Dit protocol verbetert de visualisatie van celstructuren en eiwitlokalisatie voor genfunctieonderzoek.

De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

Meer video's verkennen