Name: De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer de voorbereiding van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie met lectine-coating en immunokleuring. Dit protocol verbetert de visualisatie van celstructuren en eiwitlokalisatie voor genfunctieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd mede ondersteund door het National Cancer Institute P30 CA23074, de American Cancer Society Institutional Research Grant 74-001-31, en van de Univ. van Arizona GI SPORE (NCI / NIH CA9506O).

<ol><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158, 873-884 (2002).</li>
<li>Goshima, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mitotic+spindle+assembly+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells.</a> Science. 316, 417-421 (2007).</li>
</ol>

Voor de celbiologie veld, zou een ideaal systeem goedkoop te onderhouden, gemakkelijk te manipuleren, en vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken. Drosophila S2 cellen voldoen aan deze eisen, en dus ze hebben het systeem van de keuze snel te worden voor een groeiend aantal van de cel biologie labs. We hebben presenteerde een kort overzicht van de methoden om S2 cellen voor te bereiden op microscopie. Een opmerkelijk hoofde van S2 cellen is het feit dat ze goed groeien in een ...

<table><tbody><tr><td>S2-cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2-cellen</td><td>DGRC</td><td>voorraadnummer 6</td><td>&lt;a href=&quot;https://dgrc.cgb.indiana.edu/">https://dgrc.cgb.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>S2-cellen</td><td>Invitrogen</td><td>R690-07</td><td></td></tr><tr><td>Sf900 II</td><td>Invitrogen</td><td>10902-096</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>HyClone SFX-Insect</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30278</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>Insect-Xpress</td><td>BioWhittaker</td><td>12-730</td><td>serumvrij medium</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s S2-medium</td><td>Invitrogen</td><td>11720-034</td><td>Voeg 10% (eindconcentratie) hitte-geïnactiveerd FBS toe om een compleet medium te maken.</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10438026</td><td>hitte-geïnactiveerd</td></tr><tr><td>100x antibioticumoplossing</td><td>MP Biomedicals</td><td>91674049</td><td>bevat penicilline (10000 U/mL),&lt;br/&gt;streptomycine (10000 &amp;#x03BC;g/mL), en&lt;br/&gt;amfotericine B (25 &amp;#x03BC;g/mL)</td></tr><tr><td>Concanavaline A</td><td>MP Biomedicals</td><td>195283</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>32% oplossing</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>9049</td><td>anhydrisch, ACS-grade</td></tr><tr><td>Moleculaire zeven</td><td>Acros Organics</td><td>19724</td><td>type 3A</td></tr></tbody></table>

de voorbereiding van drosophila s2 cellen voor lichtmicroscopie

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

De ideale experimentele systeem zou zijn goedkoop en gemakkelijk te onderhouden, vatbaar voor een verscheidenheid aan technieken, en zou worden ondersteund door een uitgebreide literatuurstudie en de genoomsequentie database. Gekweekte Drosophila S2 cellen, het product van gedistantieerd 20-24 uur oude embryo&#39;s 1, bezitten al deze eigenschappen. Bijgevolg, S2 cellen zijn uitermate geschikt voor de analyse van cellulaire processen, waaronder de ontdekking van de genen die coderen voor de moleculaire componenten van het proces of mechanisme van belang. De kenmerken van S2 cellen die het meest verantwoordelijk zijn voor hun nut zijn het gemak waarmee ze worden onderhouden, hun gevoeligheid voor exquise dubbelstrengs (ds) RNA-gemedieerde interferentie (RNAi), en hun volgzaamheid aan fluorescentie microscopie als live of vaste cellen. S2 cellen kunnen worden gekweekt in een verscheidenheid aan media, waaronder een aantal goedkope, in de handel verkrijgbare, volledig gedefinieerd, serum-vrije media 2. Daarnaast, ze groeien optimaal en snel bij 21-24 ° C en kan worden gekweekt in een verscheidenheid van containers. In tegenstelling tot de cellen van zoogdieren, hoeft S2 cellen niet nodig een geregelde atmosfeer, maar in plaats daarvan doen het goed met normale lucht en kan zelfs worden gehandhaafd in verzegelde flessen. Als aanvulling op het gemak van RNAi in S2 cellen is de mogelijkheid om gemakkelijk experimenteel geïnduceerde fenotypes analyseren door fase of fluorescentie microscopie van vaste of levende cellen. S2 cellen groeien in de cultuur als een monolaag maar niet tonen contact remming. In plaats daarvan, cellen hebben de neiging om te groeien in kolonies in dichte culturen. Bij een lage dichtheid, S2 culturen geteeld op glas of weefselkweek behandelde plastic zijn rond en losjes bevestigd. Echter, de cytologie van de S2-cellen sterk verbeterd worden door hen ertoe te uitgebreid plat door kort kweken ze op een oppervlak bedekt met de lectine, Concanavaline A (ConA) 3. S2 cellen kunnen ook stabiel getransfecteerd worden met fluorescent-gemerkte markers te labelen structuren of organellen van belang in levende of vaste cellen. Daarom is de usual scenario voor de microscopische analyse van cellen is dit: ten eerste, S2-cellen (die kan bezitten transgenen te getagd markers te uiten), worden behandeld door RNAi naar een doelwit eiwit (s) te elimineren. RNAi behandeling tijd kan worden gecorrigeerd voor verschillen in eiwit-turn-over kinetiek en naar cel trauma / overlijden te minimaliseren als het doel eiwit is belangrijk voor de levensvatbaarheid. Vervolgens worden de behandelde cellen overgebracht naar een schotel met een dekglaasje aan pre-gecoat met ConA tot cellen te verspreiden induceren en strak houden aan het glas. Tot slot worden de cellen afgebeeld met de keuze van de onderzoeker van de microscopie modi. S2-cellen zijn bijzonder goed voor studies die uitgebreide visualisatie van levende cellen, omdat deze cellen gezond te blijven bij kamertemperatuur en normale atmosfeer.

Drosophila Schneider (S2)-cellen zijn een steeds populairder systeem voor de ontdekking en functionele analyse van genen. Ons doel is het beschrijven van een aantal van de microscopische technieken die S2 cellen te maken die een steeds belangrijker experimenteel systeem.

De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

Het ideale experimentele systeem zou goedkoop en gemakkelijk te onderhouden zijn, geschikt zijn voor een verscheidenheid aan technieken en ondersteund worden door een uitgebreide literatuur...

Het algemene doel van deze procedure is het beschrijven van de preparatie van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst glazen kweekschalen met een glazen bodem voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het coaten van de glazen bodem met het lectine Conval.A om de adhesie en afplatting van de S two-cellen te bevorderen. De derde stap van de procedure is het toevoegen van kweekmedium en S two-cellen aan de kweekschaal. De laatste stap van de procedure is het fixeren en immunokleuren van de S two-cellen in de kweekschaal.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de lokalisatie van fluoro-four-gelabelde of immuun-gelabelde eiwitten van belang aantonen via fluorescentiemicroscopie van respectievelijk levende of gefixeerde S2-cellen. Hallo, ik ben Joey Club van het laboratorium van Greg Rogers van de afdeling Cell Biology Anatomy aan de University of Arizona. Ik ben John Nye, ook van het Rogers Lab.En ik ben Dan Buster. Ik werk in het laboratorium van Greg Rogers. Vandaag laten we u een procedure zien voor het prepareren van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de regulatie van

preparation-of-drosophila-s2-cells-for-light-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat...

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Beschrijven we de procedure voor te bereiden...

Visualisatie van de embryonale zenuwstelsel in zijn geheel-mount Drosophila Embryo&#39;s

Een standaard aanpak voor volwassenen voor te...

De voorbereiding van Adult Drosophila Ogen voor Thin Sectioning en microscopisch onderzoek

Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.

Organel Transport in gekweekte Drosophila Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.

Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

SEM analyse is een effectieve methode om te helpen bij de identificatie van soorten of fenotypische discriminatie. Dit protocol beschrijft de methoden voor de behandeling van specifieke morfologische details van drie representatieve soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van functies van veel organisch en weefseltypes (HLA).

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Leer de voorbereiding van Drosophila S2-cellen voor lichtmicroscopie met lectine-coating en immunokleuring. Dit protocol verbetert de visualisatie van celstructuren en eiwitlokalisatie voor genfunctieonderzoek.

De voorbereiding van Drosophila S2 cellen voor lichtmicroscopie

Meer video's verkennen