Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de fluorescerende eiwitten M orange two andron te gebruiken voor dual probe optische highlighting om selectief vier individuele celpopulaties of cellulaire compartimenten te labelen. Dit wordt bereikt door cellen eerst te belichten met 488 nanometer excitatielicht van lage intensiteit om alle groene drawn per fluorescentie uit te schakelen. Als tweede stap worden de cellen blootgesteld aan 488 nanometer excitatielicht van hoge intensiteit, waardoor de m orange fluorescentie wordt gefotoconverteerd naar rood.

Vervolgens worden de cellen blootgesteld aan tweefotonexcitatie van 800 nanometer om de duale fluorescentie in te schakelen. Ook hier worden resultaten verkregen die aantonen dat het mogelijk is om cellen in vier verschillende combinaties te labelen op basis van optische markering met duale probes met M Orange two en drawn ppa. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande experimenten, zoals subcellulaire fractionering, is dat deze op levende cellen wordt uitgevoerd.

Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biologie van bètacellen, zoals waarom slechts een klein deel van de insulinevesikels wordt uitgescheiden. Hoewel deze procedure inzicht kan bieden in de functie van bètacellen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen. Bijvoorbeeld het volgen van kankercellen in vivo. Een fluorescent eiwitdruppelsample bestaat uit een octale wateremulsie waarbij een fluorescent eiwit zich in de waterfase bevindt.

Deze emulsie wordt tussen een microscoopglaasje en een vierkant dekglas van 22 millimeter geplaatst voor microscopieapplicaties. Aan het begin van deze procedure moeten de microscoopglaasjes en dekglazen worden gereinigd en worden gecoat met een hydrofoob middel. Reinig het glaswerk door het vijf minuten lang te wassen met aceton.

Laat het glaswerk na het wassen aan de lucht drogen. Bereid vervolgens een 2% methyltrimethoxysilaan-oplossing in aceton en coat het glaswerk gedurende twee minuten in de oplossing. Verwijder het glaswerk na het coaten uit de oplossing en laat het drogen.

Spoel het glaswerk vervolgens af met 70% ethanol uit een spuitflacon. Laat het glaswerk na het spoelen opnieuw aan de lucht drogen en verwijder eventuele resterende vloeistof. Met behulp van perslucht kan het gecoate glaswerk gedurende ten minste één maand worden bewaard.

Zodra het glaswerk is voorbereid, worden fluorescerende eiwitten verkregen die eerder als his-tagged eiwit uit E. coli zijn gezuiverd. Meet het absorptiespectrum van het gezuiverde eiwit. Bereid een stockoplossing voor met een optische dichtheid van ongeveer 0,1 in tris-gebufferde zoutoplossing met pH 8 bevattend 0,1% bovine serumalbumine.

Bereid daarnaast 10 milliliters van een een-op-een mengsel van 1-octanol en tris-gebufferde zoutoplossing voor in een 15 milliliter conische buis en meng dit krachtig. Laat het mengsel na het mengen staan totdat de fasescheiding volledig is voltooid. De bovenste fase is het octanol; pipetteer ter vervaardiging van de emulsie 45 microliters 1-octanol en vijf microliters fluorescent eiwit in een epi-orph buis.

Tik een paar keer tegen de buis om de vorming van de emulsie te starten en soniceren de buis vervolgens 30 seconden in een sonicatiebad. Bereid ondertussen, na de sonicatie, een gecoate microscoopglasplaat en een dekglas voor. De emulsie moet volledig troebel zijn.

Pipette onmiddellijk vier µL van de emulsie uit het midden van de buis op een gecoate microscoopglasplaat en dek deze af met een gecoate dekglasplaat. De emulsie moet gelijkmatig verspreid worden tussen de microscoopglasplaat en het dekglas. Binnen enkele minuten moet het monster stabiel zijn.

De volgende procedure is een algemene strategie voor het opzetten van een experiment voor fotoconversie van fluorescerende eiwitten op een confocale laser scanning microscoop. Deze procedure kan worden toegepast op zowel gezuiverde eiwitten als op levende cellen. In dit experiment wordt een druppelmonster met gezuiverd mOrange2-eiwit gebruikt als algemeen startpunt voor het fotoconversie-experiment.

Stel de confocale laser scanning microscoop als volgt in. Gebruik een 40 x 1,3 numerische apertuur olie-immersieobjectief en een beeldgrootte van 512 bij 512 pixels. Stel de pixelverblijftijd in op zes microseconden per scan, de zoom op vier en vergroot de pinhole-opening om overeen te komen met een Z-resolutie van drie micron.

Configureer twee detectiekanalen voor de initiële en fotoconverteerde fluorescentie, evenals een fotoconversiekanaal. Observeer de oranje soort met excitatielicht van 561 nanometer en verzamel de fluorescentie tussen 570 en 630 nanometer. Detecteer de fotoconverteerde rode soort met excitatielicht van 633 nanometer en verzamel de fluorescentie tussen 640 en 700 nanometer.

Selecteer voor het fotoconversiekanal de laserlijn van 488 nanometer en verzamel de fluorescentie tussen 490 en 540 nanometer. De beeldvorming via het fotoconversiekanal is niet strikt noodzakelijk, maar kan wel nuttig zijn. Gebruik aan het begin van het experiment het detectiekanal om de initiële fluorescentie via continue scanning in beeld te brengen, zodat de lasersterkte en de detectorgain kunnen worden aangepast voor een optimale beeldkwaliteit.

Activeer vervolgens het fotoconversiekanaal en selecteer het lage laservermogen. Start het vastleggen van een time-lapse serie en verhoog geleidelijk de fotoconversielaser totdat er een significante bleaching van de initiële fluorescentie wordt waargenomen. Ga door met scannen totdat de initiële fluorescentie voor ongeveer 75% is gebleacht.

Deactiveer vervolgens het fotoconversiekanaal en activeer het detectiekanaal voor de gefotoconverteerde fluorescentie. Start de beeldvorming met een hoge detectorversterking bij een laag laservermogen. Verhoog vervolgens geleidelijk het laservermogen totdat de gefotoconverteerde fluorescentie wordt gedetecteerd.

Zodra de detectie is voltooid, worden het laservermogen en de detectie- of gain-instellingen aangepast voor een optimale beeldkwaliteit. Ten slotte worden het gebruikte laservermogen voor fotoconversie en de duur hiervan geoptimaliseerd. Een verhoging van het laservermogen zal de snelheid van de fotoconversie versnellen.

Echter zal te veel laservermogen het eiwit fotobleetten. Zodra de optimale fotoconversie, het laservermogen en de duur zijn bepaald, kunnen deze parameters worden gebruikt om een standaard fotobleaching-module of een fluorescente herstelfunctie na fotobleaching-module (FRAP) te configureren. Vervolgens is het fotoconversiekanal niet langer nodig vanwege de Redshift spectrale eigenschappen van M orange two.

Het kan in combinatie met het groene photoschakelbare fluorescente eiwit drawn PU worden gebruikt voor dual-probe optische markering. Om te beginnen met dual-probe optische markering, kweek HeLa-cellen in glass-bottom mat tech schalen en transfecteer de cellen 24 uur vóór de beeldvorming met plasmiden die de fluorescente eiwitten coderen, met behulp van een standaard LIPEFECTAMINE 2000 transfectie.

Plaats de levende cellen op een confocale laser-scanningmicroscoop en stel de microscoop in voor M orange two fotoconversie zoals eerder beschreven. Configureer vervolgens de microscoop voor DPA-fotoswitching. DPA wordt geëxciteerd met 488 nanometer licht en de fluorescentie hiervan kan worden afgebeeld met behulp van het M orange two fotoconversiekanaal.

Zorg ervoor dat het laservermogen dat wordt gebruikt voor de beeldvorming van MPA tot een minimum wordt beperkt, aangezien te veel laservermogen zal leiden tot inactivatie van mpa. Voeg een kanaal toe voor MPA-fotoactivatie met behulp van 800 nanometer tweefoton-excitatie; bepaal vervolgens het laservermogen dat nodig is voor de beeldvorming van fotoactivatie en foto-inactivatie van OFA-fluorescentie.

Een van de moeilijkste aspecten van deze procedure is het inactiveren van RPA zonder M-oranje fotochemisch om te zetten. Omdat beide processen bij dezelfde golflengte plaatsvinden, is het essentieel om de fotoconversie zorgvuldig te optimaliseren om dit te voorkomen.

Laservermogen en duurzaamheid Wees voorzichtig met de fotoconversie van M orange two. Een inactivatie van PU vindt beide plaats bij excitatie met 488 nanometer licht om PU te inactiveren zonder significante fotoconversie van m orange two. Gebruik een lager laservermogen zodra de parameters voor de fotoconversie van M orange two en de fotoswitch van DPA zijn ingesteld.

Dual-probe optische highlighting kan worden gerealiseerd. Inactiveer eerst de DPA-fluorescentie in het gehele gezichtsveld met 488 nanometer excitatie bij laag vermogen. Selecteer vervolgens een regio van interesse en converteer m orange two met 488 nanometer excitatie bij hoog vermogen.

Select ten slot een regio van belang en activeer de DPA-fluorescentie met behulp van tweefoton-excitatie van 800 nanometer. Fluorescerende proteïne-druppelmonsters zijn bij uitstek geschikt voor het opzetten van fotoconversie-applicaties met een confocale microscoop. Wanneer het druppelmonster correct is voorbereid, zien de druppels er zeer homogeen uit.

Wanneer het monster echter wordt voorbereid zonder het microscoopglas in het dekglas te coaten, neigen de druppels in de voorbereide monsters tegen een van de glasoppervlakken te worden platgedrukt. In afwezigheid van 0,1%BSA neigt het fluorescerende eiwit zich te ophopen bij één enkele waterinterface. Het creëren van een fluorescentiehalo via fotoconversie is kritisch afhankelijk van het laservermogen en de blootstellingsduur.

Te veel laservermogen of een te lange blootstelling zal leiden tot fotobleken en resulteert in een afname van de fotogevormde rode fluorescentie. De onderscheidende spectrale eigenschappen van M orange two en PHO maken optische markering met dubbele probes mogelijk voorafgaand aan fotoconversie; cellen die M orange two, histon H2B en DPA mito tot expressie brengen, vertonen oranje fluorescentie in de kern en groene fluorescentie in de mitochondriën. Wanneer alle fluorescentie wordt uitgeschakeld met een 488 nanometer excitatie van laag vermogen, is er sprake van minimale fotoconversie van M orange.

M-oranje 2 kan vervolgens worden gefotoconverteerd naar rood met excitatie van 488 nanometer bij hoog vermogen. Zodra M-oranje 2 is gefotoconverteerd, kan de fluorescentie van drawn puff opnieuw worden ingeschakeld met behulp van tweefotonenexcitatie van 800 nanometer. Met optische markering via dubbele probes kunnen cellen op vier verschillende manieren worden gelabeld.

Met deze techniek is het mogelijk om vier verschillende celpopulaties specifiek te labelen. Zoals u heeft gezien, is een van de moeilijkste aspecten van deze procedure het inactiveren van MPA zonder m orange te fotoconverteren. Zodra dit beheerst is, kunnen verdere experimenten met dit systeem worden uitgevoerd, zoals het volgen van meerdere populaties in pancreatische bètacellen.

Dat is alles. Ik hoop dat u deze presentatie nuttig vond, en veel succes met uw experimenten.