Name: Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Leer fotoconversie van fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen met mOrange2 en Dronpa. Deze methode maakt selectieve labeling van vier celpopulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Mike W. Davidson (Florida State University) voor het leveren van plasmide DNA dat codeert voor fluorescerende eiwitten. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health te verlenen GM72048 (tot DWP).

1. De voorbereiding van fluorescerend eiwit druppel monsters Een fluorescerend eiwit druppel monster bestaat uit een 1-octanol/water emulsie met de fluorescerende proteïne die woonachtig zijn in de waterfase. Deze emulsie is ingeklemd tussen een microscoop glijbaan en een 22 mm vierkant deksel glas voor microscopie toepassingen. <ol><li> Alvorens fluorescerend eiwit druppel monsters de microscoop dia's en dekglaasjes moeten worden schoongemaakt en bedekt met een hydrofobe agent. </li><li> Schoon glaswerk door wassen 5 minuten met aceton en laten drogen door de lucht. (Optioneel, na het reinigen van het glaswerk kan worden behandeld gedurende 30 seconden in een plasma cleaner om optimale resultaten te verkrijgen coating). </li><li> Bereid een 2% methyltrimethoxy oplossing in aceton en de vacht van de glazen tijdens een twee minuten incubatie in deze oplossing. Na het coaten Verwijder het glaswerk uit de oplossing en laat het drogen door de lucht. Spoel het daarna met 70% ethanol uit een spray fles en laat het weer droog. (Optioneel, op dit punt het glaswerk kan worden gebakken gedurende 1 uur bij 80 ° C om covalent de coating link naar het glaswerk). Gecoate glaswerk kan worden opgeslagen voor ten minste een maand. </li><li> Fluorescerende eiwitten worden gezuiverd als Zijn 6-gelabeld eiwit van E. Coli 1. Meet de absorptie spectrum van het gezuiverde eiwit en een voorraad verdunning met een optische dichtheid van ~ 0,1 in STE buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA) voor te bereiden, met 0,1% bovine serum albumine (BSA) . Daarnaast bereiden 10 ml van een 1:1 mengsel van 1-octanol en STE buffer in een 15 ml conische buis en meng krachtig. Na het mengen laten tot de fasescheiding is voltooid. De bovenste fase is de 1-octanol. (Let op: Omdat de 1-octanol heeft een sterke geur is het belangrijk om een ​​gesloten afvalcontainer te gebruiken voor alles dat in contact komt met 1-octanol.) </li><li> Om de emulsie pipet 45 ul 1-octanol en 5 ul fluorescerend eiwit in een microfugebuis. Tik op de buis een paar keer met je vinger om de vorming van de emulsie op Start en vervolgens de buis ultrasone trillingen gedurende 30 seconden in een ultrasoonapparaat bad. In de tussentijd krijgen een gecoate microscoop glijbaan en dekglas klaar. Na sonicatie de emulsie moet volledig troebel. Direct na het sonicatie pipet 4 ul emulsie uit het midden van de buis op een gecoate objectglaasje en dek af met een deksel gecoat glas. </li><li> Als de procedure correct wordt uitgevoerd de emulsie gelijkmatig verdeeld tussen de microscoop glijbaan en het object glas. Binnen enkele minuten het monster moet stabiel zijn, bestaande uit ~ 10 urn dikke TL-druppeltjes met verschillende diameter. De grootste druppels zijn dicht bij het centrum van het monster en de kleinere verder gelegen naar de randen. </li></ol> 2. Het opzetten van een experiment photoconversion De volgende procedure is een algemene strategie voor het opzetten van een fluorescerend eiwit photoconversion experiment. Deze procedure kan worden toegepast voor de gezuiverde eiwitten als voor levende cellen. <ol><li> De volgende parameters geven een algemeen uitgangspunt voor het instellen van uw photoconversion experiment: 40x 1.3NA olie-immersie objectief Image size = 512 x 512 pixels Scan zoom = 4 Pixelverblijftijd = 6 μsec. Z-resolutie (pinhole size) = 3 micrometer </li><li> Configureren twee detectie-kanalen van de eerste en photoconverted fluorescentie, evenals een "photoconversion kanaal". In dit voorbeeld gebruiken we gezuiverd mOrange2 eiwit, dat is een oranje-to-rood photoconvertible fluorescerend eiwit. De oranje soort is vastgesteld met behulp van 561 nm excitatie en de fluorescentie is verzameld tussen 570 nm en 630 nm. De photoconverted rode soort is vastgesteld met behulp van 633 nm excitatie en de fluorescentie is verzameld tussen 640 nm en 700 nm. Voor de "photoconversion channel" te selecteren 488 nm excitatie en het verzamelen van fluorescentie tussen 490 nm en 540 nm. (Let op:. Beeldvorming van de photoconversion kanaal is niet strikt noodzakelijk) </li><li> Gebruik het kanaal voor de beeldvorming van de eerste fluorescentie met continue scannen naar het laservermogen en de detector te krijgen voor een optimale beeldkwaliteit aan te passen. </li><li> Activeer de photoconversion kanaal en selecteer een lage laservermogen. Start imaging een time lapse serie en geleidelijk te verhogen van de photoconversion laser tot een significante bleken van de eerste fluorescentie wordt waargenomen. Gaan met scannen totdat de eerste fluorescentie is ongeveer 75% gebleekt. </li><li> Deactiveer de photoconversion kanaal en activeer de detectie-kanaal voor de photoconverted fluorescentie. Begin imaging met een hoge detector te krijgen en een laag laservermogen en geleidelijk verhogen het laservermogen tot de photoconverted fluorescentie wordt gedetecteerd. Zodra u detecteert de photoconverted fluorescentie kun je laservermogen en detector te krijgen voor een optimale beeldkwaliteit aan te passen. </li><li> Ten slotte is het laservermogen wordt gebruiktfor photoconversion evenals de duur van de photoconversion moeten worden geoptimaliseerd. Het verhogen van de photoconversion laservermogen zal versnellen het tempo van de photoconversion, echter te veel laser macht zal het eiwit photobleach. </li><li> Zodra de optimale photoconversion laservermogen en duur zijn bepaald, kunnen deze parameters worden gebruikt om een ​​standaard photobleaching of FRAP module en de "photoconversion channel" is niet meer nodig te configureren. </li></ol> 3. Dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa Omwille van de rood-verschoven spectrale eigenschappen, kan mOrange2 worden gebruikt in combinatie met het groen fluorescerend eiwit photoswitchable Dronpa voor dual-probe optische markering om selectief benadrukken van de vier individuele cel (organel) populaties mogelijk te maken. <ol><li> Cellen worden gekweekt in glazen bodem MatTek schotels en getransfecteerd 24 uur voorafgaand aan de beeldvorming met behulp van standaard Lipofectamine2000 transfectie 1. </li><li> Stel de microscoop voor mOrange2 photoconversion zoals beschreven in paragraaf 2. </li><li> Configureer de microscoop voor Dronpa photoswitching. Dronpa fluorescentie kan worden afgebeeld met behulp van de mOrange2 "photoconversion kanaal" (zie stap 2.2). (Opmerking: Minimaliseer het laservermogen gebruikt voor beeldvorming Dronpa, omdat er te veel laservermogen zal inactivatie van Dronpa veroorzaken.) Voeg een kanaal voor Dronpa fotoactivatie. We maken gebruik van 800 nm twee-foton excitatie voor fotoactivatie, maar als alternatief dit kan worden bereikt met behulp van 405 nm excitatie. Bepaal de laser vermogen dat nodig is voor de beeldvorming, fotoactivatie en photoinactivation van Dronpa fluorescentie. </li><li> Let op: Photoconversion van mOrange2 en inactivatie van Dronpa komen beide bij 488 nm excitatie. Vanwege het hoge laser vermogen dat nodig is voor mOrange2 photoconversion zal dit ook inactiveren Dronpa fluorescentie. Aan de andere kant, Dronpa inactivatie gebeurt al bij veel lagere laservermogen en kan worden uitgevoerd zonder noemenswaardige mOrange2 photoconversion. </li><li> Wanneer de parameters voor mOrange2 photoconversion en Dronpa photoswitching zijn ingesteld, is dual probe optisch benadrukt bereikt door de volgende stappen. De eerste, inactiveren Dronpa fluorescentie in het hele gezichtsveld met een laag vermogen 488 nm excitatie. Ten tweede, selecteer een regio van belang en photoconvert mOrange2 met een hoog vermogen 488 nm excitatie. Tot slot, selecteer een regio van belang is voor Dronpa fluorescentie te activeren. </li></ol> 4. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Droplet monstervoorbereiding. A) de juiste wijze voorbehandeld druppel monster. B) Voorbeeld bereid zonder coating de microscoop glijbaan en dekglas. C) Sample bereid zonder toevoeging van 0,1% BSA. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Effect van photoconversion laservermogen en de duur op mOrange2 photoconversion. Single druppeltjes met mOrange2 eiwit werden continu photoconverted met behulp van verschillende hoeveelheden van 488 nm laservermogen. Relatieve laservermogen gebruikt voor photoconversion was 10% (vast), 25% (stippellijn), en 100% (stippellijn). A) oranje fluo soorten. B) Photoconverted rood fluorescerende soorten. <img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa. A) cel die mOrange2-histon H2B en Dronpa-Mito voor photoconversion, waaruit oranje fluorescentie in de kern en groene fluorescentie in de mitochondriën. B) Dronpa fluorescentie werd uitgeschakeld met een laag stroomverbruik 488 nm excitatie, waardoor een minimale photoconversion van mOrange2. C) mOrange2 was photoconverted in rood met een hoog vermogen 488 nm excitatie. D) Dronpa fluorescentie werd weer ingeschakeld met behulp van 800 nm twee-foton excitatie. De panelen zijn overlays van de fluorescentie beelden samen met het differentieel interferentie contrast beeld.

<ol><li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li>
</ol>

Het gezuiverde fluorescerend eiwit druppel monster is een zeer handige sample-indeling voor de fotofysische karakterisering van fluorescerende eiwitten, bijvoorbeeld om te studeren fotobleken kinetiek en photoconversion kinetiek. De extreem kleine druppels volume (~ 20 picoliter) faciliteert fotobleken en photoconversion experimenten, die kan moeilijk zijn uit te voeren in de cuvette gebaseerde systemen. Daarnaast, zoals hier de druppel monster is bij uitstek geschikt voor het opzetten van een confocale microscoop voor ...

<table><tbody><tr><td>Objectglazen</td><td>VWR international</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>22 mm dekglas</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>1-octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4500</td><td></td></tr><tr><td>methyltrimethoxysilaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6420</td><td></td></tr><tr><td>MatTek schaaltjes</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr></tbody></table>

photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Photoconvertible fluorescerende eiwitten (pc-KP&#39;s) zijn een klasse van fluorescerende eiwitten met &quot;optische highlighter&quot;-mogelijkheid, wat betekent dat de kleur van de fluorescentie kan worden veranderd door blootstelling aan licht van een specifieke golflengte. Optische highlighting maakt niet-invasieve markering van een subpopulatie van fluorescerende moleculen, en is daarom ideaal voor het opsporen van enkele cellen of organellen. Kritische parameters voor een efficiënte photoconversion zijn de intensiteit en de belichtingstijd van de photoconversion licht. Als de intensiteit te laag is, zal photoconversion worden langzaam of niet optreden op alle. Aan de andere kant kan te veel intensiteit of te lange blootstelling photobleach het eiwit en daardoor verminderen de efficiëntie van de photoconversion. Dit protocol beschrijft een algemene aanpak van het opzetten van een confocale laser scanning microscoop voor pc-FP photoconversion toepassingen. Eerst beschrijven we een procedure voor het bereiden van gezuiverde eiwit druppel monsters. Dit monster formaat is erg handig voor het bestuderen van de fotofysische gedrag van fluorescerende eiwitten onder de microscoop. Ten tweede, zullen we gebruik maken van de eiwit druppel monster te laten zien hoe de microscoop voor photoconversion configureren. En tot slot, laten we zien hoe de optische markering uit te voeren in levende cellen, inclusief dual-probe optische markeren met mOrange2 en Dronpa.

Dit protocol beschrijft een algemene aanpak voor photoconversion van fluorescerende eiwitten te voeren op een confocale laser scanning microscoop. We beschrijven de procedures voor de photoconversion van puried eiwit monsters, evenals voor dual-probe optische markeren in levende cellen met mOrange2 en Dronpa.

Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Foto-convertible fluorescerende eiwitten (pc-FP's) zijn een klasse fluorescerende eiwitten met de capaciteit van een "optische markeerder", wat betekent dat de kleur van ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de fluorescerende eiwitten M orange two andron te gebruiken voor dual probe optische highlighting om selectief vier individuele celpopulaties of cellulaire compartimenten te labelen. Dit wordt bereikt door cellen eerst te belichten met 488 nanometer excitatielicht van lage intensiteit om alle groene drawn per fluorescentie uit te schakelen. Als tweede stap worden de cellen blootgesteld aan 488 nanometer excitatielicht van hoge intensiteit, waardoor de m orange fluorescentie wordt gefotoconverteerd naar rood.Vervolgens worden de cellen blootgesteld aan tweefotonexcitatie van 800 nanometer om de duale fluorescentie in te schakelen. Ook hier worden resultaten verkregen die aantonen dat het mogelijk is om cellen in vier verschillende combinaties te labelen op basis van optische markering met duale probes met M Orange two en drawn ppa. Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande experimenten, zoals subcellulaire fractionering, is dat deze op levende cellen wordt uitgevoerd.Deze procedure kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biologie van bètacellen, zoals waarom slechts een klein deel van de

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De voorbereiding van de ontwikkeling en Adult Drosophila Hersenen en retinae voor Live Imaging

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Studies van biomoleculen in vivo zijn cruciaal voor het begrijpen van moleculaire functie in een biologische context. Hier beschrijven we een nieuwe methode die de internalisatie van fluorescerende biomoleculen, zoals DNA of eiwitten, in levende micro-organismen mogelijk maakt. Analyse van in vivo gegevens opgenomen door middel van fluorescentiemicroscopie wordt ook gepresenteerd en besproken.

Internalisatie en observatie van TL biomoleculen in levende micro-organismen via Electroporatie

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorofoormoleculen kan worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitinteracties in de levende cel. Hier wordt een protocol gegeven over hoe FRET in levende cellen kan worden gemeten door het detecteren van gesensibiliseerde emissie van de acceptor en het blussen van het donormolecuul met behulp van confocale laserscanmicroscopie.

Beoordeling van eiwitinteracties in levende cellen met FRET-gesensibiliseerde emissie

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Leer fotoconversie van fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen met mOrange2 en Dronpa. Deze methode maakt selectieve labeling van vier celpopulaties mogelijk.

Photoconversion van gezuiverde fluorescerende eiwitten en dual-probe optische markering in levende cellen

Meer video's verkennen