Technieken voor Imaging Ca ^{2 +} Signalering in Human Sperm

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van beeldseries van geïmmobiliseerde menselijke spermacellen die zijn gelabeld met een fluorescerende calciumreporter-kleurstof. Motiele cellen worden uit het seminale plasma geïsoleerd door ze naar boven te laten zwemmen in incubatiemedium. Na capacitatie worden de cellen gelabeld met een fluorescerende calciumindicator en vervolgens overgebracht naar een fusibele beeldkamer, die is gemonteerd op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.

Responsies van de calciumionconcentratie worden vastgelegd als een time-lapse beeldserie en geanalyseerd om responsies van individuele cellen te extraheren. Hallo, ik ben Edwin Andres Morales Garcia van het laboratorium van Dr. Steven J. Public Cova aan de School of Biosciences van de University of Birmingham, Verenigd Koninkrijk. Ik ben Katherine Nash, eveneens van de Public Overlap.

En ik ben Jennifer Morris van het Public Overlap. Vandaag laten we u de procedure zien voor het in beeld brengen van intracellulaire calciumresponsen in individuele menselijke spermatozoa. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de regulatie van sperma-activiteiten te bestuderen aan de hand van stimuli afgeleid van de eicel en het vrouwelijke tractus.

Laten we beginnen. Bewaar spermaproeven gedurende maximaal 30 minuten na het moment van collectie bij 37 °C om motorele cellen uit het seminale plasma te isoleren. Pipetteer 1 mL L'S-gebalanceerde zoutoplossing aangevuld met 0,3% BSA, afgekort als S-E-B-S-S, in een reeks polystyreen buisjes van 5 mL met een ronde bodem. Voeg voorzichtig 0,3 mL sperma toe aan de S-E-B-S-S in elk buisje en sluit het buisje losjes af.

Incubeer de buisjes in een hoek van 45 graden gedurende één uur bij 37 °C en 6% koolstofdioxide. Om beweeglijke cellen de mogelijkheid te geven naar het S-E-B-S-S te zwemmen, wordt de bovenste 0,7 ml van de oplossing voorzichtig afgepipetteerd en worden de oplossingen uit alle buisjes overgebracht naar een schone polystyreen centrifugebuis van 15 ml. Schud voorzichtig om te mengen en tel de cellen die met formaline zijn geïmmobiliseerd in een nieuwe Bürker-teltablet.

Breng de concentratie naar 6 miljoen cellen per milliliter in S-E-B-S-S en verdeel het sperma in aliquoten van 200 µL in polystyreen ronde bodembuisjes van vijf milliliter. Sluit de dopjes losjes. Indien de respons van gecapaciteerde cellen wordt bestudeerd, worden de buisjes vijf tot zes uur geïncubeerd bij 37 °C en 6% CO2 om capacitatie mogelijk te maken. Breng 10 µL van 10% polylysine aan als een reeks kleine druppels in het centrum van een objectglas van 22 bij 50 millimeter.

Nummer één dekglas en laat het volledig drogen. Gebruik vacuümvet om het dekglas met de behandelde zijde naar boven te bevestigen aan een hiervoor gebouwde fuseerbare beeldkamer.

Select voor elk imaging-experiment één buisje gecapaciteerde cellen en voeg 1,2 µL van 2,5 mg/mL calciumafhankelijk organ green opgelost in DMSO toe voor een eindconcentratie van 10 µM. Incubeer het buisje 40 minuten bij 37 °C en 6% CO2.

Verwijder met een 200 µL Pipet met een P 200 tip alle vloeistof volledig uit de buis. Vul de kamer door voorzichtig in de instroompoort te injecteren. Kantel de kamer zodat luchtbellen via de uitstroom kunnen ontsnappen.

Plaats de gehele kamer in de incubator en incubeer deze nog 20 minuten bij 37 °C en 6% koolstofdioxide. Dit dient om de spermacellen aan de poly-D-lysine te laten hechten. Bevestig de kamer aan de omgekeerde fluorescentiemicroscoop en sluit deze aan op het perfusieapparaat.

Laat het preparaat ten minste 10 minuten in het donker staan zodat de perfusie kan wegspoelen. Bekijk losse cellen en extracellulaire debris onder fasecontrast bij een vergroting van 40 x of 60 x; kies een gezichtsveld waarin de celafstand voldoende is om de fluorescentie van elke cel afzonderlijk te kunnen beoordelen. De cellen moeten adequaat gehecht zijn, maar bij voorkeur duidelijke fledger-activiteit vertonen.

Schakel de microscoop over naar het groene fluorescentiekanaal. Houd de belichtingstijden op het minimum dat nodig is voor een helder fluorescentiebeeld om fotobleken in de IQ-software te verminderen.

Activeer de tijdreeksbeeldacquisitie. Neem beelden op met een frequentie van 0,1 hertz en gebruik een softwaregestuurde sluiter om de belichting te beperken. Neem aanvankelijk op gedurende een controleperiode van drie tot vijf minuten, manipuleer vervolgens de calciumconcentratie van de zoutoplossing en dien geneesmiddelen toe door de zoutoplossing bij de header van het perfusiesysteem te vervangen.

Noteer het tijdstip waarop elke stimulus aan de header wordt toegevoegd en bereken de aankomsttijd in de kamer zoals beschreven in het geschreven gedeelte van dit protocol. Om afbeeldingen offline te analyseren, gebruikt u een van de tekentools om een region of interest of ROI te omlijnen rond elke cel of een deel van een cel; in dit geval de posterieure kop van de spermatozoïed, omdat opgeslagen calcium in dit gebied wordt gemobiliseerd. Gebruik de schuifbalk om door de beeldserie te scrollen.

Identificeer en verwijder cellen die niet volledig binnen de ROI blijven, andere cellen overlappen of een grote en snelle toename gevolgd door een scherpe daling van de fluorescentie-intensiteit hebben vertoond, wat kenmerkend is voor celdood. Gebruik de analysefunctie om een tijdserie van de fluorescentie-intensiteit voor elke ROI te genereren. De gegevens kunnen vervolgens worden geëxporteerd en geanalyseerd in een spreadsheet.

Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit een serie die is verkregen tijdens stimulatie met drie micromolair progesteron. De onderste rij is voorzien van pseudokleur. Om relatieve intensiteitsveranderingen beter te illustreren, is het progesteron hier de kamer binnengekomen.

Deze resultaten zijn geanimeerd in een time-lapse video. Let op de snelle piek in fluorescentie-intensiteit, gevolgd door een langzame toename, wat duidt op overeenkomstige veranderingen in de intracellulaire calciumspiegels. Deze gegevens zijn hier gekwantificeerd op basis van de gemiddelde intensiteiten van het posterieure hoofd van drie cellen.

Drie micromolar progesteron werd toegevoegd op het tijdstip dat door de pijl wordt aangegeven. De stippellijn toont de gemiddelde controllevlorescentie. Vandaag hebben we u laten zien hoe u kwalitatief goede cellen isoleert, deze laadt met een calciumgevoelige kleurstof en de respons van individuele cellen op stimulatie monitort.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u de best mogelijke celpopulatie gebruikt; minimaliseer daarnaast de belichting van de cellen om fotobeschadiging te voorkomen en kies de kleurstof die het beste aansluit bij de responsen waarnaar u op zoek bent. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.