Name: Technieken voor Imaging Ca 2 + Signalering in Human Sperm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Leer calciumsignaalbeeldvorming in menselijke spermacellen met behulp van tijdverloopfluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt analyse van individuele celreacties op stimuli mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gefinancierd door de Wellcome Trust, de Medical Research Council, The Royal Society, Birmingham Science City en The Onvruchtbaarheid Research Trust. We willen graag aan de deskundige hulp van Cairn Research erkennen in de bouw en integratie van de beeldvorming rigs.

Sperma van gezonde vruchtbare mannen, met een normale sperma-analyse, worden meestal bereid voor beeldvorming als volgt. <ol><li> Sperma monsters worden bewaard bij 37 ° C voor niet meer dan 30 minuten. Cellen worden geïsoleerd van de zaadplasma door zwemmen tot in aangevuld gebalanceerde zoutoplossing Earle&#39;s (sEBSS; mM: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 0.7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, 116,4 NaCl, 55,6 D-glucose, 2,73 Na pyruvaat, 41.8 Na lactaat), aangevuld met 0,3% houtskool de-lipidated/fatty zuurvrij Fraction V BSA (kwaliteit van de BSA is cruciaal voor een succesvolle capacitation van sperma). 1 ml van sEBBS wordt gepipetteerd in elk van een serie van 5 ml tubes en voorzichtig underlayered met 0,3 ml van sperma. Na incubatie gedurende 1 uur (37 ° C; 6% CO 2) de bovenste 0,7 ml is voorzichtig verwijderd uit elke buis en samengevoegd. 10 pi van het sperma suspensie wordt verdund met 90 ul van 1% (v / v) formaline om de cellen te immobiliseren, dan zaadcellen worden meegeteld in een Neubauer kamer. Celdichtheid in de suspensie wordt dan aangepast (met sEBSS) tot 6 miljoen cellen / ml. </li><li> Het monster wordt vervolgens verdeeld in porties van 200 pl in los-capped buizen en geïncubeerd (37 ° C; 6% CO 2) in voor 5-6 h te capacitation mogelijk te maken. </li><li> Dekglaasjes (22x50 mm) eerder zijn behandeld met poly-D-lysine. 10 ul van poly-D-lysine-oplossing (10% w / v) wordt toegepast als een aantal kleine druppels naar het centrum van het dekglaasje. De poly-D-lysine wordt dan mag aan de lucht drogen. Dit kan op een verwarmd podium en moet worden tot droog te voltooien. Een dekglaasje wordt bevestigd met vacuüm vet om een ​​gesloten, speciaal gebouwde, perfusable, polycarbonaat beeldvorming kamer (afmetingen 35 mm x 20 mm x 5 mm; capaciteit ≈ 180 ul). Gelijkaardig aan de Warner RC20 kamer De poly-D-lysine- gecoat dekglaasje vormt de basis van de kamer wanneer de cellen worden bekeken op een omgekeerde microscoop en een 12 mm diameter ronde dekglaasje vormt de bovenkant van de kamer, waardoor de overdracht van het licht. </li><li> Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) of Calcium Green 1-AM worden gebruikt voor het labelen cellen. OGB wordt bereid door het oplossen in DMSO. Pluronic zuur F127 (een detergent) is opgenomen in de DMSO om &#39;samenklonteren&#39; van de kleurstof te voorkomen. Dit kan worden bereid in het laboratorium (100 mg Pluronic in 0,5 ml DMSO), vlak voor gebruik, of kan worden gekocht pre-voorbereid. 20 ui wordt toegevoegd aan een 50 ug hoeveelheid van OGB (2,5 mg / ml). De flacon kan vervolgens worden opgeslagen, ingevroren en ontdooid voor later gebruik. </li><li> Na capacitation van het sperma (5-6 h in sEBBS, 37 ° C; 6% CO 2) een buis is gekozen voor de beeldvorming en 1,2 ul van OGB-oplossing wordt toegevoegd, zodat een uiteindelijke concentratie van 10 uM. De buis wordt vervolgens geïncubeerd voor een verdere 40 min, waarna de celsuspensie voorzichtig wordt geïnjecteerd in de instroom-poort van de beeldvorming kamer met een P1000 (blauw) pipetpunt. De kamer is geplaatst in de incubator, poly-D-lysine-gecoate dekglaasje kant naar beneden, voor 20 minuten. Cellen hebben de neiging om te zwemmen langs de oppervlakken van de kamer en zal zich houden aan de poly-D-lysine-gecoate gebied. </li><li> De kamer is nu gemonteerd op de microscoop, verbonden met de perfusie apparaat en doorbloed op circa 0,5 ml / min. Een roller pomp voedt zoutoplossing in de kamer en overloop van de afrit de haven wordt verwijderd door een zuigpomp met een val. De voorbereiding is nog in het donker voor ten minste 10 minuten terwijl de losse cellen en extracellulaire kleurstof worden verwijderd door perfusie van de kamer. Temperatuurstabiliteit is van cruciaal belang omdat kleine schommelingen kunnen niet alleen van invloed cel Ca 2 + homeostase, maar kunnen ook van invloed K d van de kleurstof. Experimenten worden normaal uitgevoerd bij 25 ° C, bereikt door het handhaven van de temperatuur van de donkere kamer op dit niveau. We hebben gemerkt dat het behoud van kamertemperatuur op het vereiste niveau hoger de temperatuur en focus stabiliteit biedt dan het gebruik van een temperatuur gecontroleerde fase of een thermostatisch verwarming op het zoute instroom. </li><li> Cellen worden bekeken onder fase-contrast (40x of 60x olie-immersie) doelstelling en een ruimte voor de beeldvorming is geselecteerd. Het gedeelte van de poly-D-lysine gecoate gebied dat ligt vlak bij de inlaat-poort heeft de voorkeur, waar de zoute stroming laminair en consistent. Het is ook belangrijk om een ​​gebied waar celdichtheid is geschikt (te veel dichtheid van invloed op de kwaliteit en integriteit van gegevens door middel van pick-up van het signaal van aangrenzende cellen) en waar de cellen voldoende zijn bevestigd, maar flagellaire activiteit is waarneembaar. Een fase contrast beeld wordt opgeslagen. De microscoop wordt dan overgeschakeld naar fluorescentie-modus (excitatie 480 nm; emissie 540 nm) en de blootstelling tijd is teruggebracht tot het minimum dat nodig is om een ​​duidelijk fluorescentie beeld (meestal 50 tot 200 ms) te verkrijgen. </li><li> Het experiment wordt gestart door het activeren van de time-series beeldacquisitie software (IQ). Typisch de beelden werden bij 0,1 Hz en verlichting is beperkt tot de periodes van het beeld overname alleen met behulp van een Softwaopnieuw gecontroleerd sluiter. Veel groter beeldacquisitie tarieven kunnen worden gebruikt, maar rekening moet worden gehouden voor de problemen van het bleken en het genereren van artefacten als gevolg van foto-schade aan de cellen (zie discussie). IQ (en de meeste andere acquisitie software platforms) zal real-time grafiek van fluorescentie tijdens het experiment. </li><li> Na een controle periode van 3-5 minuten duur manipulatie van een zoutoplossing bestanddelen (zoals [Ca 2 +] o), en de toepassing van geneesmiddelen wordt bereikt door vervanging van een zoutoplossing in de perfusie header. Tijd van de toevoeging van elke stimulus wordt opgemerkt zodat de tijd van aankomst in de beeldvorming kamer kan worden berekend, met voldoende nauwkeurigheid voor de beoordeling van de trage reacties hier beschreven (bemonsterd op 0,1 Hz). Voor meer snelle reacties grotere nauwkeurigheid kan worden bereikt door het toevoegen van prikkels rechtstreeks aan de zoute stromen door een tweede instroom poort zoals voorzien in de Warner RC20 kamer. </li><li> Afbeeldingen worden geanalyseerd offline met IQ. Regio&#39;s van belang (ROI) zijn opgesteld rond elke cel (of een deel van de cel) en ook een cel vrije ruimte is geselecteerd (voor automatische achtergrond aftrek door de software. Het beeld-serie is vervolgens gecontroleerd naar cellen die gestorven of onderging acrosome reactie te verwijderen ( die wordt weergegeven als een grote en snelle toename van fluorescentie, gevolgd door het verlies van cytoplasmatische kleurstof) tijdens het experiment en die voldoende beweging artefacten veroorzaken wanneer geanalyseerd als een tijdreeks zien. </li><li> Een time-fluorescentie-intensiteit serie wordt dan verkregen voor elk ROI en deze gegevens worden geanalyseerd offline in Excel. In eerste instantie fluorescentie is genormaliseerd naar de gemiddelde waarde verkregen tijdens de controle periode, met behulp van de vergelijking R = [(FF rest) / F rest] x 100%, waarbij R% verandering in de fluorescentie ten opzichte van de controleperiode,, F is fluorescentie-intensiteit op een tijdstip t en F rest is het gemiddelde van ten minste 30 bepalingen van F verkregen tijdens de controle periode. </li></ol> Representatieve resultaten Figuur 1 toont een serie beelden uit een experiment waarin de cellen werden gestimuleerd met 3 uM progesteron. De bovenste rij en film 1 tonen de fluorescentie beelden in grijs-schaal en op dezelfde mages worden hieronder weergegeven (en in de film 2) in pseudocolor (opzoektabel &#39;16_colors &#39;in Afbeelding J), waar de&#39; cool &#39;kleuren geven een lage fluorescentie-intensiteit en &#39;warme&#39; kleuren geven een hoge fluorescentie-intensiteit. Cellen kunnen worden bekeken in pseudocolor tijdens het experiment, met behulp van lookup tabellen in IQ, maar het gebruik van grijstinten is over het algemeen meer informatief voor de beoordeling. Of de cellen zijn goed gelabeld. De eerste twee foto&#39;s werden verzameld bij 0 s en 100 s na het begin van de opname. Fluorescentie moet stabiel en heeft de neiging het sterkst in de post acrosomal gebied en sperma nek. Progesteron ging de beeldvorming kamer op ongeveer 175 s en de 3 e en 4 e foto&#39;s (180 s en 220 s) toont een snelle toename van [Ca 2 +] i (fluorescentie) van oorsprong uit posterior hoofd-halsgebied van de cel. Latere beelden worden op 290, 360, 740, 990 en 1440 s, waarin het verval van de initiële [Ca 2 +] i van voorbijgaande aard en de ontwikkeling van een secundaire aanhoudende verhoging. Figuur 2 toont een spreadsheet analyse, het omzetten van ruwe fluorescentie waarden voor elke ROI de genormaliseerde fluorescentie (% verandering in de fluorescentie ten opzichte van de controleperiode) Figuur 3 toont de tijd-genormaliseerde fluorescentie plots voor de drie cellen met &#39;typische&#39; reacties op 3 uM progesteron. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Voorbeeld van gegevens van een cel gestimuleerd met progesteron. Een reeks fluorescentie afbeeldingen in grijstinten (bovenste rij) en pseudocolor (onderste rij) worden weergegeven. Tijdstippen zijn 0, 180, 220, 290, 360 en 990s. 3 uM progesteron ging de beeldvorming kamer op 175 s. ROI staan ​​in het eerste paneel. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Analyse van enkele cel fluorescentie data in Excel. De cijfers in het zwart zijn tijdreeksen van fluorescentie data, verticaal opgesteld. Cijfers in het rood (onder) worden genormaliseerd data verkregen met behulp van de vergelijking in de tekst. Grafiek laat zien genormaliseerde fluorescentie-time plot voor de cel 64 in dit experiment waarbij, na stimulatie, toont een tijdelijke stijging van de fluorescentie, gevolgd door een langzame stijging en series van kleine oscillaties. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Fluorescentie-time sporen voor de drie individuele cellen, uitgedrukt als% verandering ten opzichte van de waarde controle .. 3 uM progesteron werd toegevoegd op het moment gemarkeerd door de pijl. Stippellijn toont de gemiddelde controle fluorescentie.

<ol><li>Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).</li>
<li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li>
</ol>

Bij het ​​succesvol zijn uitgevoerd, deze techniek maakt het opnemen van de distributie en de kinetiek van spontane en geïnduceerde Ca 2 +-signalen in het menselijk sperma. Reacties kunnen worden verkregen uit een groot aantal cellen (tot 200), dat is belangrijk omdat het menselijk sperma kan veel variatie vertonen in hun spontane en gestimuleerd Ca 2 +-signalen. Succesvolle etikettering en overleving van de cellen tijdens de opname zijn sterk afhankelijk van sample kwaliteit. Slechte monsters leveren slechte etikettering, slechte reacties en cellen kunnen sterven tijdens het opnemen. Menselijk sperma zijn zeer gevoelig voor foto-schade en we daarom gebruik maken van de minimale noodzakelijke verlichting (zowel de intensiteit en belichtingstijd) om overleving van de cel te maximaliseren en het minimaliseren van artefacten als gevolg van celdood. Een zeer gevoelige camera (het toelaat gebruik van lage-intensiteit verlichting) is een groot voordeel omdat de camera pikt een zwakke fluorescentie. Back-verlicht, EM-CCD-camera&#39;s zijn bijzonder geschikt, maar erg duur. LED-verlichting (in plaats van het gebruik van een xenon-of kwiklamp met excitatie filter verbetert ook de overleving van de cel (Nishigaki et al., 2006). Wij gebruiken geen Fura-2, ondanks de duidelijke voordelen van de ratio-metrische beeldvorming, want Fura vereist excitatie met UV-licht en omdat het noodzakelijk is om twee foto&#39;s te nemen voor elke ratio. Voor de gegevens verkregen met enkele golflengte, zichtbaar licht kleurstoffen, normalisering van de fluorescentie-intensiteit grotendeels compenseert het verschil in dye laden tussen de cellen, maar niet voor dye distributie binnen een individuele cel, en dit moet rekening worden gehouden. Hoewel enkele golflengte kleurstoffen kunnen in principe worden gekalibreerd, de nauwkeurigheid van de techniek is slecht en we doen geen poging om dit te doen. Overwegende dat de verhouding tussen gegevens, verkregen met Fura-2 (of de emissie-ratio kleurstof indo), zelfs zonder calibratie, geven een aanvaardbare getrouwe weergave van de relatieve veranderingen in [Ca 2 +] i, de fluorescentie-intensiteit van de interne golflengte kleurstoffen is verre van lineair met betrekking tot [Ca 2 +] i. Over de meest bruikbare deel van de curve verzadiging van de relatie voor enkele golflengte kleurstoffen benadert meestal logaritmische. We gebruiken momenteel Oregon Green BAPTA-1 (figuur 4), omdat het gevoelig is voor kleine veranderingen in [Ca 2 +] i dicht bij de rust niveau s (50-100 nM). Wanneer [Ca 2 +] i stijgt tot boven 1 uM reacties zullen ondervertegenwoordigd zijn in termen van fluorescentie veranderen en de kleurstof kan verzadigen. Een optie voor verbetering van de techniek zonder toevlucht te nemen tot UV-excitatie is om te laden cellen verdubbelen met een kleurstof, zoals TL-3 en Fura rood. Beide kunnen worden opgewekt bij 488 nm, maar gelijktijdig hun reacties zijn zeer verschillend. Opname van emissie bij 540 en 650 nM biedt een ratio die een betere methode voor nauwkeurige controle van de kan [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) en van toepassing kunnen zijn op sperma (Nisigaki et al., 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Relatie tussen vrije [Ca 2 +] (nM) en fluorescentie-emissie bij piek golflengte (ca. 525 nm) voor de Oregon Green BAPTA-1 en Oregon Green BAPTA-2. OGB1 geeft een hogere fluorescentie bij rust [Ca 2 +], maar verzadigt op lagere niveaus en heeft dus een kleinere bruikbare bereik. Gegevens voor deze percelen werden verkregen van de Molecular Probes handboek (Haughland, 2002).

<table><tbody><tr><td>Camera voor lage lichtniveaus</td><td>QImaging</td><td>Rolera XR</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>06807</td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>Andor</td><td>IQ</td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>Software in het publieke domein</td></tr><tr><td>LED-verlichtingssysteem</td><td>Cairn Research</td><td>Opto LED</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (20% oplossing in DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr></tbody></table>

technieken voor imaging ca 2 + signalering in human sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescentie microscopie van cellen geladen met tl-licht, Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Gevoelige kleurstoffen wordt gebruikt voor het meten van ruimtelijke en temporele aspecten van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalering in levende cellen. Hier beschrijven we de methode die in onze laboratoria voor het laden van suspensies van menselijke zaadcellen met Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Rapportage kleurstoffen en het meten van de fluorescentie-signaal tijdens de fysiologische stimulatie. Beweeglijke cellen worden geïsoleerd door middel van directe swim-up en geïncubeerd onder capacitating voorwaarden voor 0-24 uur, afhankelijk van het experiment. De cel-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester vorm van de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Rapportage kleurstof wordt dan toegevoegd aan een cel aliquot en een periode van 1 uur is toegestaan ​​voor het laden van de kleurstof in het cytoplasma. We maken gebruik van zichtbare golflengte kleurstoffen aan foto-schade aan de cellen te minimaliseren, maar dit betekent dat ratiometrische opname niet mogelijk is. Voor-en nadelen van deze aanpak worden besproken. Tijdens het laden periode cellen worden ingevoerd in een imaging kamer en liet zich te houden aan een poly-D-lysine gecoat dekglaasje aan. Aan het einde van de laad-periode overtollige kleurstof en losse cellen worden verwijderd door de aansluiting van de kamer naar de perfusie apparaat. De kamer is continu doorbloed, zijn stimuli en aangepast salines vervolgens toegevoegd aan de perfusie header. Experimenten worden opgenomen door time-lapse overname van fluorescentie beelden en in detail geanalyseerd offline, door handmatig tekenen regio&#39;s van belang. De gegevens zijn genormaliseerd om pre-stimulus niveaus zoals dat voor elke cel (of een deel van een cel), een grafiek van de Ca met<sup&gt; 2 +</sup&gt; Reactie als% verandering in de fluorescentie wordt verkregen.

Stimulus-opgeroepen [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] I signalen van individuele menselijke zaadcellen worden beoordeeld. Beweeglijke cellen worden geladen met Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Gevoelige fluorescente kleurstof (AM-ester-methode) en geïmmobiliseerd in een perfusable kamer. Cellen worden afgebeeld door de time-lapse fluorescentie microscopie en gestimuleerd via de perfuseren medium. Reacties van enkele cellen (of regio&#39;s) worden geanalyseerd offline met behulp van Excel.

Technieken voor Imaging Ca 2 + Signalering in Human Sperm

Fluorescentiemicroscopie van cellen die zijn geladen met fluorescerende, Ca2+-gevoelige kleurstoffen wordt gebruikt voor het meten van ruimtelijke en temporele aspecten van Ca2+-signalering in ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van beeldseries van geïmmobiliseerde menselijke spermacellen die zijn gelabeld met een fluorescerende calciumreporter-kleurstof. Motiele cellen worden uit het seminale plasma geïsoleerd door ze naar boven te laten zwemmen in incubatiemedium. Na capacitatie worden de cellen gelabeld met een fluorescerende calciumindicator en vervolgens overgebracht naar een fusibele beeldkamer, die is gemonteerd op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop.Responsies van de calciumionconcentratie worden vastgelegd als een time-lapse beeldserie en geanalyseerd om responsies van individuele cellen te extraheren. Hallo, ik ben Edwin Andres Morales Garcia van het laboratorium van Dr. Steven J. Public Cova aan de School of Biosciences van de University of Birmingham, Verenigd Koninkrijk. Ik ben Katherine Nash, eveneens van de Public Overlap.En ik ben Jennifer Morris van het Public Overlap. Vandaag laten we u de procedure zien voor het in beeld brengen van intracellulaire calciumresponsen in individuele menselijke spermatozoa. Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de regulatie van sperma-activiteiten te bestuderen aan de hand van stimuli afgeleid van de eicel en het vrouwelijke tractus.Laten we beginnen. Bewaar spermaproeven gedurende maximaal 30 minuten na het moment van collectie bij 37 °C om motorele cellen uit het seminale plasma te isoleren. Pipetteer 1 mL L'S-gebalanceerde zoutoplossing aangevuld met 0,3% BSA, afgekort als S-E-B-S-S, in een reeks polystyreen buisjes van 5 mL met een ronde bodem. Voeg voorzichtig 0,3 mL sperma toe aan de S-E-B-S-S in elk buisje en sluit het buisje losjes af.Incubeer de buisjes in een hoek van 45 graden gedurende één uur bij 37 °C en 6% koolstofdioxide. Om beweeglijke cellen de mogelijkheid te geven naar het S-E-B-S-S te zwemmen, wordt de bovenste 0,7 ml van de oplossing voorzichtig afgepipetteerd en worden de oplossingen uit alle buisjes overgebracht naar een schone polystyreen centrifugebuis van 15 ml. Schud voorzichtig om te mengen en tel de cellen die met formaline zijn geïmmobiliseerd in een nieuwe Bürker-teltablet.Breng de concentratie naar 6 miljoen cellen per milliliter in S-E-B-S-S en verdeel het sperma in aliquoten van 200 µL in polystyreen ronde bodembuisjes van vijf milliliter. Sluit de dopjes losjes. Indien de respons van gecapaciteerde cellen wordt bestudeerd, worden de buisjes vijf tot zes uur geïncubeerd bij 37 °C en 6% CO2 om capacitatie mogelijk te maken. Breng 10 µL van 10% polylysine aan als een reeks kleine druppels in het centrum van een objectglas van 22 bij 50 millimeter.Nummer één dekglas en laat het volledig drogen. Gebruik vacuümvet om het dekglas met de behandelde zijde naar boven te bevestigen aan een hiervoor gebouwde fuseerbare beeldkamer.Select voor elk imaging-experiment één buisje gecapaciteerde cellen en voeg 1,2 µL van 2,5 mg/mL calciumafhankelijk organ green opgelost in DMSO toe voor een eindconcentratie van 10 µM. Incubeer het buisje 40 minuten bij 37 °C en 6% CO2.Verwijder met een 200 µL Pipet met een P 200 tip alle vloeistof volledig uit de buis. Vul de kamer door voorzichtig in de instroompoort te injecteren. Kantel de kamer zodat luchtbellen via de uitstroom kunnen ontsnappen.Plaats de gehele kamer in de incubator en incubeer deze nog 20 minuten bij 37 °C en 6% koolstofdioxide. Dit dient om de spermacellen aan de poly-D-lysine te laten hechten. Bevestig de kamer aan de omgekeerde fluorescentiemicroscoop en sluit deze aan op het perfusieapparaat.Laat het preparaat ten minste 10 minuten in het donker staan zodat de perfusie kan wegspoelen. Bekijk losse cellen en extracellulaire debris onder fasecontrast bij een vergroting van 40 x of 60 x; kies een gezichtsveld waarin de celafstand voldoende is om de fluorescentie van elke cel afzonderlijk te kunnen beoordelen. De cellen moeten adequaat gehecht zijn, maar bij voorkeur duidelijke fledger-activiteit vertonen.Schakel de microscoop over naar het groene fluorescentiekanaal. Houd de belichtingstijden op het minimum dat nodig is voor een helder fluorescentiebeeld om fotobleken in de IQ-software te verminderen.Activeer de tijdreeksbeeldacquisitie. Neem beelden op met een frequentie van 0,1 hertz en gebruik een softwaregestuurde sluiter om de belichting te beperken. Neem aanvankelijk op gedurende een controleperiode van drie tot vijf minuten, manipuleer vervolgens de calciumconcentratie van de zoutoplossing en dien geneesmiddelen toe door de zoutoplossing bij de header van het perfusiesysteem te vervangen.Noteer het tijdstip waarop elke stimulus aan de header wordt toegevoegd en bereken de aankomsttijd in de kamer zoals beschreven in het geschreven gedeelte van dit protocol. Om afbeeldingen offline te analyseren, gebruikt u een van de tekentools om een region of interest of ROI te omlijnen rond elke cel of een deel van een cel; in dit geval de posterieure kop van de spermatozoïed, omdat opgeslagen calcium in dit gebied wordt gemobiliseerd. Gebruik de schuifbalk om door de beeldserie te scrollen.Identificeer en verwijder cellen die niet volledig binnen de ROI blijven, andere cellen overlappen of een grote en snelle toename gevolgd door een scherpe daling van de fluorescentie-intensiteit hebben vertoond, wat kenmerkend is voor celdood. Gebruik de analysefunctie om een tijdserie van de fluorescentie-intensiteit voor elke ROI te genereren. De gegevens kunnen vervolgens worden geëxporteerd en geanalyseerd in een spreadsheet.Deze afbeeldingen zijn afkomstig uit een serie die is verkregen tijdens stimulatie met drie micromolair progesteron. De onderste rij is voorzien van pseudokleur. Om relatieve intensiteitsveranderingen beter te illustreren, is het progesteron hier de kamer binnengekomen.Deze resultaten zijn geanimeerd in een time-lapse video. Let op de snelle piek in fluorescentie-intensiteit, gevolgd door een langzame toename, wat duidt op overeenkomstige veranderingen in de intracellulaire calciumspiegels. Deze gegevens zijn hier gekwantificeerd op basis van de gemiddelde intensiteiten van het posterieure hoofd van drie cellen.Drie micromolar progesteron werd toegevoegd op het tijdstip dat door de pijl wordt aangegeven. De stippellijn toont de gemiddelde controllevlorescentie. Vandaag hebben we u laten zien hoe u kwalitatief goede cellen isoleert, deze laadt met een calciumgevoelige kleurstof en de respons van individuele cellen op stimulatie monitort.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat u de best mogelijke celpopulatie gebruikt; minimaliseer daarnaast de belichting van de cellen om fotobeschadiging te voorkomen en kies de kleurstof die het beste aansluit bij de responsen waarnaar u op zoek bent. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.

Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Dit protocol beschrijft hoe elektrische opnames van zaadcellen van zoogdieren in een configuratie van de hele cel kunnen worden uitgevoerd, met als doel de activiteit van het ionkanaal direct vast te leggen. De methode heeft een belangrijke rol gespeeld bij het beschrijven van de elektrofysiologische profielen van verschillende sperma-ionkanalen en heeft geholpen om hun moleculaire identiteit en regulatie te onthullen.

Registratie van elektrische stromen over het plasmamembraan van zaadcellen van zoogdieren

Het huidige protocol biedt een praktische oplossing die het mogelijk maakt om apoptose, mitochondriaal membraanpotentiaal en DNA-schade in menselijk sperma te meten met een enkele cytometer.

Flowcytometrische analyse van biomarkers voor het detecteren van functionele defecten van menselijk sperma

Het AcroSensE-muismodel en de hier beschreven beeldvormingsmethoden voor levende cellen bieden een nieuwe benadering voor het bestuderen van de calciumdynamiek in het subcellulaire compartiment van het sperma-acrosoom en hoe deze tussenstappen reguleren die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.

Real-time beeldvorming van acrosomale calciumdynamiek en exocytose in levend muizensperma

Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken...

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Een efficiënte methode om inzicht te krijgen in het visualiseren van de paracriene afgeleide ROS inductie van endotheliale Ca2 + signalering wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van het meten van paracriene afgeleid ROS geactiveerd Ca2 + mobilisatie in vasculaire endotheliale cellen in een co-cultuur model.

Visualisatie van vasculaire Ca 2 + Signalering Geactiveerd door Paracriene Derived ROS

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire...

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

Leer calciumsignaalbeeldvorming in menselijke spermacellen met behulp van tijdverloopfluorescentiemicroscopie. Deze methode maakt analyse van individuele celreacties op stimuli mogelijk.

Technieken voor Imaging Ca^{2 +} Signalering in Human Sperm

Meer video's verkennen