Name: Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Leer primaire neuronale culturen bereiden uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Deze methode toont neurietuitgroei en calciumbeeldvorming met Fura-2 voor onderzoek naar neuronale ontwikkeling en activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​NS27501 naar DKOD. Extra ondersteuning voor dit werk werd geleverd door een subsidie ​​aan UC Irvine ter ondersteuning van DKOD via de HHMI Professor Program.

Voorbereidingen voor de dag van het kweken: <ol><li> Maak steriele ontleden oplossing. </li><li> Maak steriel DMEM en te houden in 10 ml bij 4 ° C gedurende 2 weken. </li><li> Maak steriel DDM2 supplementen en vries in 50 of 100 ul porties voor 1 maand. </li><li> Maak ConA / laminine. </li><li> Vacht dekglaasjes. Optioneel: Maak steriele CNBM en op te slaan ingevroren voor maximaal 4 maanden. </li></ol> Op de dag van het kweken van I. Bereid Enzyme Solution (ES) in laminaire flow hood <ol><li> Doe 5 ml ontleden oplossing (DS) in een 15 ml centrifugebuis. </li><li> Weeg 0,8 mg van L-cysteïne in een 0,6 ml Eppendorf en voeg 150 ul van de DS. Pipet op en neer tot er kristallen zijn verdwenen. </li><li> Voeg 150 ml van de DS / Cysteïne om de 5 ml DS en meng goed. </li><li> Voeg 50 U (eenheden) van papaïne. </li><li> Voeg 7 ml 0,1 N Na OH en meng goed. Oplossing zal duidelijk binnen 30 minuten. wanneer geactiveerd. </li><li> Filter enzym oplossing met 0,2 mm spuit filter in een steriele 1,5 ml schroefdop microfugebuisje Papaïne: Wil je 50 E in 5 ml DS. Elke partij is iets anders, dus moeten berekenen hoeveel: 37,3 mg / ml en 28,3 U / mg 37,3 x 28,3 = 1055,59 U / ml (1000 ml) 50 U = 47,4 ml </li></ol> II. Maak DDM2 media Op de dag van het kweken: voeg de volgende aanvullingen op DDM2 maken Tot 10 ml van DMEM voeg de supplementen, net voor het kweken van: <ol><li> 100μl Transferrine </li><li> 100μl putrescine </li><li> 100μl Selenium </li><li> 100μl Progesteron </li><li> 50μl Insuline </li><li> 10μl 20-hydroxyecdyson </li></ol> Let op: Maak genoeg DDM2 voor de geplande alle culturen (elk brein uitgeplaat op een dekglaasje in een individueel 35 mm petrischaal, 1,5 ms van de media / cultuur) Stap III-VI kan op een niet-steriele lab gedaan bank en moet worden voltooid in 45 minuten of minder. III. Poppen Collection <ol><li> Kies 10-15 poppen uit zijden van flacon onder een dissectie microscoop. </li><li> Plaats poppen in het deksel van een droge 35 mm petrischaal. </li></ol> Opmerking: Wij over het algemeen hersenen gebruiken van poppen tussen 55-78 uur na puparium vorming (APF). Het is iets moeilijker te ontleden van de hersenen van de jongere poppen, omdat het hoofd capsules hebben de neiging in te storten, terwijl het algemene niveau van neurietuitgroei is iets lager uit de oudste poppen. In het kanton-S wildtype stam, worden deze stadia herkend door gepigmenteerde ogen die zijn licht bruin tot licht roodachtig, met weinig pigment elders. IV. Onthoofding in dissectiemicroscoop <ol><li> Plaats twee druppels steriele ontleden oplossing in het deksel van de petrischaal, naast de poppen. </li><li> Voorzichtig bezit zijn van een enkele pop met fijne tang in de linkerhand en gebruik een 27 gauge naald bevestigd aan een 1 cc spuit in de rechterhand om de cuticula te verwijderen aan het voorste einde van de pop. </li><li> Knijp een beetje pop met een pincet en het hoofd naar voren komt te gebruiken 27 gauge naald voor aan de hals verbreken. </li><li> Met de punt van de naald of de tang, transfer hoofd te laten vallen van het ontleden oplossing. </li><li> Herhaal dit tot je 10 tot 15 koppen in een enkele druppel. </li></ol> V. Het verwijderen van de hersenen van hoofd onder dissectiemicroscoop <ol><li> In elke hand bezit zijn van een 1 cc injectiespuit met een 27 gauge naald. </li><li> Gebruik deze om de vliegen kop positie in de daling van ontleden oplossing, zodat de snuit is naar u toe en het dorsale oppervlak van de kop is het noorden. </li><li> Steek de linkernaald in de proboscis aan het hoofd vast te pinnen en het recht naald te gebruiken om een ​​spleet te maken in het rechter oog, dat gaat van de ventrale naar het dorsale oppervlak. </li><li> Steek de rechternaald de buurt van de links in de regio van de proboscis en gebruik vervolgens de linker naald om de cuticula zachtjes drukken over het linker oog, waardoor de hersenen in de richting van de gleuf in het rechter oog. De hersenen moeten komen uit de gleuf aan de rechterkant, relatief intact, vaak met zowel optische lobes nog steeds vast en soms ook de gepigmenteerde oogweefsel ook. </li><li> Duw de hersenen op de achterkant van de naald en transfer naar een daling van de steriele zoutoplossing in het ontleden van een nieuwe steriele, 35 mm petrischaaltje. </li><li> Verzamel 10-15 hersenen voor elk genotype. </li></ol> VI. Verwijdering van optische lobben en enzym behandeling <ol><li> In elke hand bezit zijn van een 1 cc injectiespuit met een 27 gauge naald en deze gebruiken om alle breinen te verzamelen in een klein gebied van de druppel ontleden oplossing </li><li> Gebruik spuiten bijvoorbeeld snijgereedschap aan de optische kwabben te verwijderen uit elke hersenen, zodat het weefsel nog voor cultuur is het centrale hersengebied. </li><li> Gebruik een 20 ul Pipetman, vastgesteld op 5 pi, om alle de hersenen van een enkel genotype transfer naar een Eppendorf buisje met 1 ml van de steriele papaïne oplossing. </li><li> Hersenen geïncubeerd in papaïne voor 10-15 minuten op een rotator ingesteld op 60 rpm. </li><li> Centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 3 minuten. </li></ol> Binnen steriele laminaire stroming capuchon - alle stappen waar weefsel wordt blootgesteld aan lucht moet worden gedaan in laminaire stroming kap voor de resterende stappen. VII. Het wassen <ol><li> Verwijder de enzym oplossing en te vervangen door steriele ontleden oplossing. </li><li> Centrifugeer bij 3000 rpm gedurende 3 minuten. </li><li> Wassen met steriele ontleden oplossing een totaal 3 keer. </li><li> Verwijder ontleden zout en te vervangen door DDM2. </li><li> Centrifuge en was een totaal van 2 keer met DDM2. </li><li> Overdracht hersenen en media om een ​​steriele 35 mm petrischaal. </li></ol> VIII. Aanwrijving en Plating onder dissectiemicroscoop <ol><li> Plaats 5 ul van DDM2 in het centrum van een dekglaasje aan. </li><li> Overdracht een hersenen om deze daling van DDM2 met een gele punt. </li><li> Onder de microscoop, gebruik van 27 gauge naalden te puntentotaal hersenen in kleine stukjes (moet &lt;1 minuut duren). </li><li> Onder visuele begeleiding, breek het uiteinde van een glazen pipet die is getrokken op een fijne punt, zodat de grotere stukken kan voorzichtig worden gezogen in de punt van de pipet en verdreven terug in het medium. We maken gebruik van mond zuig-buizen die worden standaard geleverd met 100 ul hematocriet capillaire glas. Let op: Zorg ervoor dat u bubbels te krijgen in de media en je moet empirisch bepalen wat de beste grootte pipet te gebruiken. Goeden kunt u naar de hersenen scheiden met een aantal individuele cellen en nog steeds enkele grote klompen, in ongeveer 30 seconden / hersenen. Wanneer je kijkt naar deze bij een hogere macht, moet ongeveer 10-20% van de neuronen hebben nog een aantal processen nog, en er zal nog een paar grote klonten. Als u te veel losmaken, vervolgens alle cellen zullen worden rond en zij zullen hebben geleden zoveel schade zullen ze niet overleven. Deze stap vraagt ​​oefening en moet snel worden gedaan, omdat er een grote oppervlakte-volume verhouding en de osmolaliteit en de pH van de daling van DDM2 kan snel veranderen. Weefsel moet worden geplaatst in CO 2 incubator zo snel mogelijk. </li><li> Schrijven op het petrischaaltje deksel: &quot;Genotype, datum en tijd&quot;. </li><li> Zet de 35 mm petrischaal in een 100 mm petrischaal (met natte kimwipe) en laat zich in de CO 2 incubator gedurende 30 minuten. </li><li> Overstroming van de 35 mm gerecht met 1,5 ml DDM2. </li><li> Houd culturen in de incubator bij 5% CO 2 incubator (23 ° C). Opmerking: Als u geen toegang hebt tot een afkoeling van CO 2 incubator, gebruik dan een standaard weefsel van zoogdieren cultuur incubator en of het in een koele ruimte en warmte tot 23 ° C, of zet in het lab, uit te schakelen temp en gebruik ijs in een lade aan de onderkant van de incubator op temp regelen rond ambient. </li></ol> IX. Feeding Cellen <ol><li> Op dag een (volgende dag), voeg 0,5 ml van CNBM/B27 (geconditioneerde media) om 03:01 DDM2 maken: CNBM/B27. </li><li> Op dag 5 vervangen door 1 ml van de media voor 03:01 DDM2: CNBM/B27. </li><li> Blijven voeden cellen met 3:01 DDM2: CNBM/B27 om de 4-5 dagen. Opmerking: Culturen kan worden geteeld zonder de niet-neuronale geconditioneerde media, maar de neuronen lijken een beetje meer kwetsbaar en zijn moeilijker voor gebruik in de elektrofysiologie experimenten. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

Neuronen geoogst uit de hersenen van het embryo / de postnatale knaagdieren kunnen worden gekweekt in de primaire cel cultuur waar ze uit te breiden neurieten en vormen functionele synaptische verbindingen. Methoden voor de voorbereiding van deze culturen zijn goed ingeburgerd en studies in knaagdieren neuronale culturen hebben een cruciale rol gespeeld bij het identificeren van genen en omgevingsfactoren betrokken zijn bij de regulering van synapsvorming en functie (Banker en Goslin, 1991). Terwijl insect neuronen uit een verscheidenheid v...

Coating Dekglaasjes: Zet geautoclaveerd dekglaasjes in een 60 mm petrischaal. Pipetteer 5 ul van Con A / Laminine mix op midden van elk dekglaasje aan. Plaats in 37 C incubator gedurende 2 uur. Spoel 3x coverslips met 100 ul van geautoclaveerd water per stuk. Gebruik stofzuiger bevestigd aan een steriele Pasteur pipet. Tijdens de laatste spoeling, pak het dekglaasje met een tang en droog beide kanten. Breng het dekglaasje met een 35mm petrischaal. Bewaren bij kamertemperatuur tot maximaal een maand.

primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium drosophila poppen

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In deze video, tonen we de voorbereiding van de primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. De procedure begint met het verwijderen van hersenen van dieren op 70-78 uur na puparium vorming. De geïsoleerde hersenen worden weergegeven na een korte incubatie in papaïne gevolgd door verschillende wasbeurten in serum-vrij groeimedium. Het proces van mechanische dissociatie van elk brein in een 5 ul druppel van media op een dekglaasje wordt geïllustreerd. De axonen en dendrieten van de post-mitotische neuronen zijn sheered uit de buurt van de soma tijdens dissociatie, maar de neuronen beginnen te regenereren processen binnen een paar uur in de platen. Beelden tonen levende culturen op 2 dagen. Neuronen blijven om processen te werken tijdens de eerste week in de cultuur. Specifieke neuronale populaties kunnen worden geïdentificeerd met behulp van cultuur GAL4 lijnen om weefselspecifieke expressie van fluorescente merkers zoals GFP of RFP rijden. Hele cel opnames hebben aangetoond dat de gekweekte neuronen vorm functionele, spontaan actief cholinerge en GABA-erge synapsen. Een korte video-segment illustreert calcium dynamiek in de gekweekte neuronen met behulp van Fura-2 als een calcium indicator kleurstof tot spontane calcium transiënten en nicotine opgewekt calcium reacties in een schotel van gekweekte neuronen te controleren. Deze pop-hersenen culturen zijn een bruikbaar model systeem waarin genetische en farmacologische middelen kunnen worden gebruikt om intrinsieke en extrinsieke factoren die de vorming en de functie van centrale synapsen beïnvloeden te identificeren.

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Standpunten van levende culturen tonen neurietuitgroei en beeldvorming van calcium niveaus met behulp van Fura-2.

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

In deze video demonstreren we de preparatie van primaire neuronale culturen uit de hersenen van Drosophila-poppen in een laat stadium. De procedure begint met de ...

Mijn naam is Diana Dowd en ik ben professor bij de afdelingen Anatomie en Neurobiologie en Ontwikkelings- en Celbiologie hier aan uc Irvine. Vandaag ga ik u vertellen over de preparatie van neuronale culturen uit Drosophila-poppen. Dit omvat het verwijderen van de hersenen uit poppen in een laat stadium, waarbij we doorgaans alleen de centrale hersenregio kweken.In dit stadium zijn de belangrijkste anatomische structuren die in het volwassen brein aanwezig zijn, al gevormd. Dit omvat de antennelobben, waarin projectieneuronen zich bevinden die hun axonen helemaal naar de regio van het paddenstoellichaam sturen, en de neuronen van het paddenstoellichaam, de Kenyon-cellen, die hun axonen via de alfa-, bèta- en gammalobben naar hun doelneuronen hebben gestuurd. Op de dag van het kweken is het eerste wat we doen het betreden van de laminaire flowkast, waar we steriel de enzymoplossing voorbereiden die we zullen gebruiken om het weefsel te dissociëren.Daarnaast bereiden we het medium voor dat we zullen gebruiken voor het kweken van de cellen. Dit wordt gemaakt van stocks die we vooraf hebben klaargezet. De volgende stap is het verzamelen van de pupae die we zullen gebruiken voor deze dissociatie of voor de dissectie.En dat gebeurt buiten de zuurkast, omdat ze worden gekweekt in flesjes die gist en allerlei andere stoffen bevatten. Daarom voeren we de beginfasen van onze dissectie buiten de zuurkast uit. Dit zijn exemplaren die ik zojuist van de wanden van een flesje heb gehaald, en in de linkerrij hebben we dieren met rode ogen die zich in een geschikt stadium bevinden voor het kweken.Deze zijn iets, deze PPP hier zijn iets jonger. Ze hebben oranje of gele ogen, en dit is een prima 1 0 7 lijn. Ze hebben iets helderdere ogen dan normale wild types, waarbij de kleur in deze stadia iets bruiner zou zijn.Al deze fasen zijn geschikt voor het kweken, voor het maken van de cerebrale culturen. Oké, de eerste stap hier is om een paar druppels dissectie-oplossing direct naast de pupae te plaatsen die ik heb uitgehaald en op een rij heb gelegd in mijn Petrischaal. We gebruiken de deksels van 35 millimeter Petrischalen.Vervolgens neem ik een pincet nummer vijf in mijn linkerhand en een tuberculinespuit van 1 CC met een naald van 27 gauge aan het uiteinde. Dit zijn mijn twee dissectie-instrumenten. Om de kop uit de pupilhouder of uit de pupi te verwijderen, houd ik de pupi met het pincet in mijn linkerhand vast en gebruik ik vervolgens de naald in mijn rechterhand om de voorkant van de pupilhouder te verwijderen.Vervolgens plaats ik de trekactie terug bij de cuticula-bedekking, waardoor de kop aan de voorkant naar buiten komt. Met mijn naald doorsnij ik vervolgens de verbinding bij de nekregio, waarna ik de kop oppak en in de druppel dissectiesaline plaats. Ik herhaal deze procedure 10 tot 15 keer, omdat ik voor een goede cultuur graag 10 tot 15 dieren van elk genotype heb.Ik ga nu de hersenen uit de kop van het dier verwijderen. Hiervoor gebruik ik twee tuberculinespuiten, elk voorzien van een naald met een diameter van 27 gauge. De linker naald plaats ik direct door de psis van het dier om de kop op de bodem van de Petrischaal vast te pinnen.Daarna gebruik ik mijn rechternaald om een opening aan de rechterkant te maken, en daar zal ik de hersenen uitdrukken. Oké, en de volgende stap is om mijn linkernaald boven het linkeroog te plaatsen. Nu ga ik deze echt naar buiten duwen en de hersenen zouden aan de rechterkant door de opening naar buiten moeten komen.Daar komt het. Je kunt het aan de rechterkant zien, en nu kan ik mijn rechternaald gebruiken om het te scheiden van de rest van de kopcapsule en de ogen. Oké. Nu, voordat ik de laatste dissectie uitvoer, waarbij de optische lobben worden verwijderd, breng ik de hersenen over naar een schone druppel zoutoplossing.Ik kan hiervoor een pipet gebruiken, waarbij ik het opneem met de uiterste punt van een 20 µL pipet die is ingesteld op 5 µL, of ik kan het ook met de naalden overbrengen. Dit is de laatste fase van de dissectieprocedure. Dit wordt uitgevoerd in een verse druppel fysiologische zoutoplossing, en gewoonlijk heb ik hier ongeveer 10 tot 15 hersenen in.Vervolgens verwijder ik de optische lobben van elk exemplaar door de 27 gauge naalden als snijinstrumenten te gebruiken; ik doorsnij eerst de linker optische lob en daarna de rechter optische lob van elk brein. Op dit punt worden alle breinen die op deze wijze zijn bewerkt overgebracht naar een buisje met de enzymoplossing, die wordt gebruikt voor de enzymatische dissociatie. Alle breinen van een enkel genotype worden in één enkel epi screw cap eppendorf buisje geplaatst dat 1 mL enzymoplossing bevat.Vervolgens plaatsen we ze in een reageerbuishouder en zetten we ze op een rotator, waar ze 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur blijven staan. Dit is de eigenlijke dissociatietijd. Om de enzymdissociatiestap te voltooien, moeten we het enzym vervolgens verwijderen.Vervolgens brengen we de buisjes naar een EOR-centrifuge, plaatsen de buisjes in de centrifuge en centrifugeren we deze gedurende drie minuten bij 3000 RPM. Nadat de hersenen zijn gecentrifugeerd, brengen we ze naar onze laminaire flowkast. Hier begint het steriele deel van de procedure.We open de buis nu alleen wanneer we ons in de laminaire flowkast bevinden, en we zullen nu de enzymoplossing verwijderen. We vervangen deze door dissectie-oplossing en centrifugeren en wassen vervolgens een aantal keer, eerst met dissectie-oplossing en uiteindelijk met een gedefinieerd medium, waarin we de cellen kweken. Oké.Het eerste wat ik moet doen, is een druppel van 5 µL saline aanbrengen op elk van de dekglasjes in deze Petrischalen. Er bevindt zich één dekglasje per Petrischaal, dat is gecoat met laminine, dus ik plaats een druppel van 5 µL precies in het midden van het dekglasje. Daar bevindt zich mijn druppel laminine.Het is zeer belangrijk om de cellen precies in het midden van het gezichtsveld te concentreren, omdat we ongeveer 10.000 cellen per brein verkrijgen, en dat is de hoeveelheid waarmee we een enkele cultuur maken. Goed, als we nu door de microscoop kijken, zien we hier negen breinen die al door de enzymatische dissociatieprocedure zijn gegaan. Je kunt zien dat ze nog grotendeels intact zijn.De optische lobben ontbreken; deze zijn verwijderd, dus we hebben alleen het centrale hersengebied over. Nu ga ik een enkel brein opzuigen met de pipet en dit verplaatsen naar de druppel van 5 µL op een dekglas. Dit doe ik vier keer.Ik neem twee spuiten van 1 cc waar ik naalden met maat 27 op bevestig. Nogmaals, het is echt belangrijk om op te merken dat dit zeer goedkope en wegwerpbare dissectie-instrumenten zijn, zodat studenten dit kunnen doen zonder zich zorgen te maken over het budget. Oké, nu ik de twee naalden heb, ga ik over tot de initiële mechanische dissociatie, waarbij ik deze hersenen in verschillende stukjes snijd. Hierdoor kan ik deze stukjes over een minuutje in een glazen pipet opzuigen om de uiteindelijke dissociatie te voltooien.Wanneer ik dit doe, maak ik er geen minuscule stukjes van; ik wil alleen de totale grootte verminderen, zodat de pipet bij de dissociatie iets kleinere stukjes opzuigt dan het volledige brein. Ik wil dit ook relatief snel doen, omdat de druppels medium klein zijn. Dit betekent dat we een hoge oppervlakte-volumeratio hebben en dat zowel de pH als de osmolariteit van de oplossing kunnen veranderen als ik het gedurende langere tijd laat staan.Toen ik hiermee begon, deed ik slechts twee hersenen tegelijk, twee culturen tegelijk. Nu doe ik er meestal vier, en nu ga ik de pipet breken, maar daar mag ik niets over zeggen, toch? Deze heb ik net voltooid.De dissociatie, de grootte van de pipet was vrij goed. Ik kon het weefsel een paar keer opzuigen en weer uitstoten, en u kunt individuele cellen zien; we hebben nog steeds klonters, maar dat is prima. Die zullen worden weggewassen.Nu worden de culturen, zodra ze zijn uitgeplaat, in een tweede Petrischaal geplaatst en binnen enkele minuten in de CO2-incubator gezet, omdat we ervoor willen zorgen dat de pH en de osmolariteit op een niveau blijven dat hun overleving ondersteunt. We plaatsen ze hier dus 30 minuten in voordat we de schaal vullen. Deze culturen werden geprepareerd uit de hersenen van poppen in een laat stadium.De cultuur is gedurende twee dagen gekweekt in een CO2-incubator, en individuele cellen met uitlopers zijn zichtbaar. De mate van uitloperontwikkeling is geringer dan wat u na vijf dagen zou zien en groter dan wat u na één dag zou zien. Mijn naam is Jorge Ano.Ik werk in het laboratorium van Doubts. Ik ga jullie nu laten zien hoe we het experiment uitvoeren, het calcium-imaging-experiment in de celculturen die we zojuist hebben voorbereid. Dit is een video van een calcium-imaging-experiment waarin blauwe cellen een laag calciumgehalte aangeven en rode cellen een hoog calciumgehalte.We zullen zien dat sommige cellen rood kleuren, wat duidt op een toename van de intracellulaire calciumspiegels. Deze zijn spontaan en transient. Na verloop van tijd keren ze terug naar basale calciumspiegels, en na enige tijd zullen we een middel toedienen, in dit geval nicotine, waarna u zult zien dat de cellen de intracellulaire calciumspiegels verhogen.We dienen nicotine toe gedurende 100 seconden, waarna we de nicotine verwijderen, waarna de cellen terugkeren naar de basale calciumwaarden. Het echte voordeel van dit culturesysteem is dat we in staat zijn om onze culturen te maken van zowel transgene als mutante vliegenlijnen, waarbij in verschillende lijnen verschillende subpopulaties neuronen zijn gelabeld met GFP. Dit is het brein van een van de gebruikte lijnen waarin GFP tot expressie komt in het mushroom body, de Kenyon-cellen; neuronen die betrokken zijn bij het mediëren van complex gedrag, waaronder leren en geheugen.De cellichamen bevinden zich in het dorsale aspect van het brein, rond het gebied waar de rode pijlen staan. En deze L-vormige structuren die GFP-positief zijn, zijn in feite de axonale projecties van deze mushroom body Kenyon-cellen. Na dissociatie van dit breinweefsel.De neuronen regenereren hun uitlopers in cultuur, waardoor de GFP-positieve Kenyan-cellen in dit geval eenvoudig te identificeren zijn. Deze zijn toegankelijk voor zowel standaard elektrofysiologische registraties als calcium-imagingstudies. Daarom zijn deze culturen zeer nuttige instrumenten voor het onderzoeken van de genetische en omgevingsfactoren die belangrijk zijn bij het reguleren van de functie van neuronen waarvan we weten dat ze een belangrijke rol spelen bij het bemiddelen van complex gedrag in het volwassen dier.

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

Dit artikel beschrijft een werkwijze waarbij men kunnen...

Ex vivo kweken van Whole, Het ontwikkelen van Drosophila Brains

This video demonstrates a protocol to identify exogenous factors that initiate the reactivation of Drosophila brain neural stem cells from their quiescent state. Freshly hatched larvae are dissected to isolate their brains, which are then cultured in media with or without a test hormone to evaluate the hormone's potential to induce neural stem cell reactivation and proliferation.

Analyzing Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Een blessure paradigma met behulp van de Drosophila larven ventrale zenuw koord aan het centrale zenuwstelsel regeneratie en reparatie te onderzoeken wordt beschreven. Stekende gevolgd door laser scanning confocale microscopie in time-lapse en vaste monsters, gecombineerd met kwantitatieve analyse met doelgericht ontwikkelde software en genetica, worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van CNS regeneratie en reparatie onderzoeken.

Een blessure Paradigm aan het centrale zenuwstelsel Reparatie Onderzoek in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila S2 cellen en gekweekte neuronen zijn zeer geschikt voor beeldvorming van motor aangedreven organel transport in vivo. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor het kweken van beide celtypen, hun beeldvorming en analyse van het vervoer.

Organel Transport in gekweekte Drosophila Cellen: S2 cellijn en primaire neuronen.

Immuunkleuring is een effectieve techniek voor het visualiseren van specifieke celtypen en eiwitten in weefsels. Door het gebruik van sonicatie vermindert het hier beschreven protocol de noodzaak om Drosophila melanogaster weefsels van laat-stadium embryo's en larven te dissekeren voordat immunokleuring wordt uitgevoerd. We bieden een efficiënte methodologie voor de immunokleuring van formaldehyde-gefixeerde hele larven.

-Sonicatie vergemakkelijkt immunofluorescentiekleuring van Late-fase embryonale en larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Weefsels<em&gt; In Situ</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het toebrengen van penetrerend traumatisch hersenletsel (PTBI) aan volwassen Drosophila en het onderzoeken van de resulterende neurogenese.

Stimuleren en analyseren van volwassen neurogenese in de drosophila centrale hersenen

Er is een methode vastgesteld om rustige neurale stamcellen in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten te reactiveren. Met behulp van deze methode kan de rol van systemische signalen worden losgekoppeld van weefselintrinsieke signalen in de regulatie van neurale stamcelrust, in- en uitgang.

Neurale stamcelreactivatie in gekweekte Drosophila-hersenexplantaten

Leer primaire neuronale culturen bereiden uit de hersenen van laat stadium Drosophila poppen. Deze methode toont neurietuitgroei en calciumbeeldvorming met Fura-2 voor onderzoek naar neuronale ontwikkeling en activiteit.

Primaire neuronale culturen uit de hersenen van laat stadium Drosophila Poppen

Meer video's verkennen