Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val

Om de buigstijfheid van individuele coli-cellen te bepalen, moeten de bacteriën eerst worden gekweekt tot de exponentiële fase en vervolgens worden gehecht aan het oppervlak van een chemisch behandeld dekglasplaatje. Laat de cellen die reeds aan het oppervlak zijn gehecht verder groeien, zodat ze flexibele uiteinden ontwikkelen. Voer vervolgens diëlektrische kraaltjes in, vang een kraaltje op en buig dit naar de flexibele tip van een cel.

De laatste stap van de procedure is het buigen van de cel met de optische pincet en het meten van de resulterende gegevens van de gedwongen verplaatsing. De buigstijfheid van de cel kan worden berekend via een lineaire fit van de gegevens van de gedwongen verplaatsing. Hallo, ik ben Steven Wong van het laboratorium van professor Joshua Shere aan het Louis Sickler Institute of Integrative Genomics en de afdeling Natuurkunde aan de Princeton University.

Vandaag laten we u een procedure zien voor het buigen van individuele eco-cellen en het meten van de celstijfheid. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de bijdragen van verschillende intracellulaire structuren aan de mechanische integriteit van bacteriële cellen te bestuderen. Laten we beginnen.

Om deze procedure te starten, worden drie milliliter van willekeurige E. coli cellen in LB-medium gekweekt tot de exponentiële fase. Zodra de cellen een optische dichtheid bij 600 nanometer bereiken van tussen 0,2 en 0,4, wordt de cultuur gedurende 15 minuten aangevuld met 50 microgram per milliliter cefalexine om filamenteuze groei te induceren. Maak tijdens deze 15 minuten een flowkamer.

Plak twee stukjes dubbelzijdige tape met een tussenruimte van drie millimeter op een glazen objectglas en plak daar een dekglas bovenop. De ruimte tussen de stukjes tape vormt een kanaal voor de vloeistofstroom. Coat het dekglas met PEI door met een micropipet 10 µL van 1% polyethyleen verdund in water in de flowkamer te brengen en dit vijf minuten te laten incuberen.

Was daarna door 200 µL water aan één uiteinde van de kamer in te laten stromen en dit aan het andere uiteinde met een vacuüm op te vangen. Nadat de bacteriën 15 minuten zijn gegroeid in aanwezigheid van cefalexine, worden één mL cellen gecentrifugeerd in een microcentrifuge en opnieuw gesuspendeerd in 200 µL LV met cefalexine. Gebruik vervolgens opnieuw een micropipet aan één uiteinde en een vacuüm aan het andere uiteinde om 50 µL van de geconcentreerde celcultuur in de kamer met het gecoate dekglas te laten stromen en incubeer dit gedurende drie minuten.

Was vervolgens met 50 µL Vel B aangevuld met cefalexine. Om niet-gehechte cellen te verwijderen, wordt de kamer 30 minuten tot één uur bij 37 °C geïncubeerd zodat de gehechte cellen kunnen groeien; plaats de cellen op het optische trapping-instrument terwijl ze incuberen. Bereid polylysine-gecoate beads door drie µL polystyreenbeads met een diameter van 0,5 µm gedurende 30 minuten te incuberen in 0,1% polylysine verdund in water.

Wanneer de incubatie van de beads is voltooid, was deze drie keer door ze te centrifugeren in een microcentrifuge en opnieuw te suspenderen in één milliliter water; ga vervolgens over tot het binden van de beads aan de bacteriën en meet de bindingsstijfheid van de cellen. Het moeilijkste aspect van dit protocol is het kunnen lokaliseren en herkennen van een geschikte cel voor de metingen van de buigstijfheid. Een geschikte cel is een cel met een duidelijk gedefinieerd vastgezet uiteinde en een vrij uiteinde.

Zoek in de doorstroomkamer op de microscoop naar een cel met een duidelijk vastgezet uiteinde. Sommige cellen zijn slechts aan één tip bevestigd, waardoor de buigkracht aan de andere tip ertoe leidt dat de hele cel draait in plaats van buigt. Om een geschikte cel te vinden, buigt u elke cel snel met de trap door gebruik te maken van de joystick-gestuurde beweging van de tafel.

Wanneer een geschikte cel is gevonden, wordt de kraaloplossing twee keer verdund in LB met cefalexine. Voeg 30 µL van de kraaloplossing toe aan de stroomkamer door deze aan één uiteinde te pipetteren en aan het andere uiteinde voorzichtig af te vloeien met een Kimwipe-doekje. Gebruik een optische pincet om een zwevende kraal vast te leggen en breng deze in contact met de vrije tip van een cel. Spoel de kamer opnieuw door met een micropipet en een Kimwipe-doekje met 50 µL cefalexine in LB om niet-gehechte kralen te verwijderen. Voer vervolgens een op maat geschreven LabVIEW-programma uit om buigkrachten op de cel uit te oefenen en registreer de gegevens van de geforceerde verplaatsing.

Kalibreer eerst de respons van de detector door de bevestigde kraal via RA-scanning binnen de detectielaserstraal te bewegen en de 3D PSD-spanningssignalen te registreren. Identificeer vervolgens de lange as van de cel in een microscopiebeeld. Nadat de lange as van de cel is geïdentificeerd, wordt de cel in stappen bewogen in een richting loodrecht op de lange as; registreer tijdens het bewegen van de cel de afgelegde afstand en de verplaatsing van de kraal ten opzichte van het centrum van de optische pincet.

Zet tot slot de verplaatsingswaarden om in uitgeoefende kracht met behulp van de eerder gemeten valstijfheid en sla deze op. De tipverplaatsing en kracht in het bestand zijn verplaatsingsgegevens onder dwang voor een enkele cel. De helling van deze lijn is de buigstijfheid van de cel.

We hebben zojuist aangetoond hoe de buigstijfheid van e coli kan worden gecombineerd met een optische pincet. Bij het gebruik van deze procedure is het belangrijk om een geschikte cel te vinden met een duidelijk gedefinieerd vastgezet uiteinde en een vrij uiteinde. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.