Name: Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer de buigstijfheid meten van E. coli cellen voor celmechanica met behulp van optische vallen. Deze methode helpt onderzoekers de mechanische eigenschappen van bacteriële cellen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen nuttige adviezen uit Mingzhai Zon op binding cellen om oppervlakken. Wij danken Ned Wingreen en Zemer Gitai voor de waardevolle discussies. Dit onderzoek werd ondersteund door National Institutes of Health te verlenen P50GM07150, National Science Foundation LOOPBAAN award PHY-0844466 en de Alfred P. Sloan Foundation.

<ol><li> Grow E. coli cellen in Luria-Beltrani bouillon (LB) medium exponentiële fase (OD = 0.2-0.4). </li><li> Groei van de cultuur in LB aangevuld met 50 ug / ml van cefalexine gedurende 15 min tot filamenteuze groei te induceren, en dan concentreren van de cultuur door 5 keer door centrifugeren. </li><li> Maak PEI-gecoate dekglaasje door stromend 1% polyethyleenimine verdund in water in een flow-kamer, en wassen met water na een 5-minuten incubatie. </li><li> Stromen de geconcentreerde celcultuur in de kamer, en gewassen met een mengsel van LB en cefalexine (50μg/mL) na 3 min tot losse cellen te verwijderen. </li><li> Incubeer de kamer bij 37 ° C gedurende 30 min-1 uur te laten de bijgevoegde cellen groeien voor plaatsing op de optische trapping instrument. </li><li> Maak polylysine-gecoate kralen door incuberen van 0,5 micrometer diameter van polystyreen parels (Bangs Labs) in 0,1% polylysine verdund in water gedurende 30 minuten. Was daarna de kralen 3 keer en resuspendeer in water. </li><li> Verdun de kraal-oplossing met een factor twee in LB met cefalexine (50μg/mL) en voeg deze toe in de stroom kamer. </li><li> Optisch val een drijvende kraal en raak het aan de vrije uiteinde van een cel. (We maken gebruik van een Mad Labs stad piëzo stadium om de controle over de beweging van het monster.) Wanneer een geschikte kraal / cel combinatie is gevonden, was de kamer met cefalexine in LB (50μg/mL) om losse kralen te verwijderen. </li><li> Run op maat geschreven LabView programma om buigkrachten van toepassing op cel-en opnemen van kracht-verplaatsing data. Programma Details <ol class="lalpha"><li> Kalibreer detector reactie van raster het scannen van de bijgevoegde kraal binnen de detectie laserstraal en het opnemen van 3D-PSD spanningssignalen. </li><li> Identificeer cel lange as in de microscoop beeld. </li><li> Bewegen cel in stappen in een richting loodrecht op de cel lange as. </li><li> Noteer de afstand verplaatst en de verplaatsing van de optische val. </li><li> Om te zetten verplaatsing naar toegepaste kracht met behulp van de eerder gemeten val stijfheid en op te slaan tip verplaatsing en kracht om bestand. </li></ol></li></ol> Geheimen van het succes: In stap 8), moet men op zoek naar een cel met een goed gedefinieerde vast te beëindigen. Sommige cellen zijn gewoon vast op een tip, en het buigen kracht zijn op het andere tip leidt tot een whole-cell draaien in plaats van buigen. Een geschikte paar wordt gevonden door het buigen van elke cel snel met de hand behulp van de joystick-gecontroleerde fase beweging. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Deze figuur toont kracht-verplaatsing data voor een enkele cel. De helling van deze lijn is de buigstijfheid van de cel.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

De video productie van dit artikel was gesponsord door Mad Stad Labs, welke instrumenten worden gebruikt in deze studies produceert.

Het protocol hier gepresenteerde is ontworpen om kwantitatief te meten van de buigeigenschappen van bacteriële cellen. Het experiment setup kan worden toegepast op elke staafvormige cel die kan worden ondernomen om filamentously groeien. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze setup om de effecten van het cytoskelet filamenten probe op de buigstijfheid van E. coli-cellen. Deze zelfde techniek kan gebruikt worden om de rol van de druk, celwand stijfheid en andere intracellulaire componenten in het bepalen van de totale buigstijfheid van de cellen te evalueren.

<table><tbody><tr><td>cefalexine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polyethyleenimine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polylysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>polystyreenbolletjes met een diameter van 0.5-&amp;mu;m</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>nanopositioneringssysteem Nano-LP Series</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen met behulp van een optische val

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We hebben een protocol ontwikkeld om de buigstijfheid van draadvormige staafvormige bacteriën te meten. Krachten worden toegepast met een optische val, een microscopisch kleine drie-dimensionale voorjaar gemaakt van licht dat wordt gevormd wanneer een high-intensity laser beam is gericht op een zeer kleine spot met objectieve een microscoop lens. Te buigen van een cel, hebben we eerst binden levende bacteriën om een ​​chemisch behandelde dekglaasje aan. Omdat deze cellen groeien, het midden van de cellen gebonden blijft aan de dekglaasje maar de groeiende uiteinden vrij zijn van deze terughoudendheid. Door het induceren van filamenteuze groei met de drug cefalexine, we zijn in staat om cellen waarin het ene uiteinde van de cel zat vast aan de oppervlakte te identificeren, terwijl de andere kant bleef ongehecht en vatbaar voor buigkrachten. Een buiging kracht wordt dan toegepast met een optische val door binding een polylysine-coated kraal aan het uiteinde van een groeiende cel. Zowel de kracht en de verplaatsing van de kraal worden geregistreerd en de buigstijfheid van de cel is de helling van deze relatie.

We presenteren een protocol voor het buigen van draadvormige bacteriële cellen bevestigd aan een cover-slip oppervlak met een optische val van de cellulaire buigstijfheid te meten.

Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val

We hebben een protocol ontwikkeld om de buigstijfheid van filamenteuze, staafvormige bacteriën te meten. Krachten worden uitgeoefend met een optische pincet, een microscopische ...

Om de buigstijfheid van individuele coli-cellen te bepalen, moeten de bacteriën eerst worden gekweekt tot de exponentiële fase en vervolgens worden gehecht aan het oppervlak van een chemisch behandeld dekglasplaatje. Laat de cellen die reeds aan het oppervlak zijn gehecht verder groeien, zodat ze flexibele uiteinden ontwikkelen. Voer vervolgens diëlektrische kraaltjes in, vang een kraaltje op en buig dit naar de flexibele tip van een cel.De laatste stap van de procedure is het buigen van de cel met de optische pincet en het meten van de resulterende gegevens van de gedwongen verplaatsing. De buigstijfheid van de cel kan worden berekend via een lineaire fit van de gegevens van de gedwongen verplaatsing. Hallo, ik ben Steven Wong van het laboratorium van professor Joshua Shere aan het Louis Sickler Institute of Integrative Genomics en de afdeling Natuurkunde aan de Princeton University.Vandaag laten we u een procedure zien voor het buigen van individuele eco-cellen en het meten van de celstijfheid. We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de bijdragen van verschillende intracellulaire structuren aan de mechanische integriteit van bacteriële cellen te bestuderen. Laten we beginnen.Om deze procedure te starten, worden drie milliliter van willekeurige E. coli cellen in LB-medium gekweekt tot de exponentiële fase. Zodra de cellen een optische dichtheid bij 600 nanometer bereiken van tussen 0,2 en 0,4, wordt de cultuur gedurende 15 minuten aangevuld met 50 microgram per milliliter cefalexine om filamenteuze groei te induceren. Maak tijdens deze 15 minuten een flowkamer.Plak twee stukjes dubbelzijdige tape met een tussenruimte van drie millimeter op een glazen objectglas en plak daar een dekglas bovenop. De ruimte tussen de stukjes tape vormt een kanaal voor de vloeistofstroom. Coat het dekglas met PEI door met een micropipet 10 µL van 1% polyethyleen verdund in water in de flowkamer te brengen en dit vijf minuten te laten incuberen.Was daarna door 200 µL water aan één uiteinde van de kamer in te laten stromen en dit aan het andere uiteinde met een vacuüm op te vangen. Nadat de bacteriën 15 minuten zijn gegroeid in aanwezigheid van cefalexine, worden één mL cellen gecentrifugeerd in een microcentrifuge en opnieuw gesuspendeerd in 200 µL LV met cefalexine. Gebruik vervolgens opnieuw een micropipet aan één uiteinde en een vacuüm aan het andere uiteinde om 50 µL van de geconcentreerde celcultuur in de kamer met het gecoate dekglas te laten stromen en incubeer dit gedurende drie minuten.Was vervolgens met 50 µL Vel B aangevuld met cefalexine. Om niet-gehechte cellen te verwijderen, wordt de kamer 30 minuten tot één uur bij 37 °C geïncubeerd zodat de gehechte cellen kunnen groeien; plaats de cellen op het optische trapping-instrument terwijl ze incuberen. Bereid polylysine-gecoate beads door drie µL polystyreenbeads met een diameter van 0,5 µm gedurende 30 minuten te incuberen in 0,1% polylysine verdund in water.Wanneer de incubatie van de beads is voltooid, was deze drie keer door ze te centrifugeren in een microcentrifuge en opnieuw te suspenderen in één milliliter water; ga vervolgens over tot het binden van de beads aan de bacteriën en meet de bindingsstijfheid van de cellen. Het moeilijkste aspect van dit protocol is het kunnen lokaliseren en herkennen van een geschikte cel voor de metingen van de buigstijfheid. Een geschikte cel is een cel met een duidelijk gedefinieerd vastgezet uiteinde en een vrij uiteinde.Zoek in de doorstroomkamer op de microscoop naar een cel met een duidelijk vastgezet uiteinde. Sommige cellen zijn slechts aan één tip bevestigd, waardoor de buigkracht aan de andere tip ertoe leidt dat de hele cel draait in plaats van buigt. Om een geschikte cel te vinden, buigt u elke cel snel met de trap door gebruik te maken van de joystick-gestuurde beweging van de tafel.Wanneer een geschikte cel is gevonden, wordt de kraaloplossing twee keer verdund in LB met cefalexine. Voeg 30 µL van de kraaloplossing toe aan de stroomkamer door deze aan één uiteinde te pipetteren en aan het andere uiteinde voorzichtig af te vloeien met een Kimwipe-doekje. Gebruik een optische pincet om een zwevende kraal vast te leggen en breng deze in contact met de vrije tip van een cel. Spoel de kamer opnieuw door met een micropipet en een Kimwipe-doekje met 50 µL cefalexine in LB om niet-gehechte kralen te verwijderen. Voer vervolgens een op maat geschreven LabVIEW-programma uit om buigkrachten op de cel uit te oefenen en registreer de gegevens van de geforceerde verplaatsing.Kalibreer eerst de respons van de detector door de bevestigde kraal via RA-scanning binnen de detectielaserstraal te bewegen en de 3D PSD-spanningssignalen te registreren. Identificeer vervolgens de lange as van de cel in een microscopiebeeld. Nadat de lange as van de cel is geïdentificeerd, wordt de cel in stappen bewogen in een richting loodrecht op de lange as; registreer tijdens het bewegen van de cel de afgelegde afstand en de verplaatsing van de kraal ten opzichte van het centrum van de optische pincet.Zet tot slot de verplaatsingswaarden om in uitgeoefende kracht met behulp van de eerder gemeten valstijfheid en sla deze op. De tipverplaatsing en kracht in het bestand zijn verplaatsingsgegevens onder dwang voor een enkele cel. De helling van deze lijn is de buigstijfheid van de cel.We hebben zojuist aangetoond hoe de buigstijfheid van e coli kan worden gecombineerd met een optische pincet. Bij het gebruik van deze procedure is het belangrijk om een geschikte cel te vinden met een duidelijk gedefinieerd vastgezet uiteinde en een vrij uiteinde. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

measuring-bending-stiffness-bacterial-cells-using-an-optical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Er wordt een methode beschreven om levende pathogenen individueel te selecteren, te manipuleren en te beelden met behulp van een optische pincet gekoppeld aan een spinning disk-microscoop. De optische pincet biedt ruimtelijke en temporele controle over de organismen en plaatst deze naast gastheercellen. Fluorescentiemicroscopie legt dynamische intercellulaire interacties vast met minimale verstoring van de cellen.

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Een protocol voor het lanceren en stabiel vasthouden van geselecteerde diëlektrische microdeeltjes in de lucht wordt gepresenteerd.

Optische val Laden van diëlektrische micropartikels in Air

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Presenteren we een installatie van optisch pincet gekoppeld aan een lichte blad Microscoop, en de uitvoering daarvan om te sonderen cel mechanica zonder kralen in de Drosophila embryo.

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Hier wordt een geïntegreerd protocol op basis van een optisch pincet en defocusmicroscopie beschreven om de reologische eigenschappen van cellen te meten. Dit protocol is breed toepasbaar bij het bestuderen van de visco-elastische eigenschappen van erytrocyten onder variabele fysio-pathologische omstandigheden.

Kwantitatieve analyse van visco-elastische eigenschappen van rode bloedcellen met behulp van een optisch pincet en onscherpe microscopie

Vorming van actomyosinebundels in vitro en het meten van myosine ensemblekrachtgeneratie met behulp van een optisch pincet wordt gepresenteerd en besproken.

Myosine Ensemble Mechanics onderzoeken in Actin Filament Bundles met behulp van optische pincetten

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Visuele, single-molecule biochemie bestudeerd door microfluïdische kamers wordt aanzienlijk vergemakkelijkt met behulp van glazen vaten, gasdichte spuiten, stabiele verbindingen van slangen met stroomcellen en eliminatie van bellen door schakelkleppen tussen de spuiten en slangen te plaatsen. Het protocol beschrijft dubbele optische vallen die visualisatie van DNA-transacties en intermoleculaire interacties mogelijk maken.

Gebruik van dual optische pincet en microfluïdica voor single-molecule studies

Leer de buigstijfheid meten van E. coli cellen voor celmechanica met behulp van optische vallen. Deze methode helpt onderzoekers de mechanische eigenschappen van bacteriële cellen te begrijpen.

Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val

Meer video's verkennen