Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val
April 26th, 2010
We presenteren een protocol voor het buigen van draadvormige bacteriële cellen bevestigd aan een cover-slip oppervlak met een optische val van de cellulaire buigstijfheid te meten.
Om de buigstijfheid van individuele coli-cellen te bepalen, kweekt u eerst de bacteriën tot de exponentiële fase en bevestigt u ze vervolgens aan een chemisch behandelde dekglasoppervlak. Laat de cellen die zich al aan het oppervlak hebben gehecht verder groeien, zodat ze flexibele uiteinden ontwikkelen. Stroom vervolgens diëlektrische kralen in, vang een kraal en buig deze naar de flexibele punt van een cel.
De laatste stap van de procedure is om de cel met de optische val te buigen en de resulterende geforceerde verplaatsingsgegevens te meten. De buigstijfheid van de cel kan worden berekend door een lineaire pas aan de geforceerde verplaatsingsgegevens. Hoi, ik ben Steven Wong van het Lab van Professor Joshua Shere in het Louis Sickler Institute of Integrative Genomics en het Department of Physics aan de Princeton University.
Vandaag laten we je in een procedure zien van het buigen van individuele eco-cellen en het meten van de celstijfheid. We gebruiken deze procedure in ons lab om de bijdragen van verschillende intracellulaire structuren aan de mechanische integriteit van de bacteriecellen te bestuderen. Dus laten we beginnen.
Om deze procedure te starten, kweekt u drie milliliter van e coli-cellen in LB-medium tot de exponentiële fase. Zodra de cellen een optische dichtheid van 600 nanometer tussen 0,2 en 0,4 bereiken, voegt u de cultuur aan met 50 microgram per milliliter cefalexine gedurende 15 minuten om filamenteuze groei te induceren. Maak gedurende deze 15 minuten een stroomkamer.
Bevestig twee stukken dubbelzijdig plakband met een opening van drie millimeter tussen de stukken op een glasplaat en bevestig een dekglas bovenop. De opening tussen de stukken tape creëert een kanaal voor vloeistofstroming. Bedek het dekglas met PEI door 10 microliter 1% polyethaline verdund in water met een micropipet in de stroomkamer te laten stromen en vijf minuten te incuberen.
Spoel vervolgens door 200 microliter water aan het ene uiteinde van de kamer te laten stromen en aan het andere uiteinde te verzamelen met een vacuüm. Na 15 minuten groei van de bacteriën in aanwezigheid van cefalexine, centrifugeert u één milliliter cellen in een microcentrifuge en suspendeert u deze opnieuw in 200 microliter LV met cefalexine. Gebruik vervolgens opnieuw een micropipet aan het ene uiteinde en een vacuüm aan het andere uiteinde om 50 microliter van de geconcentreerde cellencultuur in de kamer met het gecoate dekglas te laten stromen en drie minuten te incuberen.
Spoel vervolgens met 50 microliter Vel B aangevuld met cefalexine. Om niet-bevestigde cellen te verwijderen, incubeer de kamer gedurende 30 minuten tot een uur op 37 graden Celsius om de bevestigde cellen te laten groeien voordat u ze op het optische vangbeugelinstrument plaatst terwijl de cellen incuberen. Bereid polylysine gecoate kralen voor door drie microliter 0,5 micrometer diameter polystyreenkralen in een van 0,1% Polylysine verdund in water gedurende 30 minuten te incuberen.
Wanneer de kralen klaar zijn met incuberen, spoelt u ze drie keer door ze in een microcentrifuge te centrifugeren en ze opnieuw te suspenderen in een milliliter water, gaat u door met het binden van de kralen aan de bacteriën en het meten van de bindingsstijfheid van de cellen. Het moeilijkste aspect van dit protocol is het kunnen vinden, lokaliseren en herkennen van een goede cel voor de metingen van buiging, stijfheid. En een goede cel is er een met een goed gedefinieerde vastzittende en vrije eindpunt.
Zoek in de stroomkamer op de microscoop naar een cel met een goed gedefinieerde vastzittende eind. Sommige cellen zijn alleen aan een punt bevestigd, en de buigkracht aan de andere kant zorgt ervoor dat de hele cel draait in plaats van buigt. Om een geschikte cel te vinden, buigt u elke cel snel met de val door de joystick-gestuurde trapbeweging te gebruiken.
Wanneer een geschikte cel is gevonden, verdunt u de kralenoplossing met een factor twee in lb met cefalexine, voegt u 30 microliter van de kralenoplossing toe aan de stroomkamer door met een pipet in één uiteinde te pipetteren en voorzichtig uit te laten stromen aan het andere uiteinde met een Kim doekje en vang een zwevende kraal optisch op en breng deze in contact met het vrije uiteinde van een cel. Spoel de kamer opnieuw door micropipet en gebruik een Kim wit doekje met 50 microliter cefalexine in LB om niet-bevestigde kralen te verwijderen. Voer vervolgens een op maat geschreven labview-programma uit om buigkrachten op de cel toe te passen en de geforceerde verplaatsingsgegevens op te nemen.
Calibreer eerst de detectorrespons door de aangehechte kraal binnen de detectielaserstraal RA te scannen en de 3D PSD-spanningssignalen op te nemen. Identificeer vervolgens de lange as van de cel in een microscoopbeeld. Nadat de lange cel-as is geïdentificeerd, verplaatst u de cel in stappen in een richting loodrecht op de lange as terwijl u de cel opneemt, de afgelegde afstand en de verplaatsing van de kraal vanuit het centrum van de optische val.
Ten slotte zet u de verplaatsingswaarden om in toegepaste kracht met behulp van de eerder gemeten valstijfheid en slaat u deze op. De uiteindverplaatsing en kracht naar bestand hier zijn geforceerde verplaatsingsgegevens voor een enkele cel. De helling van deze lijn is de buigstijfheid van de cel.
We hebben je zojuist laten zien hoe je de buigstijfheid van e coli kunt meten met een optische val. Bij het gebruik van deze procedure is het belangrijk om een goede cel te vinden met een goed gedefinieerde vastzittende en vrije eind. Dus dat is het.
Bedankt voor het kijken en veel succes met je experimenten.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het meten van de buigstevigheid van filamenteuze bacteriecellen met behulp van optische vangtechnieken. De methode omvat het kweken van E. coli-cellen, het bevestigen ervan aan een dekglas en het toepassen van buigkrachten om hun mechanische eigenschappen te beoordelen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Biofysica
- Celmechanica
Achtergrond
- Het begrijpen van de mechanische eigenschappen van bacteriecellen is cruciaal voor inzichten in hun gedrag en integriteit.
- Filamenteuze groei van E. coli kan worden geïnduceerd om hun buigstijfheid te bestuderen.
- Optische vallen bieden een niet-invasieve methode om krachten op individuele cellen uit te oefenen.
- Eerdere studies hebben zich gericht op de mechanische integriteit van cellen onder verschillende omstandigheden.
Doel van het Onderzoek
- Om een betrouwbaar protocol te ontwikkelen voor het meten van de buigstevigheid van E. coli-cellen.
- Om de bijdragen van intracellulaire structuren aan celmechanica te onderzoeken.
- Om het begrip van bacterieel celgedrag onder mechanische stress te verbeteren.
Gebruikte Methoden
- Kweek E. coli-cellen in LB-medium tot exponentiële fase.
- Induceer filamenteuze groei met behulp van cephalexine.
- Bevestig cellen aan een chemisch behandeld dekglas.
- Gebruik optische vallen om buigkrachten toe te passen en verplaatsingsgegevens te meten.
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol meet succesvol de buigstevigheid van individuele E. coli-cellen.
- Gegevensanalyse onthult de relatie tussen toegepaste kracht en celverplaatsing.
- Het identificeren van geschikte cellen voor meting is cruciaal voor nauwkeurige resultaten.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van bacteriële celmechanica.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor het bestuderen van de mechanische eigenschappen van bacteriecellen.
- Optische vangtechniek is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van celstijfheid.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om andere aspecten van celmechanica te verkennen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
